Focal adhesion kinase (FAK)

Tyr397 处的 FAK 磷酸化被 Defactinib(VS-6063) 以剂量和时间依赖性方式抑制。根据 RPPA 的研究结果，Defactinib 可降低紫杉烷耐药细胞系中的 AKT 和 YB-1 水平。 Defactinib 在所有细胞系中剂量依赖性且统计学上显着抑制 pFAK (Tyr397) 的表达。在三小时内，defactinib 会阻断 pFAK (Tyr397) 的表达，并在 48 小时内，表达逐渐恢复[1]。

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抑制FAK对PTX敏感性的影响[1]
我们首先测试了Defactinib/VS-6063对FAK磷酸化的体外作用。在所有细胞系中，VS-6063以剂量依赖的方式显著抑制了pFAK（Tyr397）的表达（图1A；补充图1A，可在线获得）。VS-6063在3小时内抑制了pFAK（Tyr397）的表达，48小时后表达逐渐恢复（图1B；补充图1B和2，可在线获得）。补充图3（可在线获得）代表了一个典型的实验，其中对三次实验的统计分析表明，在其他测试残基（Tyr 576/577、Tyr 925或Tyr 861）上，FAK磷酸化没有统计学上的显著变化。由于Pyk2和FAK在中心催化结构域中的相似性约为60%，我们还测试了Pyk2中的Tyr402、Tyr 579/580和Tyr 881。仅在HeyA8细胞中观察到Tyr402的磷酸化抑制，VS-6063（1µM）处理1小时后，HeyA8 MDR细胞系中的磷酸化残基没有变化。

VS-6063/Defactinib作为单一药物（0-1µM）不影响任何细胞或其紫杉烷抗性对应物的生长（补充图4，在线提供）。然而，PTX和VS-6063（1µM）的组合比单独使用任何一种药物都更有效。与单独使用PTX相比，与VS-6063联合使用PTX的细胞毒性高2.1至4.9倍（图1C；补充图1C，可在线获得）。采用Chou-Talalay法（20）用组合指数评估PTX和VS-6063的组合效果。PTX和VS-6063之间的相互作用在HeyA8和HeyA8 MDR细胞中具有协同作用（图1D）。HeyA8和HeyA8-MDR以1:1000和1:10的比例同时暴露于PTX和VS-6063剂量对细胞生长具有协同抑制作用，组合指数分别为0.953和0.705。在SKOV3ip1或SKOV3-TR细胞中，PTX和VS-6063之间没有观察到协同作用，但观察到对增殖的加性抑制作用（数据未显示）。

接下来，我们测试了基于VS-6063/Defactinib的疗法对增殖和凋亡的影响。与单独使用PTX相比，VS-6063（1µM）与PTX的组合（PTX对SKOV3和HeyA8细胞的中位抑制浓度[IC50]水平分别为8.5和6.3 nmol/L）降低了紫杉烷敏感和紫杉烷抗性细胞的增殖率（图1E；补充图1D，在线提供）。对于细胞凋亡，PTX和VS-6063联合使用的效果最大（图1F；补充图1E，可在线获得）。这些发现表明，VS-6063与PTX联合使用至少对细胞增殖和凋亡具有相加作用。与对照组（34.3%±0.3%；P<0.001）相比，PTX将HeyA8细胞中G2期细胞群的比例增加到51.0%±0.4%，与VS-6063治疗联合使用时，G2期细胞的比例在统计学上显著增加到60.8%±0.9%（与PTX相比，P<0.001）。在PTX组或联合治疗组中，HeyA8 MDR细胞均未被阻滞在G2期（P=0.05）（图1G；补充图1F，可在线获得）。

