P-glycoprotein (Pgp); breast cancer resistance protein (BCRP)

786-O 细胞的细胞活力受到 elacradar 盐酸盐（0.001-1 μM；2 小时）的抑制[2]。 MCF-7 和 786-O 细胞系中的 P-糖蛋白和 ABCