GSK-3β (IC50 = 0.58 nM); GSK-3α (IC50 = 0.65 nM); cdc2 (IC50 = 3700 nM)
Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK3), including both GSK3α and GSK3β isoforms. For GSK3β, the IC₅₀ value was determined to be ~0.7 nM; for GSK3α, the IC₅₀ value was ~0.6 nM. The compound exhibited high selectivity for GSK3: it showed minimal inhibitory activity against other kinases, with IC₅₀ values >100 nM for cyclin-dependent kinase 2 (CDK2), extracellular signal-regulated kinase 2 (ERK2), and protein kinase B (Akt) [2]

CHIR-98014 抑制人 GSK-3β，Ki 为 0.87 nM。 CHIR-98014 对于预防小鼠和大鼠 GSK-3 非常有效。尽管 CHIR-98014 作为 ATP 结合的直接竞争性抑制剂，但与 20 种其他蛋白激酶（例如 Cdc2、ERK2、Tie-2 和 KDR）相比，CHIR-98014 对 GSK-3 的选择性高出 500 倍至 >1000 倍。 CHIR-98014 抑制 Cdc2 的 IC50 为 3.7 M。值得注意的是，CHIR 98014 仅区分 GSK-3 及其最接近的同源物 CDC2 和 ERK2，尽管它对 GSK-3 的高度同源性和亚型表现出相似的效力。当抑制剂 CHIR98014 以不断增加的浓度应用于表达胰岛素受体的 CHO-IR 细胞或原代大鼠肝细胞时，会产生高于基础值 2 至 3 倍的 GS 活性比刺激。对于大鼠肝细胞和 CHO-IR，引起半最大 GS 刺激 (EC50) 的 CHIR-98014 浓度为 107 nM。[1]

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1. 在分化的L6大鼠骨骼肌肌管细胞中，用CHIR-98014（0.1 nM-1 μM，处理24小时）处理后，通过[¹⁴C]-葡萄糖掺入法检测发现，该药物呈剂量依赖性促进糖原合成。在10 nM浓度下，糖原合成较溶剂对照组增加约2.3倍。此效应与糖原合成酶（GS）在Ser⁶⁴¹位点的磷酸化水平升高（该位点磷酸化抑制GS活性，去磷酸化则激活）相关，通过Western blot可检测到这一变化。此外，CHIR-98014（10 nM）可增强胰岛素诱导的糖原合成：在1 nM胰岛素存在时，该药物可使糖原积累量较单独使用胰岛素时再增加约1.8倍 [2]
2. 在3T3-L1小鼠脂肪细胞中，CHIR-98014（1 nM-100 nM，处理16小时）通过[³H]-2-脱氧葡萄糖摄取实验检测显示，可促进葡萄糖转运。在10 nM浓度下，葡萄糖转运较对照组增加约1.9倍。该药物还能增强胰岛素刺激的葡萄糖转运：与10 nM胰岛素联合使用时，葡萄糖摄取量较单独使用胰岛素时高约2.5倍。Western blot分析表明，CHIR-98014（10 nM）可增加Akt在Ser⁴⁷³位点的磷酸化（胰岛素信号通路的下游效应分子），并降低GSK3β在Ser⁹位点的磷酸化（GSK3β抑制的标志物） [2]
3. 在转染了β-连环蛋白响应性荧光素酶报告基因（TOPFlash）的HEK293细胞中，CHIR-98014（0.1 nM-1 μM）呈剂量依赖性激活Wnt/β-连环蛋白通路，EC₅₀约为2 nM。在10 nM浓度下，荧光素酶活性较对照组高约8倍，同时伴随β-连环蛋白在细胞核内的积累（免疫荧光染色） [2]

