CPI-360   中文名称: CPI 360

CPI-360 targets Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2) (wild-type and Y641N mutant) and to a lesser extent EZH1. In biochemical assays using reconstituted PRC2, CPI-360 is a subnanomolar inhibitor of EZH2 methyltransferase activity (exact IC50 values not specified in text; approximately 5-fold more potent on wild-type EZH2 compared to Y641N mutant). It inhibits EZH1 about 100-fold less potently. The compound is SAM-competitive as demonstrated by an ~5-fold shift in IC50 at higher SAM concentrations. CPI-360 shows exquisite selectivity across a panel of 30 histone lysine and arginine methyltransferases and DNA methyltransferases, with no inhibition observed at concentrations up to 10 µM except for EZH1 and EZH2. [1]

体外活性：在KARPAS-422细胞中，CPI-360能有效降低整体H3K27me3和H3K27me2水平，EC50值分别为56 nM和65 nM。CPI-360还能引起时间依赖性的转录变化，并影响含有Y641N突变EZH2的KARPAS-422细胞的活力。此外，CPI-360 可逐渐将 KARPAS-422 细胞阻滞在 G1 期细胞周期，随后诱导细胞凋亡。
激酶活性测定：CPI-360 是一种高效、选择性的 EZH2 抑制剂，对野生型 EZH2 和 Y641N EZH2 的 IC50 值分别为 0.5 nM 和 2.5 nM。
细胞活性测定：CPI-360 的作用机制基于 S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 竞争，对 EZH1 的抑制作用约为 EZH2 的百分之一，并且对多种组蛋白赖氨酸和精氨酸以及 DNA 甲基转移酶表现出极高的选择性。CPI-360 以剂量依赖的方式显著降低了整体 H3K27me3 和 H3K27me2 水平。 CPI-360 能有效抑制 KARPAS-422 细胞中大量 H3K27me3 的掺入，而不影响组蛋白的总周转率。CPI-360 处理可导致生发中心 B 细胞样弥漫性大 B 细胞淋巴瘤发生时间依赖性的转录变化。

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CPI-360 能以剂量依赖的方式显著降低 HeLa 细胞（ELISA 检测）和 KARPAS-422 细胞中 H3K27me3 和 H3K27me2 的整体水平，而不影响 H3K27me1、其他三/二甲基化标记或 PRC2 亚基（EZH2、SUZ12、EED）的蛋白水平。Western blot 分析证实，处理 4 天后，H3K27me3 水平呈剂量依赖性降低。细胞热位移分析 (CETSA) 显示，CPI-360 在 52°C 下以剂量依赖的方式诱导 KARPAS-422 和 HT 细胞中 EZH2 的热稳定性，24 小时处理后的 EC50 值低于 4 小时处理；该效应在化合物去除后可逆。NanoBRET 分析表明，CPI-360 (10 µM) 不破坏 EZH2-EED 或 EZH2-SUZ12 蛋白-蛋白相互作用，也不影响 EZH2 与染色质的整体结合。SILAC LC-MS/MS 分析显示，CPI-360 处理降低了含 H3K27me3 和 H3K27me2 的肽段数量，增加了未修饰的 H3K27 肽段数量，并且有趣的是，还增加了 H3K27me1 肽段的丰度（与 H3K36me3 联用时除外）。同位素标记周转实验表明，CPI-360 (3 µM) 可抑制 KARPAS-422 细胞中 H3K27me3 的周转（半衰期约为 37-60 小时），但不影响 H3K27me1 的周转（半衰期约为 6-25 小时）；极高浓度 (30 µM) 可部分影响 H3K27me1 的周转。用 1.5 µM CPI-360（以及 GSK-126 和 EPZ-6438）处理 4 天后进行 RNA-seq 分析显示，1248 个基因的表达发生显著改变，其中诱导表达的基因带有 H3K27me3 标记。仅在长期处理 (6-10 天) 后才观察到时间依赖性基因表达诱导（ABAT、APOL3、FBXO39），这与启动子近端 H3K27me3 的丢失相关。 CPI-360（1.5 µM）处理10天后，KARPAS-422细胞逐渐发生G1期细胞周期阻滞，并在处理13天后开始观察到细胞凋亡。在长期生长实验中，CPI-360影响了携带Y641N突变EZH2的KARPAS-422细胞的活力（呈时间依赖性，但并非在第4天就观察到），但对携带野生型EZH2的OCI-LY19细胞（在第4、7和10天）没有影响。在43种NHL细胞系中，CPI-360表现出选择性细胞杀伤作用，其中GCB-DLBCL是最常受影响的亚型，但在ABC-DLBCL、BL和MCL细胞系中也观察到了反应。 CPI-360（或 CPI-169）与 ABT-199 联合用药在 KARPAS-422 细胞（Bliss 非依赖性方法）和一些对这两种单药均有反应的 NHL 细胞系中显示出协同作用。[1]

