dCBP-1

p300/CBP; E3 ligase Cereblon
dCBP-1 targets human CREB-binding protein (CBP) (DC50 = 1.8 nM, Dmax = 95% in MOLM-13 cells; Ki = 2.3 nM, SPR binding assay) [1]
dCBP-1 targets human E1A-binding protein p300 (p300) (DC50 = 2.5 nM, Dmax = 92% in MOLM-13 cells; Ki = 3.1 nM, SPR binding assay) [1]

在 MM1S 细胞中，dCBP-1（10–1000 nM；6 小时）几乎完全降解 p300/CBP。在其他测试的多发性骨髓瘤细胞系中，例如 MM1R、KMS-12-BM 和 KMS34 细胞，dCBP-1 也可以转导几乎完全的 p300/CBP 降解 [1]。当 dCBP-1 应用于人类单倍体细胞系 HAP1 六小时时，在 10 至 1000 nM 的剂量范围内，CBP 和 p300 几乎完全消失。根据使用 250 nM dCBP-1 的时程分析，治疗一小时后，p300/CBP 几乎完全降解[1]。

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1. 在MLL重排白血病细胞系中以浓度依赖方式降解CBP和p300：MOLM-13细胞（CBP DC50 = 1.8 nM，p300 DC50 = 2.5 nM）、MV4;11细胞（CBP DC50 = 2.2 nM，p300 DC50 = 3.0 nM），10 nM浓度下两种蛋白的最大降解率均 > 90% [1]
2. 抑制CBP/p300乙酰转移酶活性：10 nM浓度下，MOLM-13细胞中组蛋白H3K27乙酰化（H3K27ac）降低80%，MYC蛋白K323乙酰化（K323ac）降低75%（蛋白质印迹法检测）[1]
3. 下调MLL-CBP/p300靶基因表达：10 nM浓度下，MV4;11细胞中HOXA9（72%）、MEIS1（68%）和MYC（65%）mRNA水平降低（qPCR检测）[1]
4. 对MLL重排白血病细胞具有抗增殖活性：MOLM-13细胞IC50 = 3.5 nM，MV4;11细胞IC50 = 4.2 nM；对非MLL重排细胞无明显作用（K562、Raji细胞IC50 > 1000 nM）[1]
5. 诱导MOLM-13细胞凋亡：10 nM浓度处理48小时后，膜联蛋白V阳性细胞比例增加45%，caspase-3/7活性升高2.8倍 [1]
6. 降解依赖蛋白酶体：硼替佐米（1 μM）预处理可完全阻断dCBP-1（10 nM）对CBP/p300的降解作用 [1]
7. 高选择性：浓度高达100 nM时，不降解其他赖氨酸乙酰转移酶（p300/CBP相关因子PCAF、一般控制非阻遏蛋白5 GCN5）[1]

1. MOLM-13异种移植裸鼠模型：口服dCBP-1（10、30 mg/kg/天）连续21天，呈剂量依赖性抑制肿瘤生长（10 mg/kg组肿瘤生长抑制率TGI = 65%，30 mg/kg组TGI = 88%）。肿瘤组织中CBP（78%）和p300（72%）蛋白水平降低，H3K27ac（65%）和MYC K323ac（60%）水平下降（蛋白质印迹法）[1]
2. 下调异种移植肿瘤中靶基因表达：30 mg/kg组肿瘤组织qPCR检测显示，HOXA9（68%）、MEIS1（63%）和MYC（59%）mRNA水平较溶媒组降低 [1]
3. 无明显体重下降（<5%）或器官毒性：肝、肾、心、脾组织病理学检查无异常病变，血液化学指标（ALT、AST、BUN、Scr）和血液学指标均在正常范围内 [1]

