CYM-5541 (ML249)

S1P₃ ( EC50: between 72 and 132 nM )

体外活性：CYM-5541（也称为 ML249）是 S1P3（1-磷酸鞘氨醇）受体的有效、选择性变构激动剂，EC50 范围为 72 至 132 nM。 S1P 是一种溶血磷脂信号分子，通过激活 S1P 的 G 蛋白偶联受体（即 S1P(1) 至 S1P(5)）来调节重要的生物功能，包括淋巴细胞运输和血管发育。 CYM-5541 用于识别变构位点，其中 Phe263 因其亲和力和功效而成为关键的看门残基。该配体缺乏极性部分，并且新型变构疏水口袋允许 CYM-5541 在高度相似的 S1P 受体家族中具有 S1P(3) 选择性。激酶测定：p44/42 MAPK 磷酸化的 ELISA：使用 PathScan Phospho-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204) 夹心 ELISA 试剂盒 (Cell Signaling Technology) 测量配体介导的 ERK 磷酸化。表达WT或突变S1P3的细胞血清饥饿4小时。在拮抗剂实验中，细胞在激动剂处理前与 1 uM SPM-242 预孵育 15 分钟，或者将 1 uM SPM-242 与激动剂预混合。然后用增加浓度的S1P或CYM-5541刺激细胞5分钟（确定所有激动剂产生最大的ERK磷酸化），并根据制造商的方案测定p44/42 MAPK的磷酸化。分析激动剂介导的p44/42 MAPK磷酸化的剂量反应曲线并使用Prism (Graphpad软件)测定EC50。 [33P]S1P放射性配体结合测定：将稳定表达WT或突变体S1P3的Jump-In TI CHO-K细胞(5×105)进行血清饥饿4小时。然后将它们在含有 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、100 mM NaCl、15 mM NaF、0.5 mM EDTA、1 mM Na3VO4、0.5% 无脂肪酸牛血清的结合缓冲液中于 4 °C 孵育 30 分钟白蛋白和蛋白酶抑制剂混合物 (Roche)，含 0.1 nM [33P]S1P，并增加浓度的 S1P、SPM-242 或 CYM-5541。用冷结合缓冲液洗涤细胞三次。通过用 0.5% SDS 裂解细胞，然后进行液体闪烁计数来测量细胞结合的放射性。将原始数据标准化，以便在不存在竞争性配体的情况下与每个细胞系（WT或突变体）结合的[33P]S1P水平被参考为其自身细胞系的100%。细胞测定：pcDNA3.1中编码N端、三重HA标记的S1P3融合蛋白的质粒购自cDNA.org。 S1P3受体突变体是通过重叠PCR诱变产生的，并且在使用前验证了序列。 Jump-In™ TI™ CHO-K 亲代细胞、Gateway 克隆载体（pDONR 221、pJTI R4 DEST 和 pJTI R4 Int）和酶（BP clonase II 和 LR clonase）购自 Invitrogen Corp. 三重 HA 标记的 WT首先使用 BP 重组反应将突变体 S1P3 克隆到入门克隆中。将它们重新定位到适当的 pJTI R4 DEST 载体中，以产生 pJTI R4 EXP 重新定位表达载体。 Jump-In TI CHO-K 细胞用 pJTI R4 EXP S1P1 和 pJTI R4 Int 载体转染以进行重定位。扩增重靶向细胞后，使用 10 μg/mL 杀稻瘟菌素选择重靶向 Jump-In TI 细胞 4 周。

WT 或表达突变 S1P3 的 Jump-In TI CHO-K 细胞处于血清饥饿状态四小时。随后，将它们在 4 °C 的结合缓冲液中孵育 30 分钟，其中含有 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、100 mM NaCl、15 mM NaF、0.5 mM EDTA、1 mM Na_{2< /sub>VO4、0.5% 不含脂肪酸的牛血清白蛋白和含有 0.1 nM [³³P]S1P 以及浓度不断增加的 S1P、SPM 的蛋白酶抑制剂混合物-242，或CYM-5541。使用冷结合缓冲液洗涤细胞3次。液体闪烁计数是用 0.5% SDS 裂解细胞后用于测量细胞结合放射性的方法。为了将在没有竞争性配体的情况下与每个细胞系（WT 或突变体）结合的 [³³P]S1P 水平参考为其自身细胞系的 100%，对原始数据进行标准化[1]。}

编码三重 HA 标签的 N 端 S1P3 融合蛋白的 pcDNA3.1 质粒获自 cDNA.org。使用重叠PCR诱变来创建S1P3受体突变体，并在使用前检查序列。 Gateway 克隆载体（pDONR 221、pJTI R4 DEST 和 pJTI R4 Int）、酶（BP clonase II 和 LR clonase）和 Jump-InTM TI™ CHO-K 亲代细胞购自 Invitrogen Corp。 BP 重组反应为首先用于将三重 HA 标记的 WT 和突变体 S1P3 克隆到入门克隆中。为了创建 pJTI R4 EXP 重定向表达载体，将它们重定向到合适的 pJTI R4 DEST 载体中。为了进行重靶向，将 pJTI R4 EXP S1P1 和 pJTI R4 Int 载体转染至 Jump-In TI CHO-K 细胞中。细胞扩增后，使用 10 μg/mL 杀稻瘟菌素选择重新靶向的 Jump-In TI 细胞，持续 4 周。

[1]. Novel selective allosteric and bitopic ligands for the S1P(3) receptor. ACS Chem Biol. 2012 Dec 21;7(12):1975-83.

C19H28N2O2

316.45

316.22

C, 72.12; H, 8.92; N, 8.85; O, 10.11

945128-26-7

Solid powder

C1CCC(CC1)N(C2CCCCC2)C(=O)C3=NOC(=C3)C4CC4

NDKGACIWVAOUQH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H28N2O2/c22-19(17-13-18(23-20-17)14-11-12-14)21(15-7-3-1-4-8-15)16-9-5-2-6-10-16/h13-16H,1-12H2

N,N-dicyclohexyl-5-cyclopropyl-1,2-oxazole-3-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)