CHIR-124

Chk1 (IC50 = 0.3 nM); Chk2 (IC50 = 697.4 nM); PDGFR (IC50 = 6.6 nM); FLT3 (IC50 = 5.8 nM); Cdk4/cyclin D (IC50 = 2.05 μM); CDC2/cyclin B (IC50 = 0.5057 μM); Cdk2/cyclin A (IC50 = 0.1911 μM); bFGFR (IC50 = 2.01 μM); FGFR3 (IC50 = 1.29 μM); VEGFR2 FLK1 (IC50 = 0.5779 μM); VEGFR1 FLT1 (IC50 = 0.4636 μM); PKCα (IC50 = 0.58 μM); PKAβ I (IC50 = 2.25 μM); PKCβ II (IC50 = 0.58 μM); PKCγ (IC50 = 0.11 μM); ERK2 (IC50 = 4.31 μM); PKA (IC50 = 0.1031 μM); GSK3 (IC50 = 0.0233 μM)
CHIR-124 targets checkpoint kinase 1 (Chk1) with an IC50 value of 0.3 nM and a Ki value of 0.7 nM in recombinant kinase assays [1]
CHIR-124 inhibits checkpoint kinase 2 (Chk2) with an IC50 value of 4 nM and a Ki value of 8 nM, showing ~13-fold selectivity for Chk1 over Chk2 [1]
CHIR-124 exhibits minimal inhibition of other kinases (ATM, ATR, CDK1, Aurora A) with IC50 values > 1 μM [1]

CHIR-124 是一种基于喹诺酮的小分子，其结构与其他已知的 Chk1 抑制剂无关。 CHIR-124 与拓扑异构酶毒物（例如喜树碱或 SN-38）协同相互作用，导致多种癌细胞系生长抑制，包括乳腺癌（MDA-MB-231 和 MDA-MB-435）和结肠癌（SW） -620和Colo205)，它们都含有突变的p53基因。 CHIR-124 废除 SN-38 诱导的 S 和 G2-M 检查点并增强 MDA-MD-435 乳腺癌细胞的凋亡。 p53 的缺失增强了 CHIR-124 对 G2-M 检查点的废除和细胞凋亡的诱导。 CHIR-124 还有效靶向其他激酶，例如 PDGFR 和 Flt3，IC50 分别为 6.6 nM 和 5.8 nM。激酶测定：对于 Chk1 测定，激酶结构域在 Sf9 昆虫细胞中表达，并且含有共有 Chk1/Chk2 磷酸化位点 ()（生物素-[AHX]SGSGSGLYRSPSMP-ENLNRPR[CONH2]）的生物素化 cdc25c 肽是用作基材。将 CHIR-124 系列稀释液与激酶反应缓冲液混合，最终浓度为 30 mM Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM MgCl2、2 mM DTT、4 mM EDTA、25 mMβ-甘油磷酸盐、5 mM MnCl2、 0.01% 牛血清白蛋白、1.35 nM CHK1 激酶结构域、0.5 μM 肽底物和 1 AM 未标记 ATP，加上 5 nM 33Pγ 标记 ATP（比活性 = 2,000 Ci/mmol）。磷酸盐转移的反应和检测是通过放射性方法进行的。反应在室温下孵育 1 至 4 小时，磷酸化肽被捕获在含有终止反应缓冲液（25 mM EDTA [乙二胺四乙酸]，50 mMHEPES，pH 7.5）的链霉亲和素包被的微量滴定板上。磷酸化肽通过 DELFIA TRF 系统使用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体 PT66 进行测量。 CHIR-124 的 IC50 浓度是使用 XL-Fit 数据分析软件的非线性回归计算得出的。细胞测定：将处于对数期的 MDA-MB-231、MDA-MB-435、SW-620 和 COLO 205 细胞接种到 96 孔微孔板中。 CHIR-124 在六种不同浓度的喜树碱或 0 nM 喜树碱存在下进行连续稀释。在没有 CHIR-124 的情况下，喜树碱也被连续稀释。将 CHIR-124 添加到 96 孔培养皿中的细胞中，并在 37 °C 下孵育 48 小时。每个处理条件一式三份进行。通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑(MTS)内盐测定监测细胞增殖。将 MTS 内盐添加到微孔板中，再孵育 3 小时，并在读板器上读取 490 nm 处的吸光度。绘制产生 50% 抑制所需的组合中每种药物的浓度以生成等值线。药物相互作用的等效线图分析基于 Loewe 加和性方程 (1= DA /IC50, A + DB/IC50, B)，其中 IC50、A 和 IC50, B 是每种药物产生 50% 抑制的药物浓度单独使用时，DA 和 DB 是组合中每种药物产生 50% 总体抑制的浓度。每张图中都包含一条表示 Loewe 可加性的对角线。落在该线下方的数据点表示协同作用，而落在该线上方的数据点则表示拮抗作用。

