FAK

体外活性：在紫杉烷敏感 (SKOV3ip1) 和紫杉烷耐药 (SKOV3-TR) 细胞系中，Defactinib 显着抑制 pFAK (Tyr397) 表达。 Defactinib 和紫杉醇的组合可协同减少 SKOV3ip1、SKOV3-TR、HeyA8 和 HeyA8-MDR 细胞的增殖并增加细胞凋亡。 Defactinib 和 Y15 的组合可协同降低甲状腺癌细胞系的活力、克隆性和细胞附着。激酶测定：Defactinib 以时间和剂量依赖性方式抑制 Tyr397 位点的 FAK 磷酸化。 Defactinib 和紫杉醇的组合显着降低了增殖并增加了细胞凋亡，从而使肿瘤重量减少了 92.7% 至 97.9%。 RPPA 数据显示，Defactinib 降低了紫杉烷耐药细胞系中 AKT 和 YB-1 的水平。 FAK 抑制通过降低 YB-1 磷酸化以及随后以 AKT 依赖性方式降低 CD44 来增强紫杉烷抗性细胞的化疗敏感性。在人类卵巢癌样本中，核 FAK 表达与核 YB-1 表达增加相关 (χ2) = 37.7； P < .001)。核 FAK 和 YB-1 共表达与统计学上显着较差的中位总生存期相关（24.9 个月 vs 67.3 个月；风险比 = 2.64；95% 置信区间 = 1.38 至 5.05；P = .006）。细胞测定：用增加浓度的 Defactinib 处理卵巢癌细胞 96 小时，然后进行 MTT 测定。结果通过三次重复实验得到证实。

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抑制FAK对PTX敏感性的影响[1]
我们首先测试了Defactinib/VS-6063对FAK磷酸化的体外作用。在所有细胞系中，VS-6063以剂量依赖的方式显著抑制了pFAK（Tyr397）的表达（图1A；补充图1A，可在线获得）。VS-6063在3小时内抑制了pFAK（Tyr397）的表达，48小时后表达逐渐恢复（图1B；补充图1B和2，可在线获得）。补充图3（可在线获得）代表了一个典型的实验，其中对三次实验的统计分析表明，在其他测试残基（Tyr 576/577、Tyr 925或Tyr 861）上，FAK磷酸化没有统计学上的显著变化。由于Pyk2和FAK在中心催化结构域中的相似性约为60%，我们还测试了Pyk2中的Tyr402、Tyr 579/580和Tyr 881。仅在HeyA8细胞中观察到Tyr402的磷酸化抑制，VS-6063（1µM）处理1小时后，HeyA8 MDR细胞系中的磷酸化残基没有变化。

VS-6063/Defactinib作为单一药物（0-1µM）不影响任何细胞或其紫杉烷抗性对应物的生长（补充图4，在线提供）。然而，PTX和VS-6063（1µM）的组合比单独使用任何一种药物都更有效。与单独使用PTX相比，与VS-6063联合使用PTX的细胞毒性高2.1至4.9倍（图1C；补充图1C，可在线获得）。采用Chou-Talalay法（20）用组合指数评估PTX和VS-6063的组合效果。PTX和VS-6063之间的相互作用在HeyA8和HeyA8 MDR细胞中具有协同作用（图1D）。HeyA8和HeyA8-MDR以1:1000和1:10的比例同时暴露于PTX和VS-6063剂量对细胞生长具有协同抑制作用，组合指数分别为0.953和0.705。在SKOV3ip1或SKOV3-TR细胞中，PTX和VS-6063之间没有观察到协同作用，但观察到对增殖的加性抑制作用（数据未显示）。

接下来，我们测试了基于VS-6063/Defactinib的疗法对增殖和凋亡的影响。与单独使用PTX相比，VS-6063（1µM）与PTX的组合（PTX对SKOV3和HeyA8细胞的中位抑制浓度[IC50]水平分别为8.5和6.3 nmol/L）降低了紫杉烷敏感和紫杉烷抗性细胞的增殖率（图1E；补充图1D，在线提供）。对于细胞凋亡，PTX和VS-6063联合使用的效果最大（图1F；补充图1E，可在线获得）。这些发现表明，VS-6063与PTX联合使用至少对细胞增殖和凋亡具有相加作用。与对照组（34.3%±0.3%；P<0.001）相比，PTX将HeyA8细胞中G2期细胞群的比例增加到51.0%±0.4%，与VS-6063治疗联合使用时，G2期细胞的比例在统计学上显著增加到60.8%±0.9%（与PTX相比，P<0.001）。在PTX组或联合治疗组中，HeyA8 MDR细胞均未被阻滞在G2期（P=0.05）（图1G；补充图1F，可在线获得）。

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FAK抑制对下游信号的影响[1]
由于已知FAK通过β1整合素发出信号，我们首先测试了β1整合素水平是否受到Defactinib/VS-6063的影响，但没有发现统计学上的显著变化（补充图8，在线提供）。为了鉴定紫杉烷抗性细胞系中FAK下游的潜在信号通路，使用并分析了RPPA（DAVID生物信息学资源；http://david.abcc.ncifcrf.gov/).在VS-6063治疗组中，与未治疗组相比，所分析的161种蛋白质中有53种在两种耐药细胞系中显示出统计学上的显著变化（P<0.05）（图3A；补充表1，可在线获得）。我们发现AKT通路是参与最多的通路，包括pFAK（Tyr 397）、pAKT（Thr308）、GSK-3α/β（Ser21/9）、p27（T198）、p70S6K（Thr389）、PRAS40（T246）和pYB-1（Ser102）。其中，pYB-1（Ser102）是统计学上降低最显著的蛋白质（Defactinib/VS-6063治疗降低了36.6%；P<0.001）。鉴于YB-1在致癌和耐药途径中的潜在作用，我们在后续研究中重点研究了FAK和YB-1之间的潜在关系。图3B显示，PTX增加了核YB-1的表达，而PTX与VS-6063联合使用降低了其在HeyA8 MDR细胞中的表达。免疫荧光研究也揭示了类似的发现（图3C）。

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FAK抑制抑制ESCC细胞的恶性进展[2]
由于FAK在几种ESCC细胞系中被过度激活，包括KYSE150、KYSE180、KYSE30、KYSE410、KYSE450、KYSE510、Colo680和KYSE70,9，我们使用MTS测定法测量了Defactinib对这些ESCC细胞株的生长抑制作用。如图1A所示，Defactinib治疗72小时 h剂量依赖性地降低了这些指示的ESCC细胞系的存活率（图1A）。我们使用Transwell试验进一步观察了defactinib在KYSE410和KYSE510中的抗侵袭或迁移能力。如图1B、C所示，defactinib剂量依赖性地抑制了指定ESCC细胞的迁移和侵袭。综上所述，这些结果表明，defactinib在ESCC细胞中具有优异的抗肿瘤作用。 接下来，FAK通过与PI3K催化亚基-p85相互作用增强PI3K/AKT通路的活性。如图2E所示，在4或24小时后，F、Defactinib剂量依赖性地破坏了FAK和PI3K p85亚基之间的相互作用 h治疗。总之，PI3K/AKT通路抑制的动力学和幅度表明，这种作用在defactinib反应中起着重要作用。

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Defactinib对下游基因网络的有效抑制 为了进一步了解Defactinib治疗引起的分子效应，我们分析了用10 μM defactinib 4至24 h（图3A），并重点研究了Defactinib治疗中显著下调的转录本。如图3B-J所示，令人惊讶的是，在4或24小时后，几个靶基因在相同的功能集中大量富集，如化疗耐药性（图3B）、细胞周期（图3C）、生长因子、细胞因子和趋化因子（图3D）、恶性进展（图3E）、细胞可塑性（图3F）、热休克蛋白家族（图3G）、代谢（图3H）、癌基因（图3I）或转录因子（图3J） h defactinib治疗。对参与这些功能集的代表性基因的详细分析表明，其中许多基因在4或24小时后被defactinib持续抑制 h处理（表S1）。