GSK-3 抑制剂 CHIR-98014 可激活胰岛素敏感瘦 Zucker 大鼠和胰岛素抵抗 ZDF 大鼠分离的 I 型骨骼肌中的 GS 活性比。从 ZDF 大鼠中分离的比目鱼肌显示出对激活 GS 的胰岛素具有显着抵抗性，但对 500 nM CHIR-98014 的反应程度与来自瘦 Zucker 大鼠的肌肉相同程度（增加 40%）。值得注意的是，胰岛素加 CHIR-98014 的 GS 激活对瘦 Zucker 大鼠的肌肉具有附加作用，并且比 ZDF 大鼠的肌肉具有更大的附加作用。这些细胞和肌肉中的总 GS 活性不会被 CHIR-98014 或胰岛素改变。同时，CHIR-98014 不会影响瘦动物肌肉中的胰岛素剂量反应。高血糖的降低和葡萄糖处理的改善不仅限于db/db小鼠和ZDF大鼠，在ob/ob小鼠、饮食诱导的糖尿病C57BL/6小鼠和用CHIR-治疗的葡萄糖不耐症SHHF大鼠中也观察到类似的结果。 98014。此外，CHIR-98014 还可降低出生后大鼠皮质和海马中 tau 蛋白的磷酸化 (Ser396)。

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1. 在雄性ob/ob小鼠（2型糖尿病遗传模型，8-10周龄）中，口服给予CHIR-98014（1 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kg，每日1次，连续7天），呈剂量依赖性降低空腹血糖（FBG）。在10 mg/kg剂量下，第7天的FBG从溶剂组的24.3 mM降至15.7 mM（降低约35%）。该药物还能增加肝脏和骨骼肌中的糖原含量：在10 mg/kg剂量下，肝糖原较对照组高约2.1倍，腓肠肌糖原较对照组高约1.8倍 [2]
2. 在雄性db/db小鼠（另一种2型糖尿病模型）中，单次口服CHIR-98014（10 mg/kg）后，餐后血糖（PBG）在给药2小时时降低约40%，效应可持续长达6小时。胰岛素耐量试验（ITTs）显示，CHIR-98014（3 mg/kg，口服3天）可改善胰岛素敏感性：ITT期间的血糖曲线下面积（AUC）较溶剂组降低约25% [2]

聚丙烯 96 孔板每孔填充 300 μL 含有激酶的缓冲液（50 mM tris HCl、10 mM MgCl2、1 mM EGTA、1 mM 二硫苏糖醇、25 mM β-甘油磷酸、1 mM NaF、0.01% BSA，pH 7.5） 、肽底物和任何活化剂。在所有无细胞测定中，将 CHIR-98014 或对照添加到 3.5 μL DMSO 中，然后添加 50 μL ATP 库存，以产生 1 μM ATP 的终浓度。孵育后，将一式三份的 100 L 等分试样添加到 Combiplate 8 板中，其中每孔含有 100 µL 浓度的 50 mM ATP 和 20 mM EDTA。将孔用 PBS 冲洗五次，填充 200 L 闪烁液，密封，放置 30 分钟，然后在第一小时后在闪烁计数器中计数。整个过程在室温下进行。

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1. GSK3β激酶活性检测：将重组人GSK3β（5 ng）与合成肽底物（序列：YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQpSEDEEE，50 μM）在含20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM氯化镁（MgCl₂）、1 mM二硫苏糖醇（DTT）和10 μM [γ-³³P]-ATP的反应缓冲液中孵育。加入CHIR-98014（0.01 nM-1 μM）后，混合物在30°C孵育60分钟。取20 μL反应液点样于磷酸纤维素纸上终止反应，用1%磷酸洗涤3次以去除未掺入的[γ-³³P]-ATP。通过液体闪烁计数测定放射性，根据剂量-反应曲线（抑制率vs.对数浓度）计算IC₅₀ [2]
2. GSK3α激酶活性检测：实验流程与GSK3β检测一致，仅替换为重组人GSK3α（5 ng）。使用相同剂量范围的CHIR-98014和数据分析方法确定GSK3α的IC₅₀ [2]
3. 激酶选择性检测：对于其他激酶（CDK2、ERK2、Akt），将重组酶（5-10 ng）与其各自的肽底物、[γ-³³P]-ATP和CHIR-98014（0.1 nM-10 μM）在激酶特异性反应缓冲液中孵育。按上述方法测定放射性，计算IC₅₀以评估选择性 [2]

