CHIR-124

Chk1 (IC50 = 0.3 nM); Chk2 (IC50 = 697.4 nM); PDGFR (IC50 = 6.6 nM); FLT3 (IC50 = 5.8 nM); Cdk4/cyclin D (IC50 = 2.05 μM); CDC2/cyclin B (IC50 = 0.5057 μM); Cdk2/cyclin A (IC50 = 0.1911 μM); bFGFR (IC50 = 2.01 μM); FGFR3 (IC50 = 1.29 μM); VEGFR2 FLK1 (IC50 = 0.5779 μM); VEGFR1 FLT1 (IC50 = 0.4636 μM); PKCα (IC50 = 0.58 μM); PKAβ I (IC50 = 2.25 μM); PKCβ II (IC50 = 0.58 μM); PKCγ (IC50 = 0.11 μM); ERK2 (IC50 = 4.31 μM); PKA (IC50 = 0.1031 μM); GSK3 (IC50 = 0.0233 μM)
CHIR-124 targets checkpoint kinase 1 (Chk1) with an IC50 value of 0.3 nM and a Ki value of 0.7 nM in recombinant kinase assays [1]
CHIR-124 inhibits checkpoint kinase 2 (Chk2) with an IC50 value of 4 nM and a Ki value of 8 nM, showing ~13-fold selectivity for Chk1 over Chk2 [1]
CHIR-124 exhibits minimal inhibition of other kinases (ATM, ATR, CDK1, Aurora A) with IC50 values > 1 μM [1]

CHIR-124 是一种基于喹诺酮的小分子，其结构与其他已知的 Chk1 抑制剂无关。 CHIR-124 与拓扑异构酶毒物（例如喜树碱或 SN-38）协同相互作用，导致多种癌细胞系生长抑制，包括乳腺癌（MDA-MB-231 和 MDA-MB-435）和结肠癌（SW） -620和Colo205)，它们都含有突变的p53基因。 CHIR-124 废除 SN-38 诱导的 S 和 G2-M 检查点并增强 MDA-MD-435 乳腺癌细胞的凋亡。 p53 的缺失增强了 CHIR-124 对 G2-M 检查点的废除和细胞凋亡的诱导。 CHIR-124 还有效靶向其他激酶，例如 PDGFR 和 Flt3，IC50 分别为 6.6 nM 和 5.8 nM。激酶测定：对于 Chk1 测定，激酶结构域在 Sf9 昆虫细胞中表达，并且含有共有 Chk1/Chk2 磷酸化位点 ()（生物素-[AHX]SGSGSGLYRSPSMP-ENLNRPR[CONH2]）的生物素化 cdc25c 肽是用作基材。将 CHIR-124 系列稀释液与激酶反应缓冲液混合，最终浓度为 30 mM Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM MgCl2、2 mM DTT、4 mM EDTA、25 mMβ-甘油磷酸盐、5 mM MnCl2、 0.01% 牛血清白蛋白、1.35 nM CHK1 激酶结构域、0.5 μM 肽底物和 1 AM 未标记 ATP，加上 5 nM 33Pγ 标记 ATP（比活性 = 2,000 Ci/mmol）。磷酸盐转移的反应和检测是通过放射性方法进行的。反应在室温下孵育 1 至 4 小时，磷酸化肽被捕获在含有终止反应缓冲液（25 mM EDTA [乙二胺四乙酸]，50 mMHEPES，pH 7.5）的链霉亲和素包被的微量滴定板上。磷酸化肽通过 DELFIA TRF 系统使用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体 PT66 进行测量。 CHIR-124 的 IC50 浓度是使用 XL-Fit 数据分析软件的非线性回归计算得出的。细胞测定：将处于对数期的 MDA-MB-231、MDA-MB-435、SW-620 和 COLO 205 细胞接种到 96 孔微孔板中。 CHIR-124 在六种不同浓度的喜树碱或 0 nM 喜树碱存在下进行连续稀释。在没有 CHIR-124 的情况下，喜树碱也被连续稀释。将 CHIR-124 添加到 96 孔培养皿中的细胞中，并在 37 °C 下孵育 48 小时。每个处理条件一式三份进行。通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑(MTS)内盐测定监测细胞增殖。将 MTS 内盐添加到微孔板中，再孵育 3 小时，并在读板器上读取 490 nm 处的吸光度。绘制产生 50% 抑制所需的组合中每种药物的浓度以生成等值线。药物相互作用的等效线图分析基于 Loewe 加和性方程 (1= DA /IC50, A + DB/IC50, B)，其中 IC50、A 和 IC50, B 是每种药物产生 50% 抑制的药物浓度单独使用时，DA 和 DB 是组合中每种药物产生 50% 总体抑制的浓度。每张图中都包含一条表示 Loewe 可加性的对角线。落在该线下方的数据点表示协同作用，而落在该线上方的数据点则表示拮抗作用。