在 PTX 敏感和 PTX 耐药模型中，Defactinib（50 mg/kg po）可增强紫杉醇对肿瘤生长的抑制作用。

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VS-6063/的体内效应德法替尼[1]
Defactinib/VS-6063剂量为25mg/kg，每天两次或更高，在3小时时统计学上显著抑制了pFAK（Tyr397），24小时后表达恢复（补充图5，在线提供）。因此，选择每天两次25mg/kg的Defactinib/VS-6063作为后续治疗实验的给药方案。在治疗实验中，将腹腔内携带HeyA8肿瘤的雌性裸鼠随机分为4组（每组n=10）：1）每天口服两次载体，每周腹腔注射磷酸盐缓冲盐水（对照组）；2）VS-6063/Defactinib25mg/kg口服，每日两次；3）每周腹腔注射PTX；4）VS-6063 25mg/kg每日口服两次，PTX每周腹腔注射一次。在HeyA8模型中，PTX单药治疗使肿瘤重量减轻了87.4%，联合治疗导致肿瘤重量减轻最大，减少了97.9%（与PTX相比P=0.05）（图2，a和B）。在SKOV3ip1模型中，与PTX相比，联合组的肿瘤重量减轻了92.7%（P<0.001）。

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Defactinib对体内肿瘤恶性肿瘤的抑制有效[2]
我们进一步使用了三种异种移植模型，包括皮下肿瘤细胞接种模型（评估肿瘤生长）、腘淋巴结转移模型（评估瘤细胞的淋巴结转移能力）或肺定植模型（评估癌细胞的转移能力），以全面观察Defactinib介导的体内抗肿瘤作用。我们将KYSE410和KYSE510细胞皮下接种到BALB/c小鼠的右侧腹。当异种移植物达到约100 mm3，我们用defactinib（25mg/kg/天，口服）治疗动物约连续3周，并观察肿瘤生长。如图5A所示，治疗2周后，与对照组相比，Defactinib组的肿瘤生长明显延迟。由defactinib介导的肿瘤生长消退持续到第3周。此外，治疗3周后，Defactinib有效地阻断了指定肿瘤组织中FAK的激活（图S4）。腘淋巴结转移模型的结果显示，与对照组相比，FAK抑制显著降低了defactinib治疗组淋巴结中ESCC细胞的体积（图5B）。我们在肺定植模型中进一步评估了Defactinib对ESCC进展的影响。动物静脉注射指定的ESCC细胞。如图5C所示，defactinib治疗组肺部肿瘤巢的数量明显低于对照组。图5D的结果显示，与对照治疗相比，defactinib显著延长了携带ESCC肿瘤的动物的存活期。IHC检测显示，达法替尼显著降低了指定肿瘤中增殖生物标志物Ki-67（图5E）和血管生成生物标志物CD31（图5F）的表达。重要的是，对心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织的组织学分析显示，对照组和Defactinib治疗组之间没有明显变化，表明Defactinib对正常组织没有产生显著的毒性作用（图6A）。Defactinib和对照治疗组的体重没有明显差异（图6B）。

以依赖时间和剂量的方式，defactinib 阻止了 Tyr397 位点的 FAK 磷酸化。德法替尼和紫杉醇一起显着减少增殖并增强细胞凋亡，导致肿瘤重量减少 92.7% 至 97.9%。 RPPA 的数据表明，在紫杉烷耐药细胞系中，德法替尼降低了 AKT 和 YB-1 水平。在紫杉烷抗性细胞中，FAK 抑制通过依赖于 AKT 的机制提高了化疗敏感性，并减少了 YB-1 磷酸化，从而减少了 CD44。核 YB-1 表达增加 (χ2) = 37.7； P <.001) 与人类卵巢癌样本中的核 FAK 表达相关。中位总生存期显着较差（24.9 个月与 67.3 个月；风险比 = 2.64；95% 置信区间 = 1.38 至 5.05；P = 0.006）与核 FAK 和 YB-1 的共表达有关。

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核因子-κB转录活性的酶联免疫吸附分析[2]
根据制造商的说明，使用人核细胞因子-κB（NF-κB）p65转录因子活性检测试剂盒来评估NF-κB的活性。简而言之，将核提取物、DNA结合缓冲液、DTT和转录因子活性测定试剂加入96孔（100μl/孔）中2 h在室温下。用洗涤缓冲液洗涤四次后，向96孔板中加入NF-κB p65一抗溶液（100μl/孔）1 h在室温下。然后，依次加入辣根过氧化物酶偶联的二抗、TMB一步法底物试剂和终止溶液。NF-κB p65活性的光学密度值在450 使用微孔板阅读器读取nm。这个实验重复了五次。

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微阵列分析[2]
安捷伦SurePrint G3人类基因表达v3 8 × 60 K微阵列用于评估下游基因的变化。简而言之，提取KYSE410细胞的总核糖核酸（RNA）并将其转录为互补的脱氧核糖核酸（cDNA）。然后，用花青-3-CTP标记cDNA，与微阵列杂交，用安捷伦扫描仪G2505C洗涤和扫描。使用特征提取软件提取荧光强度数据，然后使用Genespring获取原始数据。上调或下调基因的阈值是倍数变化 ≥2，p值为 ≤.05.

MTT 测定是在用浓度不断增加的 defactinib 对卵巢癌细胞进行处理 96 小时后进行的。一式三份进行的实验验证了结果。

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体外基因沉默[1]
YB-1小干扰RNA（siRNA）1（靶序列5′-CCUGUGGCGUCGACCACA-3′）和siRNA2（靶序列5′-GUCCAGUUCAAGGCAGUA-3′），并用于抑制卵巢癌症细胞系中YB-1的表达。如前所述，使用与来自基本局部比对搜索工具（BLAST）搜索的任何已知人类mRNA不具有序列同源性的非突变siRNA作为对照。

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蛋白质印迹分析[1]
如前所述制备培养细胞的裂解物。通常，30μg蛋白质通过10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到硝化纤维膜上。免疫印迹的更多细节见补充方法（在线提供）。

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细胞活力、增殖和凋亡测定[1]
如前所述，进行了存活率[3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）]、增殖（5-乙基il-2’-脱氧尿苷）和凋亡（膜联蛋白-V藻红蛋白[PE]/7AAD染色）测定。

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细胞增殖/存活率测定[2]
使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲氧基苯基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑内盐（MTS）法评估了Defactinib对ESCC细胞的抗增殖作用。简言之，3 × 103 100个指示细胞 μl RPMI 1640培养基接种在96孔板中。24小时后，细胞被附着，并用不同剂量的Defactinib（0-25μM）处理72小时 h.然后，丢弃培养基，用MTS溶液孵育细胞1小时 h.在490℃下用分光光度法扫描板 nm，活细胞数量与甲赞产物呈正相关。

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井外迁移/侵入分析[2]
使用具有含8-μm孔径的聚碳酸酯膜插入物的Transwell室系统测定细胞的迁移。所示ESCC细胞（~1× 105 细胞）在上室中接种200 μl不含FBS的RPMI 1640培养基，在下腔室中加入1 ml含有20%FBS的RPMI 1640培养基。24之后 h、 将上部腔室在甲醇中固定10分钟 用2%结晶紫溶液染色30分钟 min，用棉签去除上腔中的非迁移细胞。然后在显微镜下拍摄迁移细胞。这个实验重复了五次。 对于经孔侵入试验，上室的膜上预先涂有50 μl 2.5 mg/ml基质胶溶液。其他实验条件与迁移测定相似。

小鼠：通过腹腔注射SKOV3ip1、SKOV3-TR、HeyA8和HeyA8-MDR细胞来评估defactinib的抗肿瘤作用。肿瘤细胞注射一周后，将小鼠随机分为四组，每组十只（对照组、PTX单药组、Defactinib单药组和PTX联合Defactinib组）。三至四周后开始治疗。每周腹腔注射PTX（SKOV3ip1和SKOV3-TR组为2 mg/kg，HeyA8和HeyA8-MDR组为2.5 mg/kg）；建议每日两次口服defactinib（25 mg/kg）。对照组小鼠每周腹腔注射一次HBSS，而对照组小鼠每日两次腹腔注射溶剂。在第35天（SKOV3ip1或SKOV3-TR）、第28天（HeyA8或HeyA8-MDR）或任何小鼠出现濒死状态时，处死小鼠。每日观察治疗副作用。记录小鼠的总重量、肿瘤质量和发生率以及肿瘤结节的数量。肿瘤处理采用三种方法：福尔马林固定、石蜡包埋和液氮速冻（OCT）。