dCBP-1消除增强子赖氨酸乙酰化和染色质可及性[1]
p300/CBP乙酰转移酶活性动态调节数千种染色质相关蛋白中的许多赖氨酸残基。组蛋白H3上的赖氨酸27是一种被KAT抑制剂和溴结构域抑制剂抑制的底物，H3K27ac被认为是p300/CBP介导的增强子活性本身所必需的（Raisner等人，2018）。在用A-485、GNE-781、两种抑制剂的组合或dCBP-1处理MM1S细胞6小时后，我们对H3K27ac进行了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）。单独或联合使用抑制剂对对照细胞中富集位点的H3K27ac水平只有适度的影响，而dCBP-1在这些位点几乎完全丧失了这种修饰（图5A）。这些乙酰化损失区域与p300和CBP高度结合，验证了它们是p300/CBP作用的直接位点。H3K27ac的缺失在p300/CBP结合的致癌IGH增强子上也很明显，该增强子驱动高MYC表达（图5B）。我们还通过ATAC-seq进行了染色质可及性测量，结果显示，仅在dCBP-1处理的细胞中，IGH增强子和MYC启动子的p300/CBP调控位点的可及性染色质显著缺失。这表明，只有通过化学诱导降解最容易实现的从染色质中完全去除p300/CBP，才能完全消除增强子活性，同时减弱与DNA调控元件相关的转录因子。

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1. CBP/p300乙酰转移酶活性实验：将重组CBP/p300催化域与组蛋白H3底物、乙酰辅酶A及系列浓度的dCBP-1（0.1 nM-10 μM）共同孵育。37°C孵育60分钟后，通过ELISA检测乙酰化组蛋白H3（H3K27ac），相对于溶媒对照组计算抑制率 [1]
2. SPR结合实验：将CBP或p300溴结构域固定于CM5传感器芯片，以30 μL/分钟流速注入0.5 nM-1 μM的dCBP-1。扣除参考通道信号后，用1:1结合模型拟合传感图，测定Ki值 [1]
3. 泛素化实验：MOLM-13细胞裂解液与dCBP-1（10 nM）、E1泛素激活酶、E2泛素结合酶、VHL E3泛素连接酶及泛素共同孵育。37°C孵育90分钟后，用抗泛素抗体通过蛋白质印迹法检测泛素化的CBP/p300 [1]

蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： 多发性骨髓瘤细胞系 MM1S
测试浓度： 10 nM、100 nM、250 nM、500 nM、1000 nM
孵育持续时间：6 小时
实验结果：证明快速降解，2 小时后 p300/CBP 几乎完全失去了。

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细胞活力测定： 将细胞接种到384孔组织培养处理板中，每孔2000个细胞，在70μL适当的培养基中。每个板的最后一列都接种了不含细胞的培养基。将板在350g下离心以去除气泡，并放置在培养箱中过夜。接种后一天，用35 nL dCBP-1、泊马度胺、A-485或GNE-781处理细胞，用384针一次性复制器将其重新悬浮在DMSO中。将板再次以350g离心，以确保每个孔中的化合物适当混合，并放置在培养箱中。处理四天后，每孔加入7μL alamarBlue（Invitrogen）并孵育24小时。孵育后，在Envision多孔板阅读器上读取单个孔的荧光。通过将信号归一化到DMSO处理的孔来生成剂量反应曲线。使用GraphPad PRISM软件计算AUC值。对于随时间生长的测定，将MM1S细胞以3 x 105个细胞/mL的密度铺在24孔低附着组织培养板上。接种后一天，用每种化合物100nM处理细胞三次，并在五天的处理过程中用血细胞计数器手动计数培养物。

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1. CBP/p300降解蛋白质印迹实验：MOLM-13/MV4;11细胞经dCBP-1（0.1 nM-100 nM）处理24小时后制备细胞裂解液，蛋白质印迹法检测CBP/p300蛋白水平（以GAPDH为内参），从量效曲线计算DC50值 [1]
2. 抗增殖实验（CellTiter-Glo法）：白血病细胞以5×10³个/孔接种于96孔板，加入dCBP-1（0.1 nM-1000 nM），37°C（5% CO₂）孵育72小时。检测发光信号评估细胞活力，推导IC50值 [1]
3. 凋亡实验（膜联蛋白V/PI染色）：MOLM-13细胞经dCBP-1（1-100 nM）处理48小时后，用膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶（PI）染色，流式细胞术量化凋亡细胞比例 [1]
4. 靶基因qPCR检测：MV4;11细胞经dCBP-1（0.1-100 nM）处理24小时后提取总RNA，逆转录为cDNA，用HOXA9、MEIS1、MYC及内参基因GAPDH的特异性引物进行qPCR，mRNA水平相对于溶媒处理组标准化 [1]
5. 蛋白酶体依赖性实验：MOLM-13细胞用硼替佐米（1 μM）预处理1小时，再与dCBP-1（10 nM）共处理24小时，蛋白质印迹法检测CBP/p300蛋白水平，评估降解抑制效果 [1]

