CP-466722

ATM ( IC50 = 4.1 μM )

体外活性：在体外，CP-466722 被确定为一种潜在的抑制剂，可降低纯化的 ATM 激酶磷酸化 GST-p53(1–101) 底物的活性。此外，CP-466722 还显示出对 abl 和 src 激酶的抑制活性。在 HeLa 细胞中，6μM 剂量的 CP-466722 通过可逆抑制电离辐射 (IR) 诱导的 ATM 激酶活性来抑制 ATM 依赖性磷酸化。此外，在 MCF-7 人乳腺癌细胞以及原代和永生化二倍体人成纤维细胞中，CP-466722 也会抑制 ATM 依赖性 p53 诱导。为了响应 IR，CP-466722 增加了 HeLa 细胞中具有 G2/M DNA 含量的细胞比例，并降低了具有 G1 期 DNA 含量的细胞比例。短暂暴露于 CP-466722 4 小时可使 HeLa 细胞对 IR 敏感，而不影响细胞铺板或细胞活力。激酶测定：为了筛选 ATM 激酶活性的小分子抑制剂，采用了体外激酶测定，并开发了 ELISA 测定，可测量 ATM 下游靶标 p53 的磷酸化状态。纯化重组 GST-p53(1-101) 和全长 Flag 标记的 ATM 和 ATR，用于 ELISA 和体外激酶测定。简而言之，将 Nunc 96 孔 Maxisorp 板用 2μg 纯化的重组 GST-p53(1-101) 的 PBS 溶液包被过夜（4°C）。所有后续孵育均在室温下进行。洗涤板（0.05%v/v-Tween/PBS），然后在终体积为 80μL 的反应缓冲液（20 mM HEPES、50 mM NaCl、 10 mM MgCl2、10 mM MnCl2、1 mM DTT 和 1 μM ATP），存在或不存在 CP-466722。将 CP-466722 (10μM) 添加到板中，一式两份，然后孵育激酶测定（90 分钟）。将板洗涤 (0.05%v/v-Tween/PBS)、封闭（1 小时，1%w/v-BSA/PBS）并漂洗，然后添加抗 Phospho(Ser15)-p53 抗体 (1:1000/PBS)到板中并孵育（1小时）。为了减少非特异性结合，在用 HRP 缀合的山羊抗兔 IgG 二抗 (1:5000/PBS) 孵育（1 小时）之前洗涤板（0.05%v/v-Tween/PBS）。使用 TMB 底物试剂检测与磷酸化 GST-p53(1–101) 蛋白连接的二抗。在确定吸光度 (λ450nm) 之前，将板展开（15 分钟–30 分钟）并停止反应（1 M H2SO4 最终浓度）。 CP-466722 在 ELISA 测定中抑制 ATM 激酶活性，其特征在于使用体外激酶测定抑制 ATM/ATR 激酶。使用抗 Phospho(Ser15)-p53 抗体进行的蛋白质印迹可用作 ATM/ATR 抑制的读数。 Upstate 针对市售激酶组对 CP466722 (10 μM) 进行了扩展分析。细胞测定：HeLa 或 AT（表达 hTERT 的 GM02052）细胞一式三份铺板并孵育 24 小时。在 IR (0-10Gy) 之前对细胞进行预处理：DMSO、CP466722 或 KU55933。 IR后将细胞孵育4小时，然后除去培养基，洗涤细胞(PBS)，胰酶消化，计数并在没有药物的情况下重新铺板(2000个细胞/板，10cm板)并孵育10天。在菌落计数之前，对细胞进行洗涤 (PBS)、染色（PBS、0.0037%v/v-甲醛、0.1%w/v-结晶紫）、漂洗 (dH2O) 并干燥。定义的群体（> 50 个细胞）被计为一个存活集落，数据计算为相对于对照板+/- SE 的存活集落百分比。