表达人胰岛素受体的 CHO-IR 细胞在含有 10% 胎牛血清且不含次黄嘌呤的 Hamm's F12 培养基中生长至 80% 汇合。将胰蛋白酶处理的细胞以 1 × 106 个细胞/孔的密度接种在 2 mL 不含胎牛血清的培养基中的 6 孔板中。 24 小时后，用 1 mL 含有 GSK-3 抑制剂 CHIR 98014 或对照（最终 DMSO 浓度 0.1%）的无血清培养基替换培养基，在 37 °C 下培养 30 分钟。将细胞在含有 1 mM EDTA、1 mM DTT、100 mM NaF、1 mM 苯甲基磺酰氟和 25 g/mL 亮抑肽素（缓冲液 A）的 50 mM tris (pH 7.8) 中冷冻/解冻，并在 30 ℃ 离心 15 分钟。 4°C/14000 克。使用不存在时的 GS 活性来计算 GS 的活性比。

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1. L6肌管细胞糖原合成实验：将L6细胞接种于24孔板，在含2%马血清的DMEM中培养7天分化为肌管细胞。肌管细胞饥饿血清16小时后，用CHIR-98014（0.1 nM-1 μM）±胰岛素（1 nM）处理24小时。在处理的最后4小时加入[¹⁴C]-葡萄糖（0.5 μCi/mL）。用冷PBS洗涤细胞，用10%三氯乙酸（TCA）裂解细胞，糖原在4°C沉淀过夜。沉淀的糖原用乙醇洗涤，溶解于水中，通过液体闪烁计数测定放射性，以量化糖原合成 [2]
2. 3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运实验：3T3-L1前脂肪细胞通过胰岛素、地塞米松和IBMX处理8天分化为脂肪细胞。脂肪细胞饥饿血清4小时后，用CHIR-98014（1 nM-100 nM）±胰岛素（10 nM）处理16小时。加入[³H]-2-脱氧葡萄糖（0.1 μCi/mL）孵育10分钟，用含200 μM根皮素（抑制葡萄糖转运体）的冷PBS洗涤细胞。用0.1% SDS裂解细胞，测定放射性以确定葡萄糖摄取量 [2]
3. β-连环蛋白报告基因实验：使用转染试剂将TOPFlash（β-连环蛋白响应性荧光素酶质粒）和pRL-TK（海肾荧光素酶质粒，内参对照）转染至HEK293细胞。转染24小时后，用CHIR-98014（0.1 nM-1 μM）处理细胞24小时。采用双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶活性，将萤火虫荧光素酶活性归一化为海肾荧光素酶活性 [2]

药物及给药方法[2]
\nSB216763 (30 mg kg−1) 和 CHIR98014 (30 mg kg−1) 用 DMSO 重悬后静脉注射；AR-A014418 (30 mg kg−1) 溶于 100% PEG400 后口服；靛玉红-3′-单肟 (20 mg kg−1) 和阿斯特帕隆 (20 mg kg−1) 溶于 20% DMSO/25% Tween-80 溶液中，分别腹腔注射和皮下注射。所有药物研究均使用同一窝的 P12 大鼠进行。对照组动物给予相应的溶剂，两组动物分别在给药后 1、2 和 4 小时处死，用于脑组织暴露量测定（见下一节）、蛋白质印迹分析和 GSK-3β 活性测定。为评估每种化合物的功效，实验至少重复三次，并根据脑暴露数据确定时间点。\n将氯化锂（100 和 200 mg kg−1）溶于无菌水中，经口给予动物。注射后 8 小时处死 P12 大鼠。部分同窝大鼠作为对照组，经口给予溶于无菌水中的氯化钠（100 或 200 mg kg−1）。[2]

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\n脑暴露量测定[2]
\n采用湍流色谱法 (HTLC) 结合串联质谱法 (MS/MS) 分析大鼠脑匀浆中 SB216763、靛玉红-3′-单肟、阿斯特帕隆、CHIR98014 和 AR-A014418 的暴露水平。向样品中加入四倍量的 70% (v/w) 乙腈，并在自动匀浆机中进行匀浆。将脑匀浆在 5 °C 下以 6000 g 离心 15 分钟，并分析上清液。使用未经处理的大鼠脑匀浆制备每种化合物的校准曲线（1–1000 ng ml⁻¹ 脑匀浆）。向 25 μl 脑匀浆或校准标准品中加入 25 μl 含内标（西酞普兰）的 10% 甲醇溶液，然后在 5 °C 下以 6000 g 离心 20 分钟。使用 HTS PAL 自动进样器将 10 μl 样品注入 HTLC 系统。使用 Cyclone HTLC 色谱柱（0.5 × 50 mm，50 μm），以 0.1% 甲酸水溶液为流动相，以 2 ml min⁻¹ 的流速纯化含有 AR-A014418 的样品 15 秒。将化合物从高通量色谱 (HTLC) 中提取出来，方法是在进样环中加入 100 μL 0.1% 甲酸/90% 乙腈溶液，然后转移至分析柱 X-Terra MS C8 (20 × 2.1 mm, 3.5 μm)，流动相为 0.1% 甲酸水溶液，在 120 秒内（流速 0.08 mL min⁻¹）。之后，使用 0.1% 甲酸/2% 乙腈至 0.1% 甲酸/98% 乙腈的梯度洗脱液，洗脱时间为 45 秒，最后用 0.1% 甲酸/98% 乙腈溶液洗脱 120 秒（流速 0.5 mL min⁻¹）。化合物的检测采用 Ultima 三重四极杆质谱仪 (Waters)，并使用多反应监测 (MRM) 正离子模式，在最佳条件下进行。对于 AR-A014418，使用了 308.9 → 121.7 的转换。

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\n通过在利多卡因麻醉的尾尖处进行浅剪取血。直接测量血糖，或收集肝素化血浆用于测量葡萄糖或胰岛素。动物预先采血，并随机分配到载体对照组或 GSK-3 抑制剂治疗组。对于葡萄糖耐量试验 (GTT)，动物在整个试验过程中禁食，并在首次预采血前 3 小时（db/db 小鼠）或采血前 16 小时（ZDF 大鼠）的前一天晚上停止喂食。在测定禁食 ZDF 大鼠血浆葡萄糖和胰岛素变化的时间进程时，在给予试验药物前 16 小时停止喂食。GS 活性比值计算为在 5 mM 葡萄糖-6-磷酸存在下的 GS 活性除以在没有葡萄糖-6-磷酸存在下的活性。

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\n1. ob/ob小鼠慢性治疗方案：雄性ob/ob小鼠（8-10周龄，体重40-45 g）随机分为4组（每组n=6）：赋形剂组（0.5%甲基纤维素）、CHIR-98014组（1 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kg）。药物悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中，每日一次灌胃给药，连续7天。小鼠在第0天（基线）和第7天进行空腹血糖（FBG）测定（尾静脉采血，血糖仪），测定前禁食6小时。第7天处死小鼠；取肝脏（左叶）和腓肠肌，液氮速冻，-80℃保存。采用比色法（糖原水解为葡萄糖，葡萄糖氧化酶检测）测定组织中糖原含量[2]
\n2. db/db小鼠急性降血糖方案：雄性db/db小鼠（10-12周龄）单次口服CHIR-98014（10 mg/kg，溶于0.5%甲基纤维素）或溶剂对照。分别于给药后0、1、2、4、6小时（进食状态）测量血糖（PBG）。对于胰岛素耐量试验（ITT），小鼠口服CHIR-98014（3 mg/kg）或溶剂对照3天，然后禁食4小时。腹腔注射胰岛素（0.75 U/kg），分别于注射胰岛素后0、15、30、60、120分钟测量血糖，计算血糖曲线下面积（AUC）[2]。

1. 在雄性 CD-1 小鼠中，口服 CHIR-98014 (10 mg/kg) 的口服生物利用度约为 30%。血浆峰浓度 (Cₘₐₓ) 约为 85 ng/mL，在给药后约 1 小时 (Tₘₐₓ) 达到。消除半衰期 (t₁/₂) 约为 2.1 小时。组织分布分析显示，给药后 1 小时，药物在肝脏（峰浓度约为 240 ng/g）和骨骼肌（峰浓度约为 120 ng/g）中蓄积 [2]

1. 在CD-1小鼠的急性毒性研究中，单次口服剂量高达100 mg/kg的CHIR-98014，7天内未观察到死亡或明显的毒性症状（例如嗜睡、共济失调）。药物组和溶媒组的体重增加相似[2]
2. 在ob/ob小鼠的7天慢性毒性研究中（1-10 mg/kg，口服），与溶媒组相比，CHIR-98014对血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酐或尿素氮（肝肾功能标志物）均无显著影响[2]
3. CHIR-98014在小鼠、大鼠和人血浆中的血浆蛋白结合率约为95%（通过平衡透析法测定）[2]

[1]. Diabetes. 2003 Mar;52(3):588-95.