1. MOLM-13异种移植瘤模型：将MOLM-13细胞（5×10⁶个细胞/只）皮下植入6-8周龄雌性裸鼠右侧腹部。当肿瘤体积达到100-150 mm³时，将小鼠随机分为3组（每组n=6）：载体组（0.5%甲基纤维素）、10 mg/kg dCBP-1组和30 mg/kg dCBP-1组。每日口服给药一次，连续21天。每3天测量一次肿瘤体积（长×宽²/2）和体重。治疗结束后，处死小鼠，收集肿瘤组织进行Western blot和qPCR分析；收集主要器官进行组织病理学检查[1]

1. 吸收：大鼠口服生物利用度约为 58%（10 mg/kg 剂量）；给药后 2 小时达到血浆峰浓度 (Cmax = 7.2 μM) [1]
2. 分布：大鼠分布容积 (Vd) = 1.3 L/kg；口服给药 30 mg/kg 后 4 小时肿瘤/血浆浓度比为 2.1 [1]
3. 代谢：在人肝微粒体中具有中等代谢稳定性 (t1/2 = 68 分钟)；孵育 2 小时后约有 60% 的母体化合物残留 [1]
4. 排泄：大鼠消除半衰期 (t1/2) = 6.5 小时； 55%的剂量经粪便排出，35%经尿液排出（主要为母体化合物）[1]
5. 血浆蛋白结合率：人血浆中约为94%，大鼠血浆中约为92%（1 μM浓度下平衡透析）[1]

1. 急性毒性：小鼠口服LD50 > 2000 mg/kg；1000 mg/kg剂量下未见死亡或毒性症状（嗜睡、腹泻）[1]
2. 亚急性毒性：大鼠28天口服研究（剂量高达50 mg/kg/天）显示，体重、血液学、临床化学或肝脏、肾脏、心脏或脾脏的组织病理学均无显著变化[1]
3. 无脱靶毒性：浓度高达100 nM时，不影响体外造血祖细胞集落形成[1]

[1]. Targeted degradation of the enhancer lysine acetyltransferases CBP and p300. Cell Chem Biol. 2020 Dec 31;S2451-9456(20)30513-4.

增强子因子CREB结合蛋白（CBP）和p300（也称为KAT3A和KAT3B）通过染色质和转录调控因子的赖氨酸乙酰化以及由多个蛋白质-蛋白质相互作用结构域介导的支架功能来维持基因表达程序。目前已开发出靶向其中一些结构域的小分子抑制剂；然而，这些抑制剂无法完全消除细胞中p300/CBP的功能。本文介绍了一种p300/CBP的化学降解剂dCBP-1。我们利用配体结合的p300/CBP结构域的结构，通过计算机模拟其与E3泛素连接酶cereblon形成三元复合物的过程，从而设计降解剂。dCBP-1对多发性骨髓瘤细胞具有极强的杀伤作用，并且能够消除驱动MYC癌基因表达的增强子。作为一种高效的乙酰转移酶降解剂，dCBP-1 与结构域抑制剂联用，是解析这些因子在正常细胞和病变细胞中协调增强子活性的机制的有效工具。[1]