在携带 KARPAS-422 异种移植瘤的小鼠中，CPI-360（200 mg/kg，皮下注射）可使肿瘤生长减少 44%。

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CPI-360 在 KARPAS-422 皮下异种移植瘤模型（EZH2 Y641N 突变体）中展现了体内疗效。每日两次皮下注射 200 mg/kg CPI-360，持续 28 天，可使肿瘤生长减少 44%，且不影响体重或引起明显的不良反应。然而，CPI-360 的药理学特性不足，无法完全覆盖靶点。在同一模型中，一种效力更强的类似物 CPI-169 实现了肿瘤消退。 CPI-360治疗导致肿瘤中整体H3K27me3水平呈剂量依赖性降低（ELISA检测，p<0.0001），而H3K27me1水平保持不变。与载体组相比，化合物治疗组肿瘤中PRC2靶基因（ABAT、APOL3、FBXO39）表达上调。[1]

生化分析：PRC2 和寡核小体重组以及使用寡核小体底物的放射性生化分析均按先前所述进行。甲基转移酶选择性谱分析（使用 CPI-360）由 Reaction Biology Corp. 提供服务。详细方法：酶活性分析分别使用 20 或 200 µM PRC2（分别为标准浓度和 10 倍酶浓度）以及 10 倍 K50app 的 H3K27me1（10 倍肽浓度）或 SAM（10 倍 SAM 浓度）。较高 SAM 浓度下 IC50 值约 5 倍的偏移与 CPI-360 具有 SAM 竞争性相符。数据以三次重复实验的平均值 ± 标准差表示。在平衡条件下，对一组重组DNA和组蛋白甲基转移酶（30种不同的酶）进行了选择性测试，IC50值是通过10点剂量反应曲线获得的，该曲线采用3倍系列稀释，起始浓度为10 µM。[1]
细胞热转移实验 (CETSA)：实验按照先前描述的方法进行（Martinez Molina等人，2013）。将KARPAS-422或HT细胞与DMSO或不同浓度的CPI-360（0.01-40 µM）孵育指定时间（2、4或24小时），然后进行温度转移（室温、37°C、52°C）3分钟。裂解细胞，通过离心分离可溶性蛋白和不溶性蛋白，并通过Western blotting检测可溶性蛋白池中EZH2蛋白的水平。以vinculin作为对照。采用基于密度分析的Western blot信号定量方法（EZH2强度以vinculin进行标准化）。[1]
NanoBRET检测：将NanoLuc-EZH2和Halo-EED（或Halo-SUZ12）转染至人胚肾（HEK）293细胞。转染48小时后，检测到BRET信号，表明存在直接相互作用。在48小时内加入CPI-360（10 µM）。对于染色质结合实验，将KARPAS-422细胞用DMSO或CPI-360（10 µM）处理2天，并使用Halo标记的H3.1/H3.3和NanoLuc标记的EZH2检测BRET信号。 [1]
SILAC LC-MS/MS：KARPAS-422 细胞在 DMSO 和重培养基中或在 CPI-360（0.63、2.5 和 10 µM）和轻培养基中培养 4 天。混合细胞群，使用 EpiQuik 试剂盒分离组蛋白，丙酰化（Sigma）以封闭游离胺基，胰蛋白酶消化，并再次进行丙酰化。肽段经 Stage Tip 脱盐后，用 Orbitrap MS 进行分析。肽段重悬于 0.1% 甲酸中，注入配备 Agilent 1260 HPLC 的 LTQ-Orbitrap XL ETD 质谱仪。色谱分离在 100 µm × 15 cm HALO C18 色谱柱上进行，流动相为 0-55% 乙腈（含 0.1% 甲酸），流速为 300 nl/min，分离时间为 55 分钟。在 Orbitrap 质谱仪上采集 m/z 300-2000 范围内的扫描图，分辨率为 30,000。[1]
同位素标记周转率测定：将 KARPAS-422 细胞转移至含有甲基-13C、d3-L-蛋氨酸的 RPMI 培养基中，并在 0 时加入 DMSO 或 CPI-360（3 µM 或 30 µM）。在 6 小时至 168 小时的 11 个时间点收集细胞。按照所述方法进行组蛋白提取、衍生化和脱盐 LC-MS/MS 分析。测定含有特定 H3K27 甲基化状态的同位素标记（重）和未标记组蛋白肽的丰度。[1]