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4周龄雌性BALB/c裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于标准无特定病原体（SPF）条件下。所有动物实验均按照北京大学肿瘤医院伦理委员会批准的方案进行。为了评估Defactinib的抗肿瘤生长能力，将指定的食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞（1 × 10⁶/100 μl PBS/只小鼠）皮下接种到每只小鼠（n = 5/组）的右侧腹部。当肿瘤体积达到约100 mm³时，小鼠接受defactinib（25 mg/kg/天，口服）治疗，持续3周。defactinib的剂量和给药方案参考了之前的报道¹⁷。为了评估肿瘤组织中FAK的活性，使用人磷酸化FAK（Tyr397）试剂盒。具体操作步骤按照制造商的说明进行。简而言之，将肿瘤裂解液加入酶联免疫吸附测定板的孔中，于37°C孵育2小时。然后，弃去裂解液，在相应的孔中加入检测抗体溶液，以检测磷酸化FAK（Tyr397）的表达。[2]

采用腘窝淋巴结转移模型检测了Defactinib对食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞的抗淋巴转移作用。该模型通过将指定ESCC细胞（1 × 10⁶/100 μl PBS/只小鼠，n = 5/组）注射到小鼠足垫中建立。测量并使用公式：长 × 宽² × 0.5计算肿瘤和淋巴结的体积。[2]

采用肺转移模型评估了Defactinib对ESCC转移的影响。将指定ESCC细胞（1 × 10⁵/100 μl PBS/只小鼠，n = 5/组）静脉注射到小鼠体内，并用defactinib治疗。注射后4周，处死小鼠并取出肺组织进行苏木精-伊红（H&E）染色。[2]

生存分析的治疗方法与上述皮下异种移植模型一致。当肿瘤负荷直径超过1 cm³或达到绝对生存事件数时，记录为一次生存事件。为进行肿瘤组织中Ki-67和CD31表达的免疫组织化学（IHC）染色评估，将肿瘤组织固定于10%中性缓冲福尔马林溶液中24小时。然后，将肿瘤组织进行石蜡包埋，并切取5 μm厚的切片。 Ki-67 和 CD31 抗体（稀释度为 1:500）用于 IHC 染色。[2]

为了评估Defactinib对小鼠的毒性，收集皮下异种移植模型小鼠的肝脏、心脏、脾脏和肾脏等器官组织进行 H&E 染色。[2]

药代动力学[https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27025608/]
VS-6063/Defactinib 吸收迅速，口服 200–600 mg BID 后，中位达峰时间 (Tmax) 为给药后 2.0 小时（范围 0.5–4.0 小时）。血浆 VS-6063 暴露量（Cmax 和 AUC）的增加并非剂量比例增加，且在所评估的整个剂量范围内，平均 AUC0-12 和 AUC0-24 值保持相对稳定（图 1）。剂量超过 400 mg BID 并未导致 VS-6063 暴露量显著增加。在第1天和第15天，400 mg和600 mg每日两次给药组的Cmax值相似，且在200-600 mg每日两次给药剂量范围内，平均AUC值相对一致。在第1天和第15天，清除率似乎随剂量增加而增加，这与暴露量增加幅度小于剂量比例相符。所有给药方案和两个药代动力学研究日的半衰期中位数均为2.3至4.3小时。第1天，200 mg、400 mg和600 mg剂量组的平均CL/F值分别为45.6、105和204 L/h。第15天，200 mg、400 mg和600 mg剂量组的平均CL/F值分别为32.1、70和123 L/h（表3）。所有患者的尿液中均检测到了VS-6063，且在所有剂量组中均表现一致。平均肾清除率（CLr）值范围为0.0855至0.179 L/h，占总给药剂量的百分比范围为0.0439%至0.356%。所有9名受试者均检测到了所评估的4种VS-6063/Defactinib代谢物（M2、M3、M4和M5）的全身浓度。在两个药代动力学采样日，所有剂量组所有代谢物的血浆达峰时间（Tmax）中位数均在给药后2.0至4.0小时之间。根据代谢物相对于VS-6063的血浆峰浓度（Cmax）和AUC0-12值，M2是最丰富的代谢物，其次是M4、M3，最后是M5。 M2 和 M4 的暴露量均高于母体化合物暴露量的 10%，而 M3 和 M5 的暴露量则低于母体化合物暴露量的 10%。在尿液中，M2 代谢物含量最高，且其排泄量高于母体化合物。

