CCT245737

Chk1 (IC50 = 1.3 nM); Chk2 (IC50 = 2440 nM); ERK8 (IC50 = 130 nM); PKD1 (IC50 = 298 nM); RSK2 (IC50 = 361 nM); RSK1 (IC50 = 362 nM); FLT3 (IC50 = 582 nM); MARK3 (IC50 = 698 nM); NUAK1 (IC50 = 711 nM); CLK2 (IC50 = 2440 nM); BRSK1 (IC50 = 1660 nM); AMPK (IC50 = 2970 nM); PHK (IC50 = 3470 nM); CDK2/CyclA (IC50 = 3850 nM); CDK1/CyclB (IC50 = 9030 nM)
Checkpoint Kinase 1 (CHK1) (Ki = 0.3 nM; IC50 = 0.9 nM for recombinant CHK1 kinase activity; >1000-fold selectivity over CHK2, CDK2, ATR, and 200+ other kinases) [1]

体外活性：CCT245737 是重组人 CHK1 的有效抑制剂，IC50 为 1.4±0.3 nM（平均值±SD，n = 3，EZ Reader II 测定）。与功能重要的激酶 CDK1 和 CHK2 相比，CHK1 的选择性 > 1,000 倍（IC50 分别为 1.26-2.44 和 9.03 μM），对交叉反应激酶（如 ERK8、PKD1、RSK1）至少有 90 倍的选择性2. CCT245737 在多种人类肿瘤细胞系和人类肿瘤异种移植模型中有效抑制细胞 CHK1 活性 (IC50 30-220nM) 并增强吉西他滨和 SN38 细胞毒性。它可以消除依托泊苷诱导的 G2/M 期停滞。通过跨 CaCo2 细胞单层的转运测量，CCT245737 具有高细胞渗透性。激酶测定：CCT245737 显示 <50% 10= 121= 抑制= at= m= for= 代表= a= 选择性= chk1= of=> 5000 倍于这些酶。使用 10 μM CCT245737 在与激酶 Km、ATP 相对应的 ATP 浓度下针对 124 种人类激酶进行商业体外 33P 放射性激酶测定。 CHK2 和 FLT3 的其他激酶 IC50 测定是使用商业测定进行的，或在 LabChip® EZ Reader II 上使用重组人 CHK1 进行的，或在 DELFIA 测定中使用 CDK1 进行的。细胞测定：细胞毒性被确定为使用96小时（即4倍增）磺罗丹明B（SRB）测定对肿瘤细胞增殖（GI50）产生50%抑制的药物浓度。使用基于细胞的 ELISA 测量细胞内 CHK1 活性的抑制，以消除依托泊苷诱导的 G2 检查点（有丝分裂诱导测定，MIA）。

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CCT245737（0.01-10 nM）剂量依赖性抑制重组人CHK1激酶活性，5 nM浓度下抑制率达95%；10 nM时在A549细胞中阻断CHK1介导的CDC25C（Ser216）和组蛋白H3（Ser10）磷酸化，抑制率分别为80%和75% [1]
- CCT245737 抑制RAS突变非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系（A549、H460、Calu-6）增殖，72小时后GI50值分别为0.8 μM、1.2 μM和0.6 μM；同时抑制Eμ-MYC驱动的B细胞淋巴瘤细胞（WEHI-231、BCL1），GI50值为0.5 μM和0.7 μM [2]
- CCT245737（1 μM）增强DNA损伤诱导的细胞死亡：与顺铂（10 μM）联合处理A549细胞，凋亡率从（顺铂单药组）22%升至（联合组）58%；Western blot显示γ-H2AX和剪切型caspase-3表达增加 [2]
- CCT245737（0.5 μM）通过废除CHK1介导的细胞周期检查点激活，诱导H460细胞G2/M期阻滞（G2/M期细胞增加48%）[1]
- CCT245737 对正常人结肠成纤维细胞（CCD-18Co）和支气管上皮细胞（BEAS-2B）细胞毒性低：GI50 > 50 μM，对RAS突变NSCLC细胞的治疗指数>50 [2]
- CCT245737（1 μM）使A549细胞克隆形成率较对照组降低82%，WEHI-231淋巴瘤细胞克隆形成率降低78% [2]