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FAK抑制对下游信号的影响[1]
由于已知FAK通过β1整合素发出信号，我们首先测试了β1整合素水平是否受到Defactinib/VS-6063的影响，但没有发现统计学上的显著变化（补充图8，在线提供）。为了鉴定紫杉烷抗性细胞系中FAK下游的潜在信号通路，使用并分析了RPPA（DAVID生物信息学资源；http://david.abcc.ncifcrf.gov/).在VS-6063治疗组中，与未治疗组相比，所分析的161种蛋白质中有53种在两种耐药细胞系中显示出统计学上的显著变化（P<0.05）（图3A；补充表1，可在线获得）。我们发现AKT通路是参与最多的通路，包括pFAK（Tyr 397）、pAKT（Thr308）、GSK-3α/β（Ser21/9）、p27（T198）、p70S6K（Thr389）、PRAS40（T246）和pYB-1（Ser102）。其中，pYB-1（Ser102）是统计学上降低最显著的蛋白质（Defactinib/VS-6063治疗降低了36.6%；P<0.001）。鉴于YB-1在致癌和耐药途径中的潜在作用，我们在后续研究中重点研究了FAK和YB-1之间的潜在关系。图3B显示，PTX增加了核YB-1的表达，而PTX与VS-6063联合使用降低了其在HeyA8 MDR细胞中的表达。免疫荧光研究也揭示了类似的发现（图3C）。

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FAK抑制抑制ESCC细胞的恶性进展[2]
由于FAK在几种ESCC细胞系中被过度激活，包括KYSE150、KYSE180、KYSE30、KYSE410、KYSE450、KYSE510、Colo680和KYSE70,9，我们使用MTS测定法测量了Defactinib对这些ESCC细胞株的生长抑制作用。如图1A所示，Defactinib治疗72小时 h剂量依赖性地降低了这些指示的ESCC细胞系的存活率（图1A）。我们使用Transwell试验进一步观察了defactinib在KYSE410和KYSE510中的抗侵袭或迁移能力。如图1B、C所示，defactinib剂量依赖性地抑制了指定ESCC细胞的迁移和侵袭。综上所述，这些结果表明，defactinib在ESCC细胞中具有优异的抗肿瘤作用。 接下来，FAK通过与PI3K催化亚基-p85相互作用增强PI3K/AKT通路的活性。如图2E所示，在4或24小时后，F、Defactinib剂量依赖性地破坏了FAK和PI3K p85亚基之间的相互作用 h治疗。总之，PI3K/AKT通路抑制的动力学和幅度表明，这种作用在defactinib反应中起着重要作用。

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Defactinib对下游基因网络的有效抑制 为了进一步了解Defactinib治疗引起的分子效应，我们分析了用10 μM defactinib 4至24 h（图3A），并重点研究了Defactinib治疗中显著下调的转录本。如图3B-J所示，令人惊讶的是，在4或24小时后，几个靶基因在相同的功能集中大量富集，如化疗耐药性（图3B）、细胞周期（图3C）、生长因子、细胞因子和趋化因子（图3D）、恶性进展（图3E）、细胞可塑性（图3F）、热休克蛋白家族（图3G）、代谢（图3H）、癌基因（图3I）或转录因子（图3J） h defactinib治疗。对参与这些功能集的代表性基因的详细分析表明，其中许多基因在4或24小时后被defactinib持续抑制 h处理（表S1）。

在三小时内，每天两次或更多次剂量为 25 mg/kg 的Defactinib(VS-6063) 诱导 pFAK (Tyr397) 的统计显着抑制，并在 24 小时内恢复表达。因此，随后的治疗试验的剂量方案被确定为 Defactinib，剂量为 25 mg/kg，每天两次。在治疗试验过程中，将腹膜内HeyA8肿瘤的雌性裸鼠随机分为四组，每组10只：1）每天两次口服载体，每周腹腔注射磷酸盐缓冲盐水（对照）； 2) 德法替尼 25 mg/kg PO，每日两次； 3）PTX每周IP； 4) VDefactinib 25 mg/kg PO，每天两次。 HeyA8模型显示，PTX单药治疗使肿瘤重量减少了87.4%，但联合治疗使肿瘤重量减少的幅度最大，为97.9%（与PTX相比，P=0.05）。与 PTX 相比，SKOV3ip1 模型中联合治疗组的肿瘤重量减少了 92.7%（P<0.001）[1]。