安全性和耐受性 [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27025608/]
表2总结了至少两名受试者发生的治疗相关不良事件（AE）。最常见的AE为非结合型高胆红素血症（7例，78%）、疲乏（6例，67%）、食欲下降（4例，44%）和腹泻（3例，33%）。200 mg剂量组中仅有1例患者出现3级非结合型高胆红素血症。所有其他毒性均可控，且主要为轻度（1级或2级）。未发生导致死亡或严重不良事件（SAE）的AE，也未发生导致提前退出研究的AE。所有剂量组均未报告剂量限制性毒性（DLT）。高胆红素血症通常无症状，且多在开始治疗后的前两周内出现。1级或2级非结合型高胆红素血症患者可继续用药，但治疗期间胆红素水平波动较大。所有剂量组均报告了高胆红素血症，其中200 mg剂量组3例（100%），400 mg剂量组2例（67%），600 mg剂量组2例（67%）。200 mg剂量组有一例高胆红素血症为3级。该患者于第7天出现1-2级高胆红素血症；3级高胆红素血症于第42天出现，停用研究药物后6天缓解。所有高胆红素血症报告均被认为与Defactinib相关。所有受试者均未出现ALT或AST高于正常值上限的情况。最常见的胃肠道不良事件是腹泻（3例，33%）和恶心（2例，22%）。400 mg剂量组有1例（33%）受试者报告腹泻，600 mg剂量组有2例（67%）受试者报告腹泻。200 mg剂量组有1例（33%）受试者报告恶心，600 mg剂量组也有1例（33%）受试者报告恶心。两例恶心均为轻度，3例腹泻中有2例也为轻度；600 mg剂量组有1例受试者出现中度腹泻。所有剂量组均未观察到任何具有临床意义的心电图参数变化，且所有受试者的QTc间期均未≥500 ms，QTc间期较基线增加也未超过30 ms。

[1]. Role of focal adhesion kinase in regulating YB-1-mediated resistance in ovarian cancer. J Natl Cancer Inst. 2013 Oct 2;105(19):1485-95.

[2]. Focal adhesion kinase (FAK) inhibitor-defactinib suppresses the malignant progression of human esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) cells via effective blockade of PI3K/AKT axis and downstream molecular network. Mol Carcinog. 2021 Feb;60(2):113-124.

盐酸达法替尼是达法替尼的盐酸盐形式，达法替尼是一种口服生物利用度高的小分子黏着斑激酶 (FAK) 抑制剂，具有潜在的抗血管生成和抗肿瘤活性。达法替尼抑制 FAK，从而可能阻止整合素介导的多个下游信号转导通路的激活，包括 RAS/MEK/ERK 和 PI3K/Akt 通路，进而抑制肿瘤细胞的迁移、增殖、存活和肿瘤血管生成。酪氨酸激酶 FAK 是整合素的信号转导分子，通常通过与细胞外基质 (ECM) 中的整合素结合而被激活，但在多种肿瘤细胞类型中可能上调并持续激活。

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达法替尼已被研究用于治疗恶性胸膜间皮瘤。
达法替尼是一种口服生物利用度高的小分子黏着斑激酶 (FAK) 抑制剂，具有潜在的抗血管生成和抗肿瘤活性。 Defactinib 可抑制 FAK，从而阻止整合素介导的多个下游信号转导通路（包括 RAS/MEK/ERK 和 PI3K/Akt 通路）的激活，进而抑制肿瘤细胞的迁移、增殖、存活和血管生成。酪氨酸激酶 FAK 是整合素的信号转导分子，通常通过与细胞外基质 (ECM) 中的整合素结合而被激活，但在多种肿瘤细胞类型中可能上调并持续激活。
另见：盐酸 Defactinib（注释已移至）。

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背景
我们之前发现，抑制黏着斑激酶 (FAK) 可增强卵巢癌对紫杉烷类药物的敏感性；然而，其机制尚不完全清楚。
方法
我们对一种新型 FAK 抑制剂 (VS-6063) 进行了表征，研究了紫杉烷耐药和紫杉烷敏感的卵巢癌模型的生物学反应。我们利用反相蛋白芯片（RPPA）鉴定了紫杉烷类耐药细胞系中的新型下游靶点。此外，我们还分析了105例卵巢癌样本中FAK和YB-1的核内和胞质表达与临床病理数据之间的相关性。所有统计检验均为双侧检验，P值采用Student t检验或Fisher精确检验计算。
结果
我们发现VS-6063以时间和剂量依赖的方式抑制FAK在Tyr397位点的磷酸化。VS-6063与紫杉醇联合用药显著降低了细胞增殖并促进了细胞凋亡，导致肿瘤重量减少了92.7%至97.9%。RPPA数据显示，VS-6063降低了紫杉烷类耐药细胞系中AKT和YB-1的表达水平。 FAK抑制剂通过AKT依赖性途径降低YB-1磷酸化水平，进而降低CD44表达，从而增强紫杉烷类耐药细胞的化疗敏感性。在人卵巢癌样本中，核FAK表达与核YB-1表达增加相关（χ² = 37.7；P < .001）。核FAK和YB-1共表达与中位总生存期显著缩短相关（24.9个月 vs 67.3个月；风险比 = 2.64；95%置信区间 = 1.38至5.05；P = .006）。
结论
我们发现了一条新的通路，即使用VS-6063抑制FAK可通过AKT依赖性途径克服YB-1介导的紫杉醇耐药性。这些发现对旨在靶向FAK的临床试验具有重要意义。[1]