开发了 ELISA 测定法来测量 ATM 下游靶标 p53 的磷酸化状态，并采用体外激酶测定法来筛选 ATM 激酶活性的小分子抑制剂。为了用于 ELISA 和体外激酶测试，纯化了重组 GST-p53(1-101) 和全长带 Flag 标签的 ATM 和 ATR。总之，将 PBS 中的 2μg 纯化重组 GST-p53(1-101) 在 4 °C 下在 Nunc 96 孔 Maxisorp 板上包被过夜。接下来的几次孵育在室温下进行。最终体积为 80μL 的反应缓冲液（20 mM HEPES、50 mM NaCl、10 mM MgCl₂、10 mM MnCl₂、1 mM DTT 和 1 μM ATP ），洗涤板（0.05%v/v-Tween/PBS），然后在存在或不存在 CP-466722 的情况下添加纯化的重组全长 ATM 激酶（30 ng–60 ng）。将 CP-466722 (10μM) 一式两份添加到板中后，将激酶测定孵育 90 分钟。将抗 Phospho(Ser15)-p53 抗体 (1:1000/PBS) 添加到板中，然后冲洗、封闭（1 小时，1%w/v-BSA/PBS）并孵育（1 小时）清洁板后（0.05%v/v-Tween/PBS）。将板清洗 (0.05%v/v-Tween/PBS) 以减少非特异性结合，然后与 HRP 缀合的山羊抗兔 IgG 二抗 (1:5000/PBS) 孵育 1 小时。 TMB 底物试剂用于识别与磷酸化 GST-p53(1–101) 蛋白连接的二抗。在测定吸光度（λ450nm）之前，将板显色 15-30 分钟，并在最终浓度为 1 M H₂SO₄ 时停止反应。体外激酶测定用于表征 CP-466722，其在 ELISA 测定中抑制 ATM 激酶活性，涉及 ATM/ATR 激酶的抑制。抗 Phospho(Ser15)-p53 抗体用于蛋白质印迹法来测量 ATM/ATR 抑制。 Upstate 针对一组市售激酶对 CP466722 (10 μM) 进行了扩展分析。

将表达 hTERT 细胞的三重平板 HeLa 或 AT (GM02052) 孵育一整天。在 IR (0-10Gy) 之前用 DMSO、CP466722 或 KU55933 对细胞进行预处理。内反射后，将细胞孵育四个小时。然后，除去培养基，用PBS漂洗细胞，胰蛋白酶处理，计数，并在没有任何药物的情况下重新铺板（2000个细胞/板，10cm板），然后将它们孵育十天。在对集落进行计数之前，细胞要经过一系列程序，包括在 PBS 中洗涤、在 PBS 中染色、在 dH₂O 中漂洗和干燥。存活的集落定义为至少有 50 个细胞的群体。数据表示为相对于对照板的存活菌落的百分比加上或减去标准误差。

[1]. Cancer Res . 2008 Sep 15;68(18):7466-74.

[2]. J Biomol Screen . 2014 Apr;19(4):538-46.

C17H15N7O2

349.35

349.13

C, 58.45; H, 4.33; N, 28.07; O, 9.16

1080622-86-1

Solid powder

COC1=C(C=C2C(=C1)C(=NC=N2)N3C(=NC(=N3)C4=CC=CC=N4)N)OC

ILBRKJBKDGCSCB-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H15N7O2/c1-25-13-7-10-12(8-14(13)26-2)20-9-21-16(10)24-17(18)22-15(23-24)11-5-3-4-6-19-11/h3-9H,1-2H3,(H2,18,22,23)

2-(6,7-dimethoxyquinazolin-4-yl)-5-pyridin-2-yl-1,2,4-triazol-3-amine

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

Chemical Name: 1-(6,7-dimethoxyquinazolin-4-yl)-3-(pyridin-2-yl)-1H-1,2,4-triazol-5-amine InChi Key: ILBRKJBKDGCSCB-UHFFFAOYSA-N InChi Code: InChI=1S/C17H15N7O2/c1-25-13-7-10-12(8-14(13)26-2)20-9-21-16(10)24-17(18)22-15(23-24)11-5-3-4-6-19-11/h3-9H,1-2H3,(H2,18,22,23) SMILES Code: COC1=C(C=C2C(=C1)C(=NC=N2)N3C(=NC(=N3)C4=CC=CC=N4)N)OC

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。