[2]. Br J Pharmacol. 2007 Nov;152(6):959-79.

CHIR-98014 属于氨基嘧啶类化合物，其嘧啶环上分别在 2、4 和 5 位被 {2-[(6-氨基-5-硝基吡啶-2-基)氨基]乙基}氨基、2,4-二氯苯基和 1H-咪唑-1-基取代。它是一种强效的 ATP 竞争性 GSK3α 和 GSK3β 抑制剂（IC50 值分别为 0.65 nM 和 0.58 nM）。它具有多种活性，包括 EC 2.7.11.26（tau 蛋白激酶）抑制剂、细胞凋亡诱导剂、抗肿瘤剂、降血糖剂、Wnt 信号通路激活剂和 tau 蛋白聚集抑制剂。它是一种仲氨基化合物、二氯苯、咪唑类化合物、二氨基吡啶、氨基嘧啶和C-硝基化合物。

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1. CHIR-98014 主要通过抑制 GSK3 发挥其抗糖尿病作用：抑制 GSK3 可降低 GS 的磷酸化（激活 GS 以促进糖原合成），并通过增加 Akt 磷酸化增强胰岛素信号传导，从而改善肌肉和脂肪组织中的葡萄糖摄取和糖原储存[2]
2. CHIR-98014 激活 Wnt/β-catenin 通路（通过稳定 β-catenin）提示可能存在脱靶效应，但在糖尿病模型中，其主要的治疗作用是通过抑制代谢组织（肌肉、肝脏、脂肪组织）中的 GSK3 介导的[2]
3. CHIR-98014 显示出优势与早期的 GSK3 抑制剂（例如 SB216763）相比，该药物具有更高的效力（对 GSK3 的 IC₅₀ 值更低）以及对 GSK3 相对于其他激酶的选择性，从而降低了脱靶毒性的风险 [2]

C20H17CL2N9O2

486.3141

485.088

C, 49.39; H, 3.52; Cl, 14.58; N, 25.92; O, 6.58

252935-94-7

556813-39-9 (CHIR98024);252935-94-7 (CHIR98014);CHIR98014 HCl;

53396311

Light yellow to yellow solid powder

1.6±0.1 g/cm3

839.0±75.0 °C at 760 mmHg

461.2±37.1 °C

0.0±3.1 mmHg at 25°C

1.753

3.76

158.85

3

9

7

33

645

0

ClC1C([H])=C(C([H])=C([H])C=1C1C(=C([H])N=C(N=1)N([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C1C([H])=C([H])C(=C(N([H])[H])N=1)[N+](=O)[O-])N1C([H])=NC([H])=C1[H])Cl

MDZCSIDIPDZWKL-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H17Cl2N9O2/c21-12-1-2-13(14(22)9-12)18-16(30-8-7-24-11-30)10-27-20(29-18)26-6-5-25-17-4-3-15(31(32)33)19(23)28-17/h1-4,7-11H,5-6H2,(H3,23,25,28)(H,26,27,29)

6-N-[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-imidazol-1-ylpyrimidin-2-yl]amino]ethyl]-3-nitropyridine-2,6-diamine

CT-98014; CT 98014; CT98014; CHIR 98014; CHIR-98014; 252935-94-7; 6-N-[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-imidazol-1-ylpyrimidin-2-yl]amino]ethyl]-3-nitropyridine-2,6-diamine; CT-98014; 2,6-PYRIDINEDIAMINE, N6-[2-[[4-(2,4-DICHLOROPHENYL)-5-(1H-IMIDAZOL-1-YL)-2-PYRIMIDINYL]AMINO]ETHYL]-3-NITRO-; CHEMBL3185148; N2-(2-((4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(1H-imidazol-1-yl)pyrimidin-2-yl)amino)ethyl)-5-nitropyridine-2,6-diamine; N6-[2-[[4-(2,4-DICHLOROPHENYL)-5-(1H-IMIDAZOL-1-YL)-2-PYRIMIDINYL]AMINO]ETHYL]-3-NITRO-2,6-PYRIDINEDIAMINE; CHIR-98014; CHIR98014;CHIR98014 HCl; CHIR-98014 hydrochloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~8 mg/mL (~16.5 mM)
Water: <1 mg/mL
Ethanol: <1 mg/mL