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VS-6063/的体内效应德法替尼[1]
Defactinib/VS-6063剂量为25mg/kg，每天两次或更高，在3小时时统计学上显著抑制了pFAK（Tyr397），24小时后表达恢复（补充图5，在线提供）。因此，选择每天两次25mg/kg的Defactinib/VS-6063作为后续治疗实验的给药方案。在治疗实验中，将腹腔内携带HeyA8肿瘤的雌性裸鼠随机分为4组（每组n=10）：1）每天口服两次载体，每周腹腔注射磷酸盐缓冲盐水（对照组）；2）VS-6063/Defactinib25mg/kg口服，每日两次；3）每周腹腔注射PTX；4）VS-6063 25mg/kg每日口服两次，PTX每周腹腔注射一次。在HeyA8模型中，PTX单药治疗使肿瘤重量减轻了87.4%，联合治疗导致肿瘤重量减轻最大，减少了97.9%（与PTX相比P=0.05）（图2，a和B）。在SKOV3ip1模型中，与PTX相比，联合组的肿瘤重量减轻了92.7%（P<0.001）。

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Defactinib对体内肿瘤恶性肿瘤的抑制有效[2]
我们进一步使用了三种异种移植模型，包括皮下肿瘤细胞接种模型（评估肿瘤生长）、腘淋巴结转移模型（评估瘤细胞的淋巴结转移能力）或肺定植模型（评估癌细胞的转移能力），以全面观察Defactinib介导的体内抗肿瘤作用。我们将KYSE410和KYSE510细胞皮下接种到BALB/c小鼠的右侧腹。当异种移植物达到约100 mm3，我们用defactinib（25mg/kg/天，口服）治疗动物约连续3周，并观察肿瘤生长。如图5A所示，治疗2周后，与对照组相比，Defactinib组的肿瘤生长明显延迟。由defactinib介导的肿瘤生长消退持续到第3周。此外，治疗3周后，Defactinib有效地阻断了指定肿瘤组织中FAK的激活（图S4）。腘淋巴结转移模型的结果显示，与对照组相比，FAK抑制显著降低了defactinib治疗组淋巴结中ESCC细胞的体积（图5B）。我们在肺定植模型中进一步评估了Defactinib对ESCC进展的影响。动物静脉注射指定的ESCC细胞。如图5C所示，defactinib治疗组肺部肿瘤巢的数量明显低于对照组。图5D的结果显示，与对照治疗相比，defactinib显著延长了携带ESCC肿瘤的动物的存活期。IHC检测显示，达法替尼显著降低了指定肿瘤中增殖生物标志物Ki-67（图5E）和血管生成生物标志物CD31（图5F）的表达。重要的是，对心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织的组织学分析显示，对照组和Defactinib治疗组之间没有明显变化，表明Defactinib对正常组织没有产生显著的毒性作用（图6A）。Defactinib和对照治疗组的体重没有明显差异（图6B）。

核因子-κB转录活性的酶联免疫吸附分析[2]
根据制造商的说明，使用人核细胞因子-κB（NF-κB）p65转录因子活性检测试剂盒来评估NF-κB的活性。简而言之，将核提取物、DNA结合缓冲液、DTT和转录因子活性测定试剂加入96孔（100μl/孔）中2 h在室温下。用洗涤缓冲液洗涤四次后，向96孔板中加入NF-κB p65一抗溶液（100μl/孔）1 h在室温下。然后，依次加入辣根过氧化物酶偶联的二抗、TMB一步法底物试剂和终止溶液。NF-κB p65活性的光学密度值在450 使用微孔板阅读器读取nm。这个实验重复了五次。

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微阵列分析[2]
安捷伦SurePrint G3人类基因表达v3 8 × 60 K微阵列用于评估下游基因的变化。简而言之，提取KYSE410细胞的总核糖核酸（RNA）并将其转录为互补的脱氧核糖核酸（cDNA）。然后，用花青-3-CTP标记cDNA，与微阵列杂交，用安捷伦扫描仪G2505C洗涤和扫描。使用特征提取软件提取荧光强度数据，然后使用Genespring获取原始数据。上调或下调基因的阈值是倍数变化 ≥2，p值为 ≤.05.

体外基因沉默[1]
YB-1小干扰RNA（siRNA）1（靶序列5′-CCUGUGGCGUCGACCACA-3′）和siRNA2（靶序列5′-GUCCAGUUCAAGGCAGUA-3′），并用于抑制卵巢癌症细胞系中YB-1的表达。如前所述，使用与来自基本局部比对搜索工具（BLAST）搜索的任何已知人类mRNA不具有序列同源性的非突变siRNA作为对照。

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蛋白质印迹分析[1]
如前所述制备培养细胞的裂解物。通常，30μg蛋白质通过10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到硝化纤维膜上。免疫印迹的更多细节见补充方法（在线提供）。

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细胞活力、增殖和凋亡测定[1]
如前所述，进行了存活率[3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）]、增殖（5-乙基il-2’-脱氧尿苷）和凋亡（膜联蛋白-V藻红蛋白[PE]/7AAD染色）测定。

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细胞增殖/存活率测定[2]
使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲氧基苯基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑内盐（MTS）法评估了Defactinib对ESCC细胞的抗增殖作用。简言之，3 × 103 100个指示细胞 μl RPMI 1640培养基接种在96孔板中。24小时后，细胞被附着，并用不同剂量的Defactinib（0-25μM）处理72小时 h.然后，丢弃培养基，用MTS溶液孵育细胞1小时 h.在490℃下用分光光度法扫描板 nm，活细胞数量与甲赞产物呈正相关。

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井外迁移/侵入分析[2]
使用具有含8-μm孔径的聚碳酸酯膜插入物的Transwell室系统测定细胞的迁移。所示ESCC细胞（~1× 105 细胞）在上室中接种200 μl不含FBS的RPMI 1640培养基，在下腔室中加入1 ml含有20%FBS的RPMI 1640培养基。24之后 h、 将上部腔室在甲醇中固定10分钟 用2%结晶紫溶液染色30分钟 min，用棉签去除上腔中的非迁移细胞。然后在显微镜下拍摄迁移细胞。这个实验重复了五次。 对于经孔侵入试验，上室的膜上预先涂有50 μl 2.5 mg/ml基质胶溶液。其他实验条件与迁移测定相似。

4周龄雌性BALB/c裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，并在标准无病原体条件下饲养。所有动物实验均按照北京大学肿瘤医院伦理委员会批准的方案进行。为评估Defactinib的抗肿瘤生长能力，将指定的食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞（1 × 10⁶/100 μl PBS/只小鼠）皮下接种至每只小鼠（n = 5/组）的右侧腹部。当肿瘤体积达到约100 mm³时，给予小鼠defactinib（25 mg/kg/天，口服）治疗，持续3周。defactinib的剂量和给药方案参考了之前的报道¹⁷。为评估肿瘤组织中FAK的活性，使用人磷酸化FAK（Tyr397）试剂盒。具体操作步骤按照制造商的说明进行。简而言之，将肿瘤裂解液加入酶联免疫吸附测定板的孔中，于37℃孵育2小时。然后，弃去裂解液，在相应的孔中加入检测抗体溶液，以检测磷酸化FAK（Tyr397）的表达。[2]

采用腘窝淋巴结转移模型检测了Defactinib对食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞的抗淋巴转移作用。该模型通过将指定ESCC细胞（1 × 10⁶/100 μl PBS/只小鼠，n = 5/组）注射到小鼠足垫中建立。测量并使用公式：长 × 宽² × 0.5计算肿瘤和淋巴结的体积。[2]

采用肺转移模型评估了Defactinib对ESCC转移的影响。将指定ESCC细胞（1 × 10⁵/100 μl PBS/只小鼠，n = 5/组）静脉注射到小鼠体内，并用defactinib治疗。注射后4周，处死小鼠并取出肺组织进行苏木精-伊红（H&E）染色。[2]

生存分析的治疗方法与上述皮下异种移植模型一致。当肿瘤负荷直径超过1 cm³或达到绝对生存事件数时，记录为一次生存事件。为进行肿瘤组织中Ki-67和CD31表达的免疫组织化学（IHC）染色评估，将肿瘤组织固定于10%中性缓冲福尔马林溶液中24小时。然后，将肿瘤组织进行石蜡包埋，并切取5 μm厚的切片。 Ki-67 和 CD31 抗体（稀释度为 1:500）用于免疫组化染色。[2]

为了评估Defactinib对小鼠的毒性，收集皮下异种移植模型小鼠的肝脏、心脏、脾脏和肾脏等器官组织进行 H&E 染色。[2]

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溶于PBS；50 mg/kg；口服给药

携带SKOV3ip1、SKOV3-TR、HeyA8或HeyA8-MDR肿瘤的小鼠

药代动力学[https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27025608/]
VS-6063/Defactinib 吸收迅速，口服 200–600 mg BID 后，中位达峰时间 (Tmax) 为给药后 2.0 小时（范围 0.5–4.0 小时）。血浆 VS-6063 暴露量（Cmax 和 AUC）的增加并非剂量比例增加，且在所评估的整个剂量范围内，平均 AUC0-12 和 AUC0-24 值保持相对稳定（图 1）。剂量超过 400 mg BID 并未导致 VS-6063 暴露量显著增加。在第1天和第15天，400 mg和600 mg每日两次给药组的Cmax值相似，且在200-600 mg每日两次给药剂量范围内，平均AUC值相对一致。在第1天和第15天，清除率似乎随剂量增加而增加，这与暴露量增加幅度小于剂量比例相符。所有给药方案和两个药代动力学研究日的半衰期中位数均为2.3至4.3小时。第1天，200 mg、400 mg和600 mg剂量组的平均CL/F值分别为45.6、105和204 L/h。第15天，200 mg、400 mg和600 mg剂量组的平均CL/F值分别为32.1、70和123 L/h（表3）。所有患者的尿液中均检测到了VS-6063，且在所有剂量组中均表现一致。平均肾清除率（CLr）值范围为0.0855至0.179 L/h，占总给药剂量的百分比范围为0.0439%至0.356%。所有9名受试者均检测到了所评估的4种VS-6063/Defactinib代谢物（M2、M3、M4和M5）的全身浓度。在两个药代动力学采样日，所有剂量组所有代谢物的血浆达峰时间（Tmax）中位数均在给药后2.0至4.0小时之间。根据代谢物相对于VS-6063的血浆峰浓度（Cmax）和AUC0-12值，M2是最丰富的代谢物，其次是M4、M3，最后是M5。 M2 和 M4 的暴露量均高于母体化合物暴露量的 10%，而 M3 和 M5 的暴露量则低于母体化合物暴露量的 10%。在尿液中，M2 代谢物含量最高，且其排泄量高于母体化合物。