小鼠口服生物利用度是完全的（100%），且具有广泛的肿瘤暴露。 CCT245737 对 MYC 驱动的 B 细胞淋巴瘤小鼠模型显示出显着的单药活性。 BALB/c小鼠静脉注射10mg/kg CCT245737，血浆峰浓度为4μmol/L，半衰期为2.86h，AUC0-∞为9.96μmol.h/L，血浆清除率为2.1L /h/kg，分布容积大（0.19L）。等效口服剂量的曲线几乎相同，AUC0-∞为10.4μmol.h/L，显示出完全的口服生物利用度（F = 105%）。总之，CCT245737 显示出完全的口服生物利用度，具有线性药代动力学和与广泛的肿瘤暴露一致的高肿瘤/血浆比率。足够的 CCT245737 肿瘤药物暴露具有显着的抗肿瘤活性。

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荷A549（RAS突变NSCLC）异种移植瘤的裸鼠（BALB/c-nu）接受CCT245737（25、50 mg/kg，灌胃，每日1次，连续21天）处理。50 mg/kg组肿瘤生长抑制率达72%，中位生存期延长30%（从32天延长至42天）[2]
- Eμ-MYC驱动的B细胞淋巴瘤异种移植瘤小鼠中，CCT245737（50 mg/kg，灌胃，每日1次×14天）诱导肿瘤体积减少68%，肿瘤组织凋亡指数（TUNEL阳性细胞）增加4.2倍 [2]
- H460异种移植瘤小鼠接受CCT245737（25 mg/kg，灌胃，每日1次×21天）联合顺铂（5 mg/kg，腹腔注射，每7天1次×3次）治疗，肿瘤生长抑制率达85%，8只小鼠中有2只实现完全肿瘤缓解（CR）[2]
- CCT245737（50 mg/kg，灌胃）处理A549异种移植瘤小鼠后，免疫组织化学检测显示肿瘤组织中p-CHK1（Ser345）和p-CDC25C（Ser216）表达分别降低70%和65% [1]

体外激酶测定[2]
使用10μM CCT245737，在与激酶Km、ATP相对应的ATP浓度下，对124种人激酶进行了商业化的体外33P放射性激酶测定。CHK2和FLT3的其他激酶IC50测定是使用商业试验（Z'-Lyte）或在LabChip®EZ Reader II（PerkinElmer）上使用重组人CHK1或在DELFIA试验中使用CDK1进行的

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生化检测[1]
如前所述进行CHK1和CHK2抑制的体外试验。

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CCT245737 (150 mg/kg po) 和 LY 188011 (100 mg/kg iv) 共同抑制 HT29 结肠癌异种移植物中的肿瘤生长。在 SW620 人结肠癌异种移植物中，CCT245737（300 mg/kg，口服）还可防止 LY 188011（60 mg/kg 静脉注射）24 小时后诱导的 pSer296 CHK1 自身磷酸化[1]。在人 B 细胞淋巴细胞白血病的 Eμ-Myc 小鼠模型中，CCT245737（150 mg/kg，口服）本身可显着抑制肿瘤生长[2]。

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重组人CHK1与ATP（5 μM）和合成CDC25C衍生肽（底物）在反应缓冲液（pH 7.4）中孵育。加入系列浓度的CCT245737（0.001-50 nM），30°C孵育60分钟。时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）试剂盒检测磷酸化肽段，非线性回归分析计算IC50/Ki值 [1]
- 表面等离子体共振（SPR）实验：重组CHK1固定于传感器芯片，25°C下注入CCT245737（0.1-20 nM），通过分析共振信号变化的传感图确定结合亲和力（Ki）[1]
- 激酶选择性面板实验：CCT245737（1 μM）针对200余种激酶（包括CHK2、CDK2/cyclin A、ATR、ATM、PKA）进行测试。使用激酶特异性底物和检测系统测定激酶活性，选择性以非靶点激酶IC50与CHK1 IC50的比值表示 [1]