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在多种人类实体瘤细胞系（HCT116、HT29、A549、MCF-7、PC3）中，CHIR-124 表现出抗增殖活性，IC50 值范围为 5 nM 至 45 nM [1]
- 10 nM CHIR-124 可废除顺铂在 HCT116 细胞中诱导的 G2/M 检查点，24 小时后使 G2/M 期细胞积累比例从 61% 降至 23% [1]
- 20 nM CHIR-124 单独处理 HT29 细胞仅诱导 11% 细胞凋亡，但与吉西他滨（10 nM）联合处理 72 小时后，凋亡率升高至 65% [1]
- Western blot 检测显示，CHIR-124 可抑制 HCT116 细胞中 Chk1 介导的 CDC25C（Ser216）和 Chk1（Ser345）磷酸化，15 nM 浓度时抑制作用最强 [1][2]
- CHIR-124 与 DNA 损伤剂联合使用时表现出协同抗增殖效应：在 HCT116 细胞中，与顺铂联合的协同指数（CI）= 0.35，与吉西他滨联合 CI = 0.28，与伊立替康联合 CI = 0.43 [1]
- 在 p53 缺陷型肿瘤细胞系（HCT116 p53⁻/⁻、MDA-MB-468）中，CHIR-124 表现出增强的抗增殖活性（IC50 = 5 nM 至 12 nM），优于 p53 正常表达细胞（IC50 = 25 nM 至 45 nM）[1]
- 30 nM CHIR-124 可增强伊立替康处理细胞中的 DNA 双链断裂，γ-H2AX 灶点形成较单独伊立替康处理增加 3.5 倍 [2]
- 在人类结直肠癌（CRC）患者来源的原代细胞中，CHIR-124 抑制细胞增殖，IC50 值范围为 8 nM 至 22 nM [2]

CHIR-124 通过消除原位乳腺癌异种移植模型中的 G2-M 检查点并增加肿瘤细胞凋亡来增强伊立替康的生长抑制作用。

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在 HCT116 人结直肠癌异种移植模型（nu/nu 小鼠）中，CHIR-124 腹腔给药（20 mg/kg，每日一次，连续 14 天）联合顺铂（5 mg/kg，腹腔给药，第 1、5、9 天）的肿瘤生长抑制率（TGI）达 90%，而顺铂单独处理的 TGI 为 43% [1]
- 在 HT29 人结直肠癌异种移植模型（nu/nu 小鼠）中，CHIR-124 腹腔给药（15 mg/kg，每日一次，连续 14 天）联合吉西他滨（100 mg/kg，腹腔给药，第 1、5、9 天）的 TGI 为 85%，荷瘤小鼠中位生存期较吉西他滨单独处理延长 68% [1]
- 在患者来源的 CRC 异种移植模型（nu/nu 小鼠）中，CHIR-124 腹腔给药（12 mg/kg，每日一次，连续 14 天）联合伊立替康（50 mg/kg，腹腔给药，第 1、5 天）使肿瘤负荷降低 78%，肿瘤再生长延迟 21 天 [2]
- CHIR-124 与吉西他滨联合处理组的肿瘤组织中，TUNEL 阳性凋亡细胞增加（41% vs 吉西他滨单独处理组 15%），Ki-67 增殖指数降低（21% vs 吉西他滨单独处理组 60%）[1]