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由于缺乏靶向药物，食管鳞状细胞癌（ESCC）的临床治疗效果并不理想。黏着斑激酶（FAK）是一种非受体酪氨酸激酶，参与多种肿瘤发生过程，近期研究表明其是ESCC治疗中一个有前景的靶点。本研究发现，特异性FAK抑制剂defactinib能够有效抑制ESCC细胞的恶性增殖。机制上，defactinib以剂量和时间依赖的方式诱导磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）与FAK的解离，从而阻断蛋白激酶B（AKT）信号通路，并抑制多种癌基因的表达，例如SOX2、MYC、EGFR、MET、MDM2和TGFBR2，这些癌基因的表达已通过微阵列和实时聚合酶链式反应（RT-PCR）检测得到证实。具体而言，体外实验表明，FAK抑制介导的PI3K/AKT信号通路及其下游食管鳞状细胞癌（ESCC）特异性生物标志物的抑制作用可持续24小时，从而保证了治疗的持久性和疗效。重要的是，defactinib抑制了肿瘤生长和转移能力，并提高了异种移植动物的总体生存期，且未产生明显的全身毒性。我们的数据表明，FAK抑制可通过有效抑制PI3K/AKT通路及其下游分子网络，为ESCC提供一种优秀的靶向治疗方法。[2]

C20H22CLF3N8O3S

546.95

546.118

C, 43.92; H, 4.05; Cl, 6.48; F, 10.42; N, 20.49; O, 8.78; S, 5.86

1073160-26-5

Defactinib;1073154-85-4; 1073160-26-5; 1345713-71-4

25117347

White to off-white solid powder

4.165

153.71

4

13

8

36

804

0

Cl[H].S(C([H])([H])[H])(N(C([H])([H])[H])C1C(C([H])([H])N([H])C2C(C(F)(F)F)=C([H])N=C(N([H])C3C([H])=C([H])C(C(N([H])C([H])([H])[H])=O)=C([H])C=3[H])N=2)=NC([H])=C([H])N=1)(=O)=O

RCHQNUQAHJNRBY-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H21F3N8O3S.ClH/c1-24-18(32)12-4-6-13(7-5-12)29-19-28-10-14(20(21,22)23)16(30-19)27-11-15-17(26-9-8-25-15)31(2)35(3,33)34;/h4-10H,11H2,1-3H3,(H,24,32)(H2,27,28,29,30);1H

N-methyl-4-[[4-[[3-[methyl(methylsulfonyl)amino]pyrazin-2-yl]methylamino]-5-(trifluoromethyl)pyrimidin-2-yl]amino]benzamide;hydrochloride

VS-6063 HCl; PF-04554878 HCl; Defactinib hydrochloride; Defactinib HCl; VS6063 HCl; VS 6063 HCl; VS-6063 HCl; PF04554878 HCl; PF 04554878 HCl; PF4554878 HCl; PF-4554878 HCl; PF4554878 HCl; 1073160-26-5; Defactinib hydrochloride [USAN]; UNII-L2S469LM49; VS-6063 HYDROCHLORIDE; L2S469LM49; Defactinib hydrochloride (USAN); DEFACTINIB HYDROCHLORIDE [WHO-DD];

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 0.67 mg/mL (1.22 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 6.7 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 0.67 mg/mL (1.22 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 6.7mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 0.67 mg/mL (1.22 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 6.7 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 5% DMSO+50% PEG 300+5% Tween 80+ddH2O: 5mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。