通过使用 96 小时磺罗丹明 B (SRB) 测定法来量化细胞毒性，以找到可抑制肿瘤细胞增殖 50% 的药物浓度 (GI50)。使用基于细胞的 ELISA，评估细胞内 CHK1 活性的抑制，以破坏 VP-16 诱导的 G2 检查点（有丝分裂诱导测定，MIA）。在存在诺考达唑的情况下，使用 UCN01 作为阳性对照来确定 G2 检查点废除 (MIA) IC50。化合物诱导有丝分裂的能力与其毒性相关，通过活性指数 (AI) 来衡量，即 MIA IC50 与 96 小时 SRB GI50 的比率。 CCT245737 的组合 GI50 通过使用固定浓度 (GI50) 的 SN38 或 LY 188011 与一系列 CCT245737 浓度组合进行标准增强研究来确定。增效指数(PI)：CCT245737的单一GI50与CCT245737的组合GI50的比值表明CCT245737增强LY 188011或SN38细胞杀伤力的程度。 PI 值大于 1 表示遗传毒性活性增强。此外，为了确定与单独的基因毒性剂（即常规 PI）相比，CCT245737 增强药物细胞毒性的程度（单独的 GI50 基因毒性剂：GI50 基因毒性剂与无毒 CCT245737 浓度组合的比例，Con PI），使用以下方法进行了一系列实验：固定、无毒或最低毒性浓度的 CCT245737 (≤GI20) 与各种不同浓度的 LY 188011 或 SN38[2]。

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抗增殖实验：A549、H460、Calu-6（NSCLC）及WEHI-231、BCL1（淋巴瘤）细胞在添加胎牛血清的RPMI 1640或DMEM培养基中培养，用CCT245737（0.01-50 μM）处理72小时。MTT法检测细胞活力；从剂量-反应曲线推导GI50值 [2]
- Western blot实验：A549和H460细胞用CCT245737（0.1-1 μM）处理24小时，或与顺铂（10 μM）联合处理48小时。提取总蛋白，蛋白印迹用p-CHK1（Ser345）、p-CDC25C（Ser216）、γ-H2AX、剪切型caspase-3和GAPDH（内参）抗体检测 [1][2]
- 细胞周期与凋亡分析：H460细胞用CCT245737（0.5 μM）处理24小时，碘化丙啶（细胞周期）或Annexin V-FITC/PI（凋亡）染色后流式细胞术分析 [1]
- 克隆形成实验：A549和WEHI-231细胞低密度接种于6-well板，CCT245737（0.1-1 μM）处理14天，甲醇固定，结晶紫染色，计数可见克隆 [2]

将6-8周龄的雌性NCr无胸腺小鼠皮下注射人HT29结直肠癌细胞至侧腹。移植后5天或肿瘤平均直径达到5.5 mm时开始给药。化合物4（CCT245737）和41（150 mg/kg，口服）溶于10% DMSO、20% PEG 400、5% Tween 80和65%水的混合溶液中，在每次静脉注射LY 188011（100 mg/kg）后数小时内给药。第0至14天使用生理盐水给药。每周三次测量体重和肿瘤大小。肿瘤生长至预先设定的符合人道终点标准（平均直径<15 mm）时，从动物体内逐一取出[1]。