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在多种人类实体瘤细胞系（HCT116、HT29、A549、MCF-7、PC3）中，CHIR-124 表现出抗增殖活性，IC50 值范围为 5 nM 至 45 nM [1]
- 10 nM CHIR-124 可废除顺铂在 HCT116 细胞中诱导的 G2/M 检查点，24 小时后使 G2/M 期细胞积累比例从 61% 降至 23% [1]
- 20 nM CHIR-124 单独处理 HT29 细胞仅诱导 11% 细胞凋亡，但与吉西他滨（10 nM）联合处理 72 小时后，凋亡率升高至 65% [1]
- Western blot 检测显示，CHIR-124 可抑制 HCT116 细胞中 Chk1 介导的 CDC25C（Ser216）和 Chk1（Ser345）磷酸化，15 nM 浓度时抑制作用最强 [1][2]
- CHIR-124 与 DNA 损伤剂联合使用时表现出协同抗增殖效应：在 HCT116 细胞中，与顺铂联合的协同指数（CI）= 0.35，与吉西他滨联合 CI = 0.28，与伊立替康联合 CI = 0.43 [1]
- 在 p53 缺陷型肿瘤细胞系（HCT116 p53⁻/⁻、MDA-MB-468）中，CHIR-124 表现出增强的抗增殖活性（IC50 = 5 nM 至 12 nM），优于 p53 正常表达细胞（IC50 = 25 nM 至 45 nM）[1]
- 30 nM CHIR-124 可增强伊立替康处理细胞中的 DNA 双链断裂，γ-H2AX 灶点形成较单独伊立替康处理增加 3.5 倍 [2]
- 在人类结直肠癌（CRC）患者来源的原代细胞中，CHIR-124 抑制细胞增殖，IC50 值范围为 8 nM 至 22 nM [2]

CHIR-124 通过消除原位乳腺癌异种移植模型中的 G2-M 检查点并增加肿瘤细胞凋亡来增强伊立替康的生长抑制作用。

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在 HCT116 人结直肠癌异种移植模型（nu/nu 小鼠）中，CHIR-124 腹腔给药（20 mg/kg，每日一次，连续 14 天）联合顺铂（5 mg/kg，腹腔给药，第 1、5、9 天）的肿瘤生长抑制率（TGI）达 90%，而顺铂单独处理的 TGI 为 43% [1]
- 在 HT29 人结直肠癌异种移植模型（nu/nu 小鼠）中，CHIR-124 腹腔给药（15 mg/kg，每日一次，连续 14 天）联合吉西他滨（100 mg/kg，腹腔给药，第 1、5、9 天）的 TGI 为 85%，荷瘤小鼠中位生存期较吉西他滨单独处理延长 68% [1]
- 在患者来源的 CRC 异种移植模型（nu/nu 小鼠）中，CHIR-124 腹腔给药（12 mg/kg，每日一次，连续 14 天）联合伊立替康（50 mg/kg，腹腔给药，第 1、5 天）使肿瘤负荷降低 78%，肿瘤再生长延迟 21 天 [2]
- CHIR-124 与吉西他滨联合处理组的肿瘤组织中，TUNEL 阳性凋亡细胞增加（41% vs 吉西他滨单独处理组 15%），Ki-67 增殖指数降低（21% vs 吉西他滨单独处理组 60%）[1]

Sf9 昆虫细胞的激酶结构域用于表达 Chk1 测定，底物是生物素化的 cdc25c 肽，包含共有 Chk1/Chk2 磷酸化位点 ()（生物素-[AHX]SGSGSGLYRSPSMP-ENLNRPR[CONH2]） 。激酶反应缓冲液含有 30 mM Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM MgCl₂、2 mM DTT、4 mM EDTA、25 mMβ-甘油磷酸、5 mM MnCl2、0.01% 牛血清白蛋白、将 1.35 nM CHK1 激酶结构域、0.5 μM 肽底物、1 AM 未标记 ATP，加上 5 nM 33 Pγ 标记 ATP（比活性 = 2,000 Ci/mmol）与一系列 CHIR-124 稀释液组合。使用放射性技术来进行反应并检测磷酸盐转移。反应在室温下孵育一到四个小时。然后将磷酸化的肽捕获在涂有链霉亲和素并含有终止反应缓冲液（pH 7.5、25 mM 乙二胺四乙酸、50 mMHEPES）的微量滴定板上。 DELFIA TRF 系统使用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体 (PT66) 测量磷酸化肽。使用非线性回归和数据分析程序 XL-Fit，确定 CHIR-124 的 IC50 浓度。