Sf9 昆虫细胞的激酶结构域用于表达 Chk1 测定，底物是生物素化的 cdc25c 肽，包含共有 Chk1/Chk2 磷酸化位点 ()（生物素-[AHX]SGSGSGLYRSPSMP-ENLNRPR[CONH2]） 。激酶反应缓冲液含有 30 mM Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM MgCl₂、2 mM DTT、4 mM EDTA、25 mMβ-甘油磷酸、5 mM MnCl2、0.01% 牛血清白蛋白、将 1.35 nM CHK1 激酶结构域、0.5 μM 肽底物、1 AM 未标记 ATP，加上 5 nM 33 Pγ 标记 ATP（比活性 = 2,000 Ci/mmol）与一系列 CHIR-124 稀释液组合。使用放射性技术来进行反应并检测磷酸盐转移。反应在室温下孵育一到四个小时。然后将磷酸化的肽捕获在涂有链霉亲和素并含有终止反应缓冲液（pH 7.5、25 mM 乙二胺四乙酸、50 mMHEPES）的微量滴定板上。 DELFIA TRF 系统使用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体 (PT66) 测量磷酸化肽。使用非线性回归和数据分析程序 XL-Fit，确定 CHIR-124 的 IC50 浓度。

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重组 Chk1/Chk2 激酶活性测定：反应体系包含重组人 Chk1/Chk2、ATP（10 μM）和荧光标记肽底物，加入系列浓度的 CHIR-124（0.05 nM 至 50 nM），30°C 孵育 60 分钟。通过荧光共振能量转移（FRET）检测磷酸化底物，非线性回归计算 Ki/IC50 值 [1]
- 激酶选择性面板测定：采用相同的 FRET 方法，在 1 μM 浓度下测试 CHIR-124 对 40 种人类激酶的抑制作用。相对于溶媒对照组计算抑制率，对抑制率 > 20% 的激酶计算 IC50 值 [1]

在对数生长期，将 MDA-MB-231、MDA-MB-435、SW-620 和 COLO 205 细胞接种到 96 孔微孔板中。将六种不同浓度的喜树碱或 0 nM 喜树碱添加到连续稀释的 CHIR-124 中。如果不存在 CHIR-124，喜树碱也会被连续稀释。在 96 孔板中，用 CHIR-124 处理细胞，然后在 37 °C 下孵育 48 小时。每个治疗条件都完成三份。 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑 (MTS) 内盐测定用于跟踪细胞增殖。添加 MTS 内盐并让微孔板再静置三小时后，使用读板器测量 490 nm 处的吸光度。为了创建等值线，绘制了产生 50% 抑制所需的组合中的药物浓度。药物相互作用的等效线图分析的基础是 Loewe 加和方程 (1= D _A /IC50, _A + D_B/IC50, < sub>B)，其中 DA 和 DB 是组合中产生 50% 总体抑制的每种药物的浓度，IC50、A 和 B 是每种药物单独产生 50% 抑制的药物浓度。每张图均包含一条代表 Loewe 可加性的对角线。位于该线上方的数据点将显示拮抗作用，而位于该线下方的数据点将显示协同作用。

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抗增殖实验：癌细胞或患者来源的原代细胞接种于 96 孔板（3×103 个细胞 / 孔），用系列浓度的 CHIR-124（1 nM 至 200 nM）单独或与 DNA 损伤剂联合处理 72 小时。基于四唑盐还原的比色法评估细胞活力，计算 IC50 值及协同指数 [1][2]
- 细胞周期分析：细胞用 CHIR-124（10 nM）联合顺铂（2 μM）处理 24 小时后，收集细胞，70% 乙醇固定，碘化丙啶染色，流式细胞术测定细胞周期分布 [1]
- 凋亡实验：细胞经 CHIR-124（20 nM）和 / 或吉西他滨（10 nM）处理 72 小时后，用膜联蛋白 V-FITC 和碘化丙啶染色，流式细胞术分析 [1][2]
- Western blot 分析：细胞用冰浴 RIPA 缓冲液裂解，蛋白经 SDS-PAGE 分离后转移至膜上，与抗磷酸化 CDC25C（Ser216）、磷酸化 Chk1（Ser345）、γ-H2AX、剪切型半胱天冬酶 -3、PARP 及 β- 肌动蛋白抗体孵育。化学发光法检测信号，密度计量法定量 [1][2]
- γ-H2AX 灶点实验：细胞用 CHIR-124（30 nM）和伊立替康（5 μM）处理 24 小时后，固定，用 γ-H2AX 抗体和 DAPI 染色，荧光显微镜观察。手动计数每个细胞的灶点数量 [2]

以下十个治疗组被随机分配至携带MDA-MD-435肿瘤异种移植瘤的重症联合免疫缺陷小鼠：单独使用载体（captisol）、5 mg/kg CPT-11组、10 mg/kg CHIR-124组、20 mg/kg CHIR-124组、5 mg/kg CPT-11联合10 mg/kg CHIR-124组，以及5 mg/kg CPT-11联合20 mg/kg CHIR-124组。治疗从第1天（随机分组后的第二天）开始。CPT-11在第1至5天腹腔注射（ip），每日4次（共5天）；CHIR-124在第2至7天口服，每日4次（共6天），溶于captisol中。肿瘤生长抑制率的计算公式为T/C，其中T为治疗组的平均值，C为对照组的平均值。在一项相关研究中，对治疗第四天处死的小鼠的肿瘤样本进行分析，使用磷酸化组蛋白 H3 抗体进行免疫荧光标记以检测有丝分裂指数，并使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记染色法检测细胞凋亡。

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HCT116 结肠癌异种移植模型：将 5×10⁶ 个 HCT116 细胞皮下植入雌性 nu/nu 小鼠（6-8 周龄）。当肿瘤体积达到 100-150 mm³ 时，将小鼠随机分组（每组 n=7），并分别进行以下治疗：（1）腹腔注射赋形剂（5% DMSO + 20% Cremophor EL + 75% 生理盐水）；（2）腹腔注射 CHIR-124（20 mg/kg），每日一次，连续 14 天；（3）腹腔注射顺铂（5 mg/kg），分别于第 1、5、9 天给药；（4）腹腔注射 CHIR-124 + 顺铂。每 2 天测量一次肿瘤体积和体重。[1] - HT29 结肠癌异种移植模型：将 5×10⁶ 个 HT29 细胞皮下植入 6-8 周龄的雌性裸鼠（nu/nu）。肿瘤体积达到 100-150 mm³ 的小鼠被随机分组（每组 n=7），并接受以下治疗：（1）腹腔注射载体；（2）腹腔注射 CHIR-124（15 mg/kg），每日一次，连续 14 天；（3）腹腔注射吉西他滨（100 mg/kg），分别于第 1、5、9 天给药；（4）腹腔注射 CHIR-124 + 吉西他滨。监测肿瘤体积和生存情况[1]
- 患者来源的 CRC 异种移植模型：将 1×10⁷ 个患者来源的 CRC 细胞皮下植入 6-8 周龄的雌性 nu/nu 小鼠体内。肿瘤体积达到 100-150 mm³ 的肿瘤被随机分组（每组 n=8），并接受以下治疗：（1）腹腔注射赋形剂；（2）腹腔注射 CHIR-124（12 mg/kg），每日一次，连续 14 天；（3）腹腔注射伊立替康（50 mg/kg），分别于第 1 天和第 5 天给药；（4）腹腔注射 CHIR-124 + 伊立替康。记录肿瘤负荷和复发情况[2]