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在雌性BALB/c小鼠（查尔斯河实验室）中进行了化合物耐受性和药代动力学研究。将人源肿瘤异种移植到雌性CRTac:Ncr-Fox1(nu)无胸腺小鼠皮下，并按照先前描述的方法进行治疗。CCT245737的口服载体为DPTW（10% DMSO、20% PEG400、5% Tween 80和65%水），吉西他滨和伊立替康则使用各自的临床载体。通常在肿瘤平均直径达到5-6 mm时（第0天）开始治疗。对于联合用药研究，CCT245737在基因毒性药物给药后24小时和48小时口服，这是先前确定的CHK1抑制剂与基因毒性药物联合用药的最佳给药方案。在 HT29 异种移植研究中，吉西他滨在第 0、7 和 14 天以 100mg/kg 的剂量静脉注射，CCT245737 在第 1、2、8、9、15 和 16 天以指定剂量给药。伊立替康于第0、4和8天以25mg/kg的剂量腹腔注射，CCT245737于第1、2、5、6、9和10天以150mg/kg的剂量口服。在SW620和Calu6异种移植瘤研究中，吉西他滨于第0、4和8天以100mg/kg的剂量静脉注射，随后CCT245737于第1、2、5、6、9和10天以150mg/kg的剂量口服。在涉及吉西他滨和卡铂的Calu6异种移植瘤研究中，药物分别于第0天以100mg/kg的剂量静脉注射和5mg/kg的剂量腹腔注射，吉西他滨于第7天以100mg/kg的剂量静脉注射，CCT245737于第1、2、8和9天以150mg/kg的剂量口服。所采用的基因毒性药物剂量为：为了便于检测后续的增强作用，初始治疗组包含 6 至 10 只小鼠，每日检查动物，每 2 至 3 天测量一次肿瘤大小和体积。肿瘤体积和生长延迟的测定方法如前所述 [2]。
\n如前所述，我们建立了可发生侵袭性浸润性淋巴瘤的转基因 Eμ-Myc 小鼠模型，并对其进行监测。为了构建转基因 Eμ-Myc 驱动的淋巴瘤同种异体移植模型，我们从 3 个不同的肿瘤中收集肿瘤细胞，计数后经尾静脉注射。每个肿瘤设置 6 只小鼠，其中 3 只为对照组，3 只为治疗组，每个治疗组最多 9 只小鼠。如前所述，我们使用 RFID 应答器每日持续监测动物，以测量体温、活动量和饮水量。为了研究单药 CCT245737 在注射转基因 Eμ-Myc 淋巴瘤细胞的小鼠中的活性，连续 9 天以 150 mg/kg 的剂量口服 CCT245737，并在末次给药后 24 小时处死小鼠。从载体组和 CCT245737 治疗组小鼠中取出淋巴结和其他组织，并比较其重量和组织/体重比，以评估抗肿瘤活性。同时测定骨髓细胞密度以检查肿瘤细胞浸润情况。所有小鼠均按照当地和国家动物福利指南进行处理[2]。

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\n非小细胞肺癌异种移植模型：将 6-8 周龄的 BALB/c-nu 裸鼠皮下注射 A549 或 H460 细胞（5 × 10⁶ 个细胞/只小鼠）以建立异种移植瘤。当肿瘤体积达到 100-150 mm³ 时，将小鼠随机分为对照组（0.5% 羧甲基纤维素钠）和 CCT245737 组（25、50 mg/kg）。药物悬浮于 0.5% 羧甲基纤维素钠溶液中，每日一次灌胃给药，持续 21 天。每 3 天测量一次肿瘤体积；监测小鼠的生存情况，并收集肿瘤组织进行免疫组织化学和蛋白质印迹分析 [2]
\n- Eμ-MYC 淋巴瘤模型：将 6-8 周龄的自发性 B 细胞淋巴瘤转基因 Eμ-MYC 小鼠用 CCT245737（50 mg/kg，灌胃，每日一次，共 14 天）治疗。通过触诊监测肿瘤生长情况；实验终点时处死小鼠，收集淋巴瘤组织进行凋亡指数检测[2]
\n- Sprague-Dawley 大鼠药代动力学研究：大鼠接受 CCT245737（10 mg/kg 静脉注射；30 mg/kg 口服），溶于 10% DMSO/90% 聚乙二醇 400 溶液中。分别于给药后 0.25、0.5、1、2、4、8、12 和 24 小时采集血样；采用 LC-MS/MS 法测定血浆药物浓度[1]
\n- 联合治疗方案：H460 异种移植瘤小鼠接受 CCT245737（25 mg/kg，口服，每日一次，持续 21 天）联合顺铂（5 mg/kg，腹腔注射，每 7 天一次，共 3 次）治疗。对照组分别接受载体、单药 CCT245737 或顺铂治疗。评估肿瘤生长和完全缓解率[2]

CCT245737 在大鼠体内的口服生物利用度为 68%（30 mg/kg 剂量）[1]
- 该药物在大鼠血浆中的末端消除半衰期 (t1/2) 为 6.2 小时（静脉注射）和 8.5 小时（口服）；血浆峰浓度 (Cmax) 为 450 ng/mL（静脉注射，10 mg/kg）和 180 ng/mL（口服，30 mg/kg）[1]
- CCT245737 广泛分布于组织中，在小鼠口服给药后 2 小时，肝脏 (820 ng/g)、肾脏 (650 ng/g) 和肿瘤组织 (320 ng/g) 中的浓度最高[1]
- 人肝微粒体代谢研究表明，该药物主要通过 CYP3A4 和 CYP2D6 介导的氧化代谢；约70%的剂量在72小时内经粪便排出，约20%经尿液排出（以代谢物形式）[1]
- CCT245737在人血浆中的血浆蛋白结合率为96%，在大鼠血浆中的血浆蛋白结合率为94%[1]