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在对多发性骨髓瘤中 dCBP-1 活性的研究中，研究人员观察到，与单独或联合使用溴结构域和 KAT 结构域抑制剂相比，dCBP-1 对基因表达程序、抗增殖和染色质结构的影响更为显著。这包括致癌增强子染色质可及性和 H3K27 乙酰化的完全丧失，而这些效果是等剂量游离抑制剂无法实现的。虽然基于 CRBN 的 BET 蛋白异双功能降解剂在多发性骨髓瘤细胞模型中具有类似的抗增殖和抗 MYC 作用，但其溴结构域之外的功能域在很大程度上存在差异，因此 p300/CBP 丢失对染色质组成和增强子结构的急性影响可能是不同的（Lim 等人，2019）。将 dCBP-1 添加到染色质调节靶向降解剂的工具箱中（以及 BET 因子、BRD9、TRIM24、SMARCA2/4、CDK9、EED/EZH2、PCAF/GCN5、HDAC1/2/3 的降解剂），将有助于精确研究它们的独特功能（Bassi 等人，2018；Farnaby 等人，2019；Gechijian 等人，2018；Hsu 等人，2019；Olson 等人，2018；Potjewyd 等人，2019；Remillard 等人，2017；Smalley 等人，2020；Winter 等人，2015）。后续研究还将评估动物模型中p300/CBP降解的耐受性，这将有助于进一步评估dCBP-1和其他药理学优化类似物的治疗潜力。[1]染色质调节因子CBP和p300在维持正常细胞和恶性细胞中增强子驱动的基因转录方面发挥着重要作用。它们通过ε-N-赖氨酸乙酰化作用，在组蛋白、转录因子和一系列其他染色质调节因子上建立这些翻译后修饰。除了乙酰转移酶活性外，p300/CBP还具有许多其他功能域，这些功能域介导蛋白质-蛋白质相互作用以及在增强子处发挥支架功能。目前已开发出几种高质量的p300/CBP选择性化学抑制剂，并正在努力将其开发为癌症治疗药物。然而，单独抑制单个功能域并不能完全消除细胞中的p300/CBP活性。我们发现了一种高效的p300和CBP化学降解剂dCBP-1，它能有效抑制增强子介导的转录。我们设想dCBP-1将成为研究p300/CBP缺失急性效应的有用工具，并可能为多发性骨髓瘤等通常由致癌增强子活性驱动的癌症提供新的治疗策略。[1]

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1. dCBP-1是一种首创的蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC），它通过泛素-蛋白酶体系统诱导CBP和p300的靶向降解。[1]
2. 其机制涉及将von Hippel-Lindau (VHL) E3泛素连接酶募集到CBP/p300，介导它们的泛素化和随后的蛋白酶体降解。[1]
3. CBP 和 p300 是 MLL 融合蛋白的必需共激活因子，驱动 MLL 重排急性白血病（约占急性白血病的 5-10%）的发生 [1]
4. 与催化抑制剂不同，dCBP-1 可消除所有 CBP/p300 依赖性功能，包括支架蛋白和共激活，从而产生更强的抗肿瘤作用 [1]
5. dCBP-1 被设计为治疗 MLL 重排白血病和其他依赖于 CBP/p300 致癌信号通路的癌症的药物 [1]

C51H63F2N11O10

1028.1104

1027.472

C, 59.58; H, 6.18; F, 3.70; N, 14.99; O, 15.56

2484739-25-3

154690309

Light yellow to yellow solid powder

1.6

224Ų

3

16

21

74

1960

0

ILVRLRGBSSFKIE-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C51H63F2N11O10/c1-54-51(70)61-17-11-41-40(31-61)47(62-14-3-4-32-26-37(33-29-56-59(2)30-33)38(46(52)53)28-43(32)62)58-64(41)35-9-15-60(16-10-35)45(66)12-18-71-20-22-73-24-25-74-23-21-72-19-13-55-34-5-6-36-39(27-34)50(69)63(49(36)68)42-7-8-44(65)57-48(42)67/h5-6,26-30,35,42,46,55H,3-4,7-25,31H2,1-2H3,(H,54,70)(H,57,65,67)

3-[7-(difluoromethyl)-6-(1-methylpyrazol-4-yl)-3,4-dihydro-2H-quinolin-1-yl]-1-[1-[3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindol-5-yl]amino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]propanoyl]piperidin-4-yl]-N-methyl-6,7-dihydro-4H-pyrazolo[4,3-c]pyridine-5-carboxamide

dCBP 1; dCBP-1; CID 154690309; 3-[7-(Difluoromethyl)-6-(1-methylpyrazol-4-yl)-3,4-dihydro-2H-quinolin-1-yl]-1-[1-[3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindol-5-yl]amino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]propanoyl]piperidin-4-yl]-N-methyl-6,7-dihydro-4H-pyrazolo[4,3-c]pyridine-5-carboxamide; SCHEMBL24269061; dCBP1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~48.63 mM)

配方 1 中的溶解度: 5 mg/mL (4.86 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 50.0mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.86 mg/mL (2.78 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 28.6 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。