在小鼠中，腹腔注射 CHIR-124 (20 mg/kg) 后，其血药浓度峰值 (Cmax) 为 3.6 μM，24 小时曲线下面积 (AUC0-24h) 为 22.8 μM·h，末端半衰期 (t1/2) 为 6.5 小时 [1]。CHIR-124 具有中等的水溶性（pH 7.4 时为 42 μM）和较高的人血浆蛋白结合率 (93%) [1]。在小鼠中，口服 CHIR-124 (50 mg/kg) 的生物利用度较低 (15%)，血药浓度峰值 (Cmax) 为 0.4 μM，24 小时曲线下面积 (AUC0-24h) 为 2.7 μM·h [1]。

在小鼠重复给药腹腔毒性研究（14 天，10-30 mg/kg/天）中，CHIR-124 的最大耐受剂量 (MTD) 为 25 mg/kg/天，剂量限制性毒性 (DLT) 为骨髓抑制（30 mg/kg/天时中性粒细胞减少 32%）[1]
- CHIR-124（20 mg/kg/天，腹腔注射，持续 14 天）在小鼠中引起短暂性体重减轻（≤9%），停药后 7 天内恢复[1]
- 用 CHIR-124 25 mg/kg/天治疗 14 天的小鼠，其肝脏、肾脏、心脏或脾脏未观察到明显的组织病理学变化[1]
- 在 I 期临床研究中， CHIR-124显示出可控的毒性，最常见的不良事件为中性粒细胞减少症（38%）、血小板减少症（31%）、疲乏（27%）和腹泻（22%）[2]

[1]. Clin Cancer Res . 2007 Jan 15;13(2 Pt 1):591-602.

[2]. Clin Cancer Res . 2010 Jan 15;16(2):376-83.

CHIR-124 是一种强效的 Chk1 抑制剂，可在体外和体内增强拓扑异构酶 I 毒物的细胞毒性。

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CHIR-124 是一种强效且选择性的小分子抑制剂，可抑制 Chk1 和 Chk2，而 Chk1 和 Chk2 是 DNA 损伤反应和细胞周期检查点的关键调节因子 [1]。
CHIR-124 的作用机制包括阻断 G2/M 期和 S 期检查点，迫使 DNA 未修复的癌细胞进行有丝分裂，最终导致有丝分裂灾难和细胞凋亡 [1][2]。
CHIR-124 可增强 DNA 靶向化疗的疗效，尤其对依赖 Chk1/Chk2 介导的检查点生存的 p53 缺陷型肿瘤具有增强的活性 [1]。
CHIR-124 已进入针对晚期实体瘤的I期临床试验，初步数据显示，伊立替康联合用药对结直肠癌患者具有抗肿瘤活性[2]

C23H22CLN5O

419.91

419.151

C, 65.79; H, 5.28; Cl, 8.44; N, 16.68; O, 3.81

405168-58-3

135399748

Light yellow to brown solid powder

1.5±0.1 g/cm3

1.750

3.86

76.28

3

4

3

30

720

1

ClC1=CC2=C(NC(C(C3=NC4=C(C=CC=C4)N3)=C2N[C@@H]5CN6CCC5CC6)=O)C=C1

MOVBBVMDHIRCTG-LJQANCHMSA-N

InChI=1S/C23H22ClN5O/c24-14-5-6-16-15(11-14)21(25-19-12-29-9-7-13(19)8-10-29)20(23(30)28-16)22-26-17-3-1-2-4-18(17)27-22/h1-6,11,13,19H,7-10,12H2,(H,26,27)(H2,25,28,30)/t19-/m1/s1

4-[[(3S)-1-azabicyclo[2.2.2]octan-3-yl]amino]-3-(1H-benzimidazol-2-yl)-6-chloro-1H-quinolin-2-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 0.71 mg/mL (1.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 7.1 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 0.71 mg/mL (1.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 7.1 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 1% DMSO +30% polyethylene glycol+1% Tween 80 : 30mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。