安全性和耐受性 [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27025608/]
表2总结了至少两名受试者发生的治疗相关不良事件（AE）。最常见的AE为非结合型高胆红素血症（7例，78%）、疲乏（6例，67%）、食欲下降（4例，44%）和腹泻（3例，33%）。200 mg剂量组中仅有1例患者出现3级非结合型高胆红素血症。所有其他毒性均可控，且主要为轻度（1级或2级）。未发生导致死亡或严重不良事件（SAE）的AE，也未发生导致提前退出研究的AE。所有剂量组均未报告剂量限制性毒性（DLT）。高胆红素血症通常无症状，且多在开始治疗后的前两周内出现。1级或2级非结合型高胆红素血症患者可继续用药，但治疗期间胆红素水平波动较大。所有剂量组均报告了高胆红素血症，其中200 mg剂量组3例（100%），400 mg剂量组2例（67%），600 mg剂量组2例（67%）。200 mg剂量组有一例高胆红素血症为3级。该患者于第7天出现1-2级高胆红素血症；3级高胆红素血症于第42天出现，停用研究药物后6天缓解。所有高胆红素血症报告均被认为与Defactinib相关。所有受试者均未出现ALT或AST高于正常值上限的情况。最常见的胃肠道不良事件是腹泻（3例，33%）和恶心（2例，22%）。400 mg剂量组有1例（33%）受试者报告腹泻，600 mg剂量组有2例（67%）受试者报告腹泻。200 mg剂量组有1例（33%）受试者报告恶心，600 mg剂量组也有1例（33%）受试者报告恶心。两例恶心均为轻度，3例腹泻中有2例也为轻度；600 mg剂量组有1例受试者出现中度腹泻。所有剂量组均未观察到任何具有临床意义的心电图参数变化，且所有受试者的QTc间期均未≥500 ms，QTc间期较基线增加也未超过30 ms。

[1]. Role of focal adhesion kinase in regulating YB-1-mediated resistance in ovarian cancer. J Natl Cancer Inst. 2013 Oct 2;105(19):1485-95.

[2]. Focal adhesion kinase (FAK) inhibitor-defactinib suppresses the malignant progression of human esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) cells via effective blockade of PI3K/AKT axis and downstream molecular network. Mol Carcinog. 2021 Feb;60(2):113-124.

Defactinib 已被研究用于治疗恶性胸膜间皮瘤。
Defactinib 是一种口服生物利用度高的小分子黏着斑激酶 (FAK) 抑制剂，具有潜在的抗血管生成和抗肿瘤活性。Defactinib 抑制 FAK，从而可能阻止整合素介导的多个下游信号转导通路的激活，包括 RAS/MEK/ERK 和 PI3K/Akt 通路，进而抑制肿瘤细胞的迁移、增殖、存活和肿瘤血管生成。酪氨酸激酶 FAK 是整合素的信号转导分子，通常通过与细胞外基质 (ECM) 中的整合素结合而被激活，但在各种肿瘤细胞类型中可能上调并组成性激活。
另见：盐酸 Defactinib（注释已移至）。

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背景
我们之前发现，黏着斑激酶 (FAK) 抑制可增强卵巢癌对紫杉烷类药物的敏感性；然而，其机制尚不完全清楚。
方法
我们对紫杉烷类耐药和紫杉烷类敏感卵巢癌模型的生物学反应进行了表征，研究对象为一种新型FAK抑制剂（VS-6063）。我们采用反相蛋白芯片（RPPA）技术鉴定了紫杉烷类耐药细胞系中的新型下游靶点。此外，我们还分析了105例卵巢癌样本中FAK和YB-1的核表达和胞质表达与临床病理数据的相关性。所有统计检验均为双侧检验，P值采用Student t检验或Fisher精确检验计算。
结果
我们发现VS-6063以时间和剂量依赖的方式抑制Tyr397位点的FAK磷酸化。VS-6063与紫杉醇联合用药显著降低了细胞增殖并促进了细胞凋亡，导致肿瘤重量减少了92.7%至97.9%。 RPPA 数据显示，VS-6063 可降低紫杉烷类耐药细胞系中 AKT 和 YB-1 的水平。FAK 抑制通过降低 YB-1 磷酸化水平，进而以 AKT 依赖的方式降低 CD44 的表达，从而增强紫杉烷类耐药细胞的化疗敏感性。在人卵巢癌样本中，核 FAK 表达与核 YB-1 表达增加相关（χ² = 37.7；P < .001）。核 FAK 和 YB-1 共表达与中位总生存期显著缩短相关（24.9 个月 vs 67.3 个月；风险比 = 2.64；95% 置信区间 = 1.38 至 5.05；P = .006）。
结论
我们发现了一条新的通路，即 VS-6063 通过 AKT 依赖的方式抑制 FAK，从而克服 YB-1 介导的紫杉醇耐药性。这些发现对旨在靶向FAK的临床试验具有重要意义。[1]