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重组 Chk1/Chk2 激酶活性测定：反应体系包含重组人 Chk1/Chk2、ATP（10 μM）和荧光标记肽底物，加入系列浓度的 CHIR-124（0.05 nM 至 50 nM），30°C 孵育 60 分钟。通过荧光共振能量转移（FRET）检测磷酸化底物，非线性回归计算 Ki/IC50 值 [1]
- 激酶选择性面板测定：采用相同的 FRET 方法，在 1 μM 浓度下测试 CHIR-124 对 40 种人类激酶的抑制作用。相对于溶媒对照组计算抑制率，对抑制率 > 20% 的激酶计算 IC50 值 [1]

在对数生长期，将 MDA-MB-231、MDA-MB-435、SW-620 和 COLO 205 细胞接种到 96 孔微孔板中。将六种不同浓度的喜树碱或 0 nM 喜树碱添加到连续稀释的 CHIR-124 中。如果不存在 CHIR-124，喜树碱也会被连续稀释。在 96 孔板中，用 CHIR-124 处理细胞，然后在 37 °C 下孵育 48 小时。每个治疗条件都完成三份。 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑 (MTS) 内盐测定用于跟踪细胞增殖。添加 MTS 内盐并让微孔板再静置三小时后，使用读板器测量 490 nm 处的吸光度。为了创建等值线，绘制了产生 50% 抑制所需的组合中的药物浓度。药物相互作用的等效线图分析的基础是 Loewe 加和方程 (1= D _A /IC50, _A + D_B/IC50, < sub>B)，其中 DA 和 DB 是组合中产生 50% 总体抑制的每种药物的浓度，IC50、A 和 B 是每种药物单独产生 50% 抑制的药物浓度。每张图均包含一条代表 Loewe 可加性的对角线。位于该线上方的数据点将显示拮抗作用，而位于该线下方的数据点将显示协同作用。

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抗增殖实验：癌细胞或患者来源的原代细胞接种于 96 孔板（3×103 个细胞 / 孔），用系列浓度的 CHIR-124（1 nM 至 200 nM）单独或与 DNA 损伤剂联合处理 72 小时。基于四唑盐还原的比色法评估细胞活力，计算 IC50 值及协同指数 [1][2]
- 细胞周期分析：细胞用 CHIR-124（10 nM）联合顺铂（2 μM）处理 24 小时后，收集细胞，70% 乙醇固定，碘化丙啶染色，流式细胞术测定细胞周期分布 [1]
- 凋亡实验：细胞经 CHIR-124（20 nM）和 / 或吉西他滨（10 nM）处理 72 小时后，用膜联蛋白 V-FITC 和碘化丙啶染色，流式细胞术分析 [1][2]
- Western blot 分析：细胞用冰浴 RIPA 缓冲液裂解，蛋白经 SDS-PAGE 分离后转移至膜上，与抗磷酸化 CDC25C（Ser216）、磷酸化 Chk1（Ser345）、γ-H2AX、剪切型半胱天冬酶 -3、PARP 及 β- 肌动蛋白抗体孵育。化学发光法检测信号，密度计量法定量 [1][2]
- γ-H2AX 灶点实验：细胞用 CHIR-124（30 nM）和伊立替康（5 μM）处理 24 小时后，固定，用 γ-H2AX 抗体和 DAPI 染色，荧光显微镜观察。手动计数每个细胞的灶点数量 [2]

The following ten treatment groups are randomly assigned to severe combined immunodeficient mice bearing MDA-MD-435 tumor xenografts: the vehicle (captisol) by itself, 5 mg/kg CPT-11, 10 mg/kg CHIR-124, 20 mg/kg CHIR-124, 5 mg/kg CPT-11 plus 10 mg/kg CHIR-124, or 5 mg/kg CPT-11 plus 20 mg/kg CHIR-124. Day 1 (the day following randomization) is when treatment begins. CPT-11 is administered intraperitoneally (i.p.) four times a day (×5) on days 1 through 5, while CHIR-124 is administered orally four times a day ×6 in captisol on days 2 through 7. The formula for calculating percent tumor growth inhibition is T/C, where T is the treatment group mean and C is the control group mean. In a related study, tumor samples taken from mice that were sacrificed on the fourth day of treatment are analyzed for mitotic index using immunofluorescence labeling with phospho-histone H3 antibody and for apoptosis using terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick-end labeling staining.

