E3330 (APX-3330)

NF-κB; APE1(Ref-1)

体外活性：E3330 通过抑制 Ape1 氧化还原活性影响体外成血管细胞发育。 E3330 抑制人胰腺癌细胞系 PANC1、XPA1、MIAPACA、BxPC3 和 PK9 的生长。 E3330 还促进 PANC1 细胞的细胞周期退出，抑制 HIF-1α 的 DNA 结合活性和胰腺癌细胞的迁移。在 JHH6 细胞中，E3330 通过改变 APE1 亚细胞运输来防止 NF-κB 的功能激活，并通过阻断氧化还原介导的 NF-κB 激活来减少 TNF-α 和 FA 积累诱导的 IL-6 和 IL-8 表达。细胞测定：将 PANC1 细胞置于 12 孔板的一个孔中，并用 5 至 30 μM E3330 处理。培养 24、48 和 72 小时后，用 PBS 洗涤细胞并用台盼蓝染色，并通过计数活细胞数来检查细胞活力。

在患有内毒素介导的肝炎的小鼠中，E3330（300 mg/kg，口服）可减弱血浆肿瘤坏死因子活性的升高并保护小鼠免受肝损伤。在大鼠模型中，E3330（100 mg/kg，口服）还可保护大鼠免受内毒素加半乳糖胺诱导的严重肝损伤。

Trypan Blue Exclusion Assay 台盼蓝排斥试验[2]
请参阅我们之前的报告。总之，将2×105个PANC1细胞放置在12孔板的一个孔中，用5至30μmol/L的E3330处理。在培养24、48和72小时后，用PBS洗涤细胞并用台盼蓝染色，通过计数活细胞数来检查细胞存活率。

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流式细胞术检测活性氧[2]
如上所述进行活性氧（ROS）的流式细胞术检测。简而言之，PANC1细胞用20μmol/L的E3330处理2天，随后用PBS洗涤并重新悬浮在完全培养基中，然后在37°C下用0.5μmol/L的二氢罗丹明123孵育30分钟。通过流式细胞术测定ROS荧光强度，激发波长为490 nm，发射波长为520 nm。

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用PEO碘乙酰基生物素“阳性标记”氧化硫醇的SHP-2氧化测定[2]
如前所述，SHP-2氧化是通过氧化硫醇的“阳性标记”来测量的。总之，PANC1细胞被血清饥饿，随后用E3330刺激2小时。然后，E3330处理的细胞在厌氧室中在25°C下裂解1小时。所有游离硫醇均用10 mmol/L NEM和10 mmol/L碘乙酰胺掩蔽。在厌氧室中用4 mmol/L DTT还原可逆氧化的硫醇，然后用0.5 mmol/L PEO碘乙酰基生物素标记。通过辣根过氧化物酶偶联的链霉抗生物素蛋白和增强化学发光的蛋白质印迹检测生物素掺入免疫沉淀的SHP-2。

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HIF-1αDNA结合ELISA检测[2]
使用购自Active Motif的HIF-1αDNA结合ELISA检测试剂盒评估HIF-1α的DNA结合。如所述评估HIF-1αDNA结合。用不同剂量的E3330处理PANC1或XPA1细胞6小时。然后，收获细胞并分离全细胞蛋白。ELISA检测程序按照制造商的方案进行。

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Ape1是一种具有DNA修复和转录因子氧化还原调节双重功能的分子。在Ape1缺陷小鼠中，胚胎不能存活超过胚胎第9天，这表明这种分子是正常胚胎发育所必需的。目前，缺乏Ape1在调节造血中作用的直接证据。我们使用胚胎干细胞分化系统和siRNA方法敲低Ape1基因表达，以测试Ape1在造血中的作用。当Ape1基因表达被Ape1特异性siRNA敲低时，ES细胞的成血管细胞发育减少了2到3倍，原始和最终的造血也是如此。在siRNA处理的细胞中，造血功能受损与细胞凋亡增加无关。为了开始探索Ape1调节造血的机制，我们发现用E3330（一种特异性Ape1氧化还原抑制剂）抑制Ape1的氧化还原活性，而不是用小分子甲氧基胺阻断的Ape1 DNA修复活性，会影响细胞因子介导的成血管细胞的体外发育。总之，这些数据表明Ape1在正常的胚胎造血中是必需的，并且Ape1的氧化还原功能，而不是修复核酸内切酶活性，在正常的胚造血发育中是至关重要的[1]。