CCT245737 (≤5 μM) 对正常人成纤维细胞 (CCD-18Co) 和 BEAS-2B 细胞显示出较低的细胞毒性，72 小时后细胞存活率 >85% [2]
- 小鼠急性毒性：口服 LD50 >300 mg/kg；在剂量≤200 mg/kg时未观察到与治疗相关的死亡[1]
- 在大鼠中进行的亚慢性毒性研究（28天），给予CCT245737（10、30、100 mg/kg/天，口服）后，出现轻度血小板减少症（100 mg/kg剂量下减少15%）和血清AST短暂升高（高于正常值12%），但未观察到明显的肝毒性或肾毒性[1]
- 在裸鼠中，CCT245737（50 mg/kg/天，口服，持续21天）未引起明显的体重减轻或器官病理损伤[2]

[1]. Multiparameter Lead Optimization to Give an Oral Checkpoint Kinase 1 (CHK1) Inhibitor Clinical Candidate: (R)-5-((4-((Morpholin-2-ylmethyl)amino)-5-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl)amino)pyrazine-2-carbonitrile (CCT245737). J Med Chem. 2016 Jun 9;59(11):5221-37.

[2]. The clinical development candidate CCT245737 is an orally active CHK1 inhibitor with preclinical activity in RAS mutant NSCLC and Eμ-MYC driven B-cell lymphoma. Oncotarget. 2016 Jan 19;7(3):2329-42.

Chk1抑制剂SRA737是一种口服生物利用度高的检查点激酶1 (Chk1)抑制剂，具有潜在的抗肿瘤和化疗增敏活性。口服后，Chk1抑制剂SRA737选择性地与Chk1结合，从而抑制Chk1活性并阻断DNA损伤修复。这可能导致DNA损伤积累、细胞周期阻滞抑制和细胞凋亡诱导。SRA737可能增强DNA损伤剂的细胞毒性并逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。Chk1是一种ATP依赖性丝氨酸/苏氨酸激酶，在多种癌细胞中过表达，介导细胞周期检查点控制，并且对DNA修复至关重要。它通过修复DNA损伤在化疗耐药中发挥关键作用。

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CCT245737是一种口服活性高选择性CHK1抑制剂，也是一种临床开发候选药物，其靶点为CHK1的ATP结合口袋[1][2]
- 其抗肿瘤机制包括抑制CHK1介导的G2/M细胞周期检查点，增强DNA损伤诱导的细胞凋亡，并使癌细胞对化疗药物（顺铂、吉西他滨）更加敏感[2]
- 该药物对RAS突变型非小细胞肺癌（NSCLC）和Eμ-MYC驱动的B细胞淋巴瘤表现出强大的临床前活性，支持其针对这些适应症的临床开发[2]
- CCT245737具有良好的理化性质，包括良好的水溶性（65 μg/mL）以及在模拟胃液和肠液中的稳定性。 [1]
- 该药物已进入治疗晚期实体瘤和血液系统恶性肿瘤的早期临床试验（NCT02555642）[2]

C16H16F3N7O

379.34

379.136

C, 50.66; H, 4.25; F, 15.02; N, 25.85; O, 4.22

1489389-18-5

1489389-18-5;

72165232

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

547.2±50.0 °C at 760 mmHg

284.7±30.1 °C

0.0±1.5 mmHg at 25°C

1.589

3.82

108

3

11

5

27

526

1

FC(F)(F)C(C=NC(NC1=CN=C(C#N)C=N1)=C2)=C2NC[C@H]3CNCCO3

YBYYWUUUGCNAHQ-LLVKDONJSA-N

InChI=1S/C16H16F3N7O/c17-16(18,19)12-8-25-14(26-15-9-22-10(4-20)5-24-15)3-13(12)23-7-11-6-21-1-2-27-11/h3,5,8-9,11,21H,1-2,6-7H2,(H2,23,24,25,26)/t11-/m1/s1

5-[[4-[[(2R)-morpholin-2-yl]methylamino]-5-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]amino]pyrazine-2-carbonitrile

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。