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由于缺乏靶向药物，食管鳞状细胞癌（ESCC）的临床治疗效果并不理想。黏着斑激酶（FAK）是一种非受体酪氨酸激酶，参与多种肿瘤发生过程，近期研究表明其是ESCC治疗中一个有前景的靶点。本研究发现，特异性FAK抑制剂defactinib能够有效抑制ESCC细胞的恶性增殖。机制上，defactinib以剂量和时间依赖的方式诱导磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）与FAK解离，从而阻断蛋白激酶B（AKT）信号通路，并抑制多种癌基因的表达，例如SOX2、MYC、EGFR、MET、MDM2和TGFBR2，这些癌基因的表达已通过微阵列和实时聚合酶链式反应（RT-PCR）检测得到证实。具体而言，体外实验表明，FAK抑制介导的PI3K/AKT信号通路及其下游食管鳞状细胞癌（ESCC）特异性生物标志物的抑制作用可持续24小时，从而保证了治疗的持久性和疗效。重要的是，defactinib抑制了肿瘤生长和转移能力，并提高了异种移植动物的总体生存期，且未产生明显的全身毒性。我们的数据表明，FAK抑制可通过有效抑制PI3K/AKT通路及其下游分子网络，为ESCC提供一种优秀的靶向治疗方法。[2]

C20H21F3N8O3S

510.492751836777

510.14

C, 47.06; H, 4.15; F, 11.16; N, 21.95; O, 9.40; S, 6.28

1073154-85-4

Defactinib hydrochloride;1073160-26-5; 1073154-85-4; 1345713-71-4

25117126

White to off-white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

1.616

-0.74

153.71

3

13

8

35

804

0

S(C)(N(C)C1C(CNC2C(C(F)(F)F)=CN=C(NC3C=CC(C(NC)=O)=CC=3)N=2)=NC=CN=1)(=O)=O

FWLMVFUGMHIOAA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H21F3N8O3S/c1-24-18(32)12-4-6-13(7-5-12)29-19-28-10-14(20(21,22)23)16(30-19)27-11-15-17(26-9-8-25-15)31(2)35(3,33)34/h4-10H,11H2,1-3H3,(H,24,32)(H2,27,28,29,30)

N-methyl-4-((4-(((3-(N-methylmethylsulfonamido)pyrazin-2-yl)methyl)amino)-5-(trifluoromethyl)pyrimidin-2-yl)amino)benzamide

VS-6063; PF-04554878; Defactinib; 1073154-85-4; PF-04554,878; VS-6,063; 1345713-71-4; N-methyl-4-((4-(((3-(N-methylmethylsulfonamido)pyrazin-2-yl)methyl)amino)-5-(trifluoromethyl)pyrimidin-2-yl)amino)benzamide; N-methyl-4-[[4-[[3-[methyl(methylsulfonyl)amino]pyrazin-2-yl]methylamino]-5-(trifluoromethyl)pyrimidin-2-yl]amino]benzamide; Defactinib (VS-6063, PF-04554878); VS6063; VS 6063; PF04554878; PF 04554878; PF4554878;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

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配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (4.90 mM) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.07 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.07 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 5% DMSO+50% PEG 300+5% Tween 80+ddH2O: 5mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。