流式细胞术细胞周期分析[2]
对用E3330（10、20或30μmol/L）孵育48小时的PANC1细胞进行细胞周期分析。细胞在冷冻甲醇中固定过夜，然后在20μg/mL RNase和0.1%NP-40 存在下用碘化丙啶（50 Ag/mL）染色。染色后立即使用FACScan进行分析。

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NF-κB报告物检测[2]
转染前一天，PANC1或XPA1细胞以每孔1×105的密度铺在24孔板上。用Fugene 6转染试剂瞬时转染细胞，该试剂含有950 ng NF-κB报告质粒（pNF-κB-Luc）和50 ng构建体，该构建体在组成型活性胸苷激酶启动子（pRL-TK）的控制下指导肾荧光素酶的表达。转染后24小时，用不同剂量的E3330处理细胞6小时，并根据制造商的说明使用双荧光素酶报告检测系统测量荧光素酶活性。

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体外迁移试验[2]
三种表达APE1的癌症细胞（PANC1、XPA1和BxPC3）的迁移使用直径为6.5毫米、带有8μm孔过滤器的室（Trans-well，24孔细胞培养物）进行测定，如所述。将癌症胰腺细胞以2×105/mL的浓度悬浮在无血清培养基中。然后，将0.2mL细胞悬浮液添加到上腔，并将0.5mL含有100ng/mL基质细胞衍生因子-1的无血清培养液添加到下腔。将不同浓度的E3330加入上室。在5%CO2/95%空气的潮湿环境中，将腔室在37°C下孵育12小时。孵育后，固定过滤器并用Diff-Quick试剂染色。对上腔裂解物进行细胞存活率（MTT）测定，以使E3330诱导的生长抑制（细胞数量减少）对迁移读数的任何影响正常化。用棉签刮两次过滤器的上表面，以去除不迁移的细胞。在三个重复的孔中重复实验，并在放大倍数为×400的显微镜下对每个过滤器的五个高功率场中的迁移细胞数量进行计数。

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3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物含量测定[2]
E3330粉末用纯乙醇溶解。PANC1、XPA1或HPNE细胞在96孔板中与不同浓度的E3330（10-30μmol/L）或甲氧基胺（1μmol/L-10 mmol/L）一起孵育72小时。在研究结束时，通过测量四唑盐3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑盐（MTT）转化为如前所述的有色甲赞产物的线粒体依赖性转化来评估细胞存活率。进行类似的分析以评估在E3330存在下ESA阳性原发性胰腺癌症细胞的生长，不同之处在于MTT测定在48小时达到峰值。

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将 PANC1 细胞插入 12 孔板的一个孔后，用 5 至 30 μM E3330 处理。培养 24、48 和 72 小时后，用 PBS 冲洗细胞，用台盼蓝染色，并通过计数活细胞数量评估其活力。

E3330 [(2E)-3-[5-(2,3-二甲氧基-6-甲基-1,4-苯并喹啉酰基)]-2-壬基-2-丙烯酸] 是一种新合成的保肝醌衍生物。我们研究了E3330在三种不同的内毒素（脂多糖）诱导的小鼠肝炎模型中的保护作用及其可能的作用机制，其中肿瘤坏死因子被认为在发病机制中起着关键作用。其中一种模型是通过静脉注射脂多糖联合D-半乳糖胺诱导小鼠肝炎。口服E3330预处理提高了存活率，并减弱了存活小鼠血浆转氨酶活性的升高。另外两种模型是通过静脉注射脂多糖或D-半乳糖胺与脂多糖的混合物诱导痤疮丙酸杆菌感染的小鼠肝炎。在这两种模型中，注射后3小时内即可在血浆中检测到肿瘤坏死因子。口服E3330预处理减弱了血浆肿瘤坏死因子活性的升高，并保护小鼠免受肝损伤。此外，E3330在体外脂多糖刺激下，抑制了痤疮丙酸杆菌诱导的小鼠腹腔巨噬细胞产生肿瘤坏死因子。这些结果表明，E3330抑制肿瘤坏死因子的产生是其在内毒素介导的小鼠肝炎模型中发挥保护作用的主要机制。[4]