细胞培养和活力检测：淋巴瘤细胞系购自ATCC或DSMZ，在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的推荐培养基中培养。对于长期检测，将细胞接种于含化合物的96孔板中，每4天传代一次至含有新鲜EZH2抑制剂的孔板中。使用Envision仪器，通过Cell Titer-Glo (CTG)发光细胞活力检测法评估相对细胞数量。使用Prism 6.0进行曲线拟合。 [1]
蛋白质印迹和ELISA：使用针对H3K27me3、H3K27me2、H3、EZH2、SUZ12、EED、GAPDH等的抗体，通过蛋白质印迹分析全细胞提取物。采用Meso Scale Discovery ELISA检测方法（Garapaty-Rao等人，2013）定量分析整体H3K27me3和H3K27me1水平。[1]
细胞周期分析：用不同剂量的CPI-360处理KARPAS-422细胞长达14天，分别于第4、8、11天进行传代。分别于第 4、6、8、10 和 14 天收集细胞，用 70% 冰乙醇于 -20°C 固定过夜，用碘化丙啶 (20 µg/ml) 染色，使用 Guava Easycyte 测定 DNA 含量，并用 Guava Cytosoft 程序进行分析。[1]
细胞凋亡检测：用 CPI-360 处理 KARPAS-422 细胞，用碘化丙啶和 Annexin-FITC（使用 Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒 I）染色，使用 Guava Easycyte 获取数据，计算凋亡细胞百分比。[1]
RNA-seq 和 ChIP-seq：用 DMSO、CPI-360 (1.5 µM)、GSK-126 或 EPZ-6438 处理 KARPAS-422 细胞 4 天，对样本进行 RNA-seq 分析。采用 ChIP-seq 技术测定全基因组 H3K27me3 位点。数据可在 GEO 数据库中获取，登录号为 GSE62058。[1]
定量 PCR：细胞沉淀后，用 RLT 缓冲液裂解，使用 RNeasy 柱纯化 RNA。取 200 ng RNA，使用 SuperScript III 反转录酶和随机引物反转录为 cDNA。使用 cDNA、Roche FastStart 通用探针预混液和 TaqMan 探针，在 Stratagene MX3005P 仪器上进行 qPCR。分析 Ct 值和 ΔCt 值。[1]
CETSA：如酶活性测定部分所述。[1]

溶于 10% DMSO + 60% 聚乙二醇 400 + 30% 双蒸水中；200 mg/kg；皮下注射，荷 KARPAS-422 肿瘤小鼠

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异种移植研究动物方案：每只小鼠右侧腹部皮下注射 0.2 ml PBS 和 Matrigel (1:1) 混合液中的 KARPAS-422 肿瘤细胞 (1×10⁷)。当平均肿瘤体积达到约 100-200 mm³ 时开始治疗。每组随机分配 10 只荷瘤小鼠。小鼠分别接受赋形剂（10% DMSO + 60% 聚乙二醇 400 + 30% 双蒸水）或 CPI-360（200 mg/kg，皮下注射，每日两次）治疗，持续 28 天。每周三次使用游标卡尺测量肿瘤大小，肿瘤体积 (V) 以 mm^3 表示，计算公式为 V = 0.5 axb^2（a 和 b 分别为肿瘤的长径和短径）。每天称量小鼠体重。肿瘤生长抑制率 (TGI %) = (1 - (T1-T0)/(C1-C0)) x 100。[1]

该论文指出，CPI-360的药理特性不足，无法完全覆盖靶点，但没有提供CPI-360的具体ADME参数（例如，半衰期、生物利用度、清除率）。[1]

Chem Biol.2014 Nov 20;21(11):1463-75.

CPI-360 是一种 EZH2 小分子抑制剂，是从 CPI-905 衍生的杂合化合物系列中筛选出来的。它具有 SAM 竞争性，对 EZH2 的抑制效力达到亚纳摩尔级。该化合物在药理学相关剂量下选择性地影响三甲基化 H3K27 的周转，但不影响单甲基化 H3K27 的周转，这表明单独抑制 EZH2（无需抑制 EZH1）即可有效治疗非霍奇金淋巴瘤 (NHL)。CPI-360 治疗可导致 GCB-DLBCL 细胞发生时间依赖性的转录变化、G1 期阻滞和细胞凋亡。令人惊讶的是，CPI-360 在 EZH2 野生型的 NHL 模型中也显示出疗效，表明其具有更广泛的应用潜力。该化合物已被用作探索 EZH2 生物学及其在非霍奇金淋巴瘤中的作用机制的工具。[1]

C25H31N3O4

437.53

437.231

C, 68.63; H, 7.14; N, 9.60; O, 14.63

1802175-06-9

73442743

Solid powder

1.3±0.1 g/cm3

712.2±60.0 °C at 760 mmHg

384.5±32.9 °C

0.0±2.3 mmHg at 25°C

1.621

2.2

81.6

2

4

6

32

786

1

O1CCC(CC1)[C@@H](C)N1C2C=CC=CC=2C(C(NCC2C(NC(C)=CC=2OC)=O)=O)=C1C

PFPSFENQCNMITC-MRXNPFEDSA-N

InChI=1S/C25H31N3O4/c1-15-13-22(31-4)20(24(29)27-15)14-26-25(30)23-17(3)28(21-8-6-5-7-19(21)23)16(2)18-9-11-32-12-10-18/h5-8,13,16,18H,9-12,14H2,1-4H3,(H,26,30)(H,27,29)/t16-/m1/s1

N-[(4-methoxy-6-methyl-2-oxo-1H-pyridin-3-yl)methyl]-2-methyl-1-[(1R)-1-(oxan-4-yl)ethyl]indole-3-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)