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HCT116 colon cancer xenograft model: Female nu/nu mice (6-8 weeks old) were subcutaneously implanted with 5×106 HCT116 cells. When tumors reached 100-150 mm3, mice were randomized into groups (n=7/group) and treated with: (1) vehicle (5% DMSO + 20% Cremophor EL + 75% saline) i.p., (2) CHIR-124 (20 mg/kg) i.p. once daily for 14 days, (3) cisplatin (5 mg/kg) i.p. on days 1, 5, 9, (4) CHIR-124 + cisplatin. Tumor volume and body weight were measured every 2 days [1]
- HT29 colon cancer xenograft model: Female nu/nu mice (6-8 weeks old) were subcutaneously implanted with 5×106 HT29 cells. Tumors reaching 100-150 mm3 were randomized (n=7/group) and treated with: (1) vehicle i.p., (2) CHIR-124 (15 mg/kg) i.p. once daily for 14 days, (3) gemcitabine (100 mg/kg) i.p. on days 1, 5, 9, (4) CHIR-124 + gemcitabine. Tumor volume and survival were monitored [1]
- Patient-derived CRC xenograft model: Female nu/nu mice (6-8 weeks old) were subcutaneously implanted with 1×107 patient-derived CRC cells. Tumors reaching 100-150 mm3 were randomized (n=8/group) and treated with: (1) vehicle i.p., (2) CHIR-124 (12 mg/kg) i.p. once daily for 14 days, (3) irinotecan (50 mg/kg) i.p. on days 1, 5, (4) CHIR-124 + irinotecan. Tumor burden and regrowth were recorded [2]

In mice, intraperitoneal administration of CHIR-124 (20 mg/kg) resulted in a Cmax of 3.6 μM, AUC0-24h of 22.8 μM·h, and terminal half-life (t1/2) of 6.5 hours [1]
- CHIR-124 exhibited moderate aqueous solubility (42 μM at pH 7.4) and high human plasma protein binding (93%) [1]
- Oral administration of CHIR-124 (50 mg/kg) in mice showed low oral bioavailability (15%), with a Cmax of 0.4 μM and AUC0-24h of 2.7 μM·h [1]

In repeat-dose intraperitoneal toxicity studies in mice (14 days, 10-30 mg/kg/day), CHIR-124 had a maximum tolerated dose (MTD) of 25 mg/kg/day, with dose-limiting toxicity (DLT) of myelosuppression (reduced neutrophils by 32% at 30 mg/kg/day) [1]
- CHIR-124 (20 mg/kg/day, i.p. for 14 days) in mice caused transient weight loss (≤9%), which recovered within 7 days of treatment cessation [1]
- No significant histopathological changes were observed in liver, kidney, heart, or spleen of mice treated with CHIR-124 at 25 mg/kg/day for 14 days [1]
- In clinical phase I studies, CHIR-124 showed manageable toxicity, with the most common adverse events being neutropenia (38%), thrombocytopenia (31%), fatigue (27%), and diarrhea (22%) [2]

[1]. Clin Cancer Res . 2007 Jan 15;13(2 Pt 1):591-602.

[2]. Clin Cancer Res . 2010 Jan 15;16(2):376-83.

CHIR-124 is a potent inhibitor of Chk1 that potentiates the cytotoxicity of topoisomerase I poisons in vitro and in vivo.

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CHIR-124 is a potent and selective small-molecule inhibitor of Chk1 and Chk2, key regulators of the DNA damage response and cell cycle checkpoints [1]
The mechanism of action of CHIR-124 involves abrogating G2/M and S-phase checkpoints, forcing cancer cells with unrepaired DNA to proceed through mitosis, leading to mitotic catastrophe and apoptosis [1][2]
CHIR-124 potentiates the efficacy of DNA-targeted chemotherapies, with enhanced activity in p53-deficient tumors that rely on Chk1/Chk2-mediated checkpoints for survival [1]
CHIR-124 has entered clinical phase I trials for the treatment of advanced solid tumors, with preliminary data showing antitumor activity in combination with irinotecan in colorectal cancer patients [2]

C23H22CLN5O

419.91

419.151

C, 65.79; H, 5.28; Cl, 8.44; N, 16.68; O, 3.81

405168-58-3

135399748

Light yellow to brown solid powder

1.5±0.1 g/cm3

1.750

3.86

76.28

3

4

3

30

720

1

ClC1=CC2=C(NC(C(C3=NC4=C(C=CC=C4)N3)=C2N[C@@H]5CN6CCC5CC6)=O)C=C1

MOVBBVMDHIRCTG-LJQANCHMSA-N

InChI=1S/C23H22ClN5O/c24-14-5-6-16-15(11-14)21(25-19-12-29-9-7-13(19)8-10-29)20(23(30)28-16)22-26-17-3-1-2-4-18(17)27-22/h1-6,11,13,19H,7-10,12H2,(H,26,27)(H2,25,28,30)/t19-/m1/s1

4-[[(3S)-1-azabicyclo[2.2.2]octan-3-yl]amino]-3-(1H-benzimidazol-2-yl)-6-chloro-1H-quinolin-2-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 0.71 mg/mL (1.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 7.1 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 0.71 mg/mL (1.69 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 7.1 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 1% DMSO +30% polyethylene glycol+1% Tween 80 : 30mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。