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研究人员在F344大鼠半乳糖胺诱导的肝炎模型中，研究了一种新型醌类衍生物E3330（(2E)-3-[5-(2,3-二甲氧基-6-甲基-1,4-苯并喹啉酰基)]-2-壬基-2-++ +丙烯酸）的作用。在该模型中，内源性内毒素被认为起着关键的致病作用。皮下注射300 mg/kg半乳糖胺可导致大鼠肝损伤。在半乳糖胺激发后1小时口服E3330（10-100 mg/kg）可减轻肝损伤。在半乳糖胺激发后6或12小时口服E3330也有效。皮下注射1000 mg/kg半乳糖胺可导致大鼠出现更严重的肝损伤和内毒素血症。在半乳糖胺激发后24至48小时可检测到血浆内毒素。血浆内毒素水平的升高时间与血浆转氨酶活性的升高时间吻合良好。E3330（100 mg/kg）可显著减轻肝损伤，但对内毒素水平无影响。外源性内毒素可增强半乳糖胺的肝毒性。E3330预处理也可保护大鼠免受内毒素联合半乳糖胺引起的严重肝损伤。这些结果表明，E3330 可能通过抑制内毒素在半乳糖胺诱导的大鼠肝炎中的作用而发挥其保肝作用。[5]

悬浮于 0.5% 甲基纤维素溶液中；300 mg/kg；口服

内毒素介导的肝炎小鼠

[1]. Blood . 2007 Mar 1;109(5):1917-22.

[2]. Mol Cancer Ther . 2008 Jul;7(7):2012-21.

[3]. PLoS One . 2013 Aug 15;8(8):e70909.

[4]. J Pharmacol Exp Ther . 1992 Jul;262(1):145-50.

[5]. J Pharmacol Exp Ther . 1993 Jan;264(1):496-500.

APE1/Ref-1氧化还原抑制剂APX3330是一种口服生物利用度高的无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1/氧化还原效应因子-1 (APE1/Ref-1; APEX1)抑制剂，具有潜在的抗血管生成和抗肿瘤活性。给药后，APE1/Ref-1抑制剂APX3330选择性地靶向并结合APE1/Ref-1。这通过阻止多种APE1/Ref-1依赖性致癌转录因子（TFs）的还原和激活来抑制APE1/Ref-1的氧化还原依赖性信号传导活性，这些转录因子包括核因子κB (NF-κB)、AP-1、STAT3、p53、NRF2和HIF-1α，它们参与信号传导、细胞增殖、肿瘤进展和癌细胞存活。因此，该药物抑制多种转录因子介导的信号通路激活，从而抑制肿瘤细胞增殖和存活。APE1/Ref-1 是一种在多种癌细胞中过表达的多功能蛋白，它作为转录因子激活的氧化还原调节因子以及 DNA 损伤后的碱基切除修复的关键机制发挥作用。它驱动癌细胞增殖、迁移、耐药性、血管生成和炎症反应，其表达水平与肿瘤侵袭性增强和患者生存期缩短相关。APX3330 特异性阻断 APE1/Ref-1 的氧化还原活性，但不影响其作为 DNA 修复内切酶的功能。AP 内切酶 1 (APE1；也称为 REF-1) 包含一个 DNA 修复结构域和一个氧化还原调节结构域。APE1 在多种人类癌症中过表达，APE1 功能的破坏会对癌细胞的存活产生不利影响。然而，氧化还原结构域和 DNA 修复结构域在维持癌细胞稳态中的选择性作用尚未阐明。在本研究中，我们使用APE1氧化还原结构域功能的小分子抑制剂E3330，来探究持续氧化还原功能在胰腺癌中的功能相关性。我们发现E3330在体外显著抑制人胰腺癌细胞的生长。通过小干扰RNA（siRNA）敲低胰腺癌细胞中APE1的表达，进一步证实了这一现象。此外，缺氧会增强E3330的生长抑制作用，并伴有缺氧诱导因子-1α（HIF-1α，一种缺氧诱导的转录因子）DNA结合能力的显著抑制。E3330处理促进胰腺癌细胞内源性活性氧（ROS）的生成，由此产生的氧化应激与SHP-2（一种重要的蛋白酪氨酸磷酸酶，其活性状态可促进癌细胞增殖）的氧化态（即失活状态）水平升高有关。最后，体外趋化因子检测结果表明，E3330 处理可抑制胰腺癌细胞的迁移。E3330 在胰腺癌中表现出多种功能层面的抗癌特性，例如抑制癌细胞的生长和迁移。通过药物手段抑制 APE1 的氧化还原功能有望成为该疾病的一种有前景的治疗策略。[2] APE1/Ref-1 是细胞对氧化应激反应的主要调节因子，其通过 DNA 修复功能和对 NF-κB 转录因子的共激活活性发挥作用。APE1 在通过调节细胞因子表达来控制基于氧化应激的炎症过程中起着核心作用，其过表达是包括肝癌在内的多种肿瘤产生化疗耐药性的原因。我们研究了 APE1 过表达在与脂肪酸积累相关的肝细胞损伤中的功能作用，以及 APE1 氧化还原功能在炎症过程中的作用。将功能性和非功能性APE1编码质粒稳定转染至HepG2细胞，并检测APE1过表达对基因毒性化合物或脂肪酸（FAs）积累的保护作用。在有或无APE1氧化还原抑制剂E3330的情况下，用TNF-α刺激JHH6细胞。通过荧光素酶报告基因检测评估IL-8启动子活性，通过实时定量PCR检测基因表达，并通过ELISA检测细胞因子（IL-6、IL-8、IL-12）水平。APE1过表达并未阻止脂质积累诱导的细胞毒性。E3330处理通过改变APE1亚细胞转运抑制NF-κB的功能性激活，并通过阻断NF-κB的氧化还原介导激活，降低TNF-α和脂肪酸积累诱导的IL-6和IL-8表达。肝癌细胞中观察到的 APE1 过表达可能反映了细胞对损伤的适应性反应，并可能导致细胞对化疗产生耐药性以及炎症反应的发生。抑制 APE1 氧化还原活性可有效阻断 TNF-α 和脂肪酸诱导的炎症反应，这为治疗炎症性肝病开辟了新的前景。[3]

C21H30O6

378.46

378.204

C, 66.65; H, 7.99; O, 25.36

136164-66-4

6439397

Yellow to orange solid powder

1.1±0.1 g/cm3

542.2±50.0 °C at 760 mmHg

183.2±23.6 °C

0.0±3.1 mmHg at 25°C

1.517

4.5

89.9

1

6

12

27

666

0

CCCCCCCCC/C(C(O)=O)=C\C1=C(C)C(C(OC)=C(OC)C1=O)=O

AALSSIXXBDPENJ-FYWRMAATSA-N

InChI=1S/C21H30O6/c1-5-6-7-8-9-10-11-12-15(21(24)25)13-16-14(2)17(22)19(26-3)20(27-4)18(16)23/h13H,5-12H2,1-4H3,(H,24,25)/b15-13+

(2E)-2-[(4,5-dimethoxy-2-methyl-3,6-dioxocyclohexa-1,4-dien-1-yl)methylidene]undecanoic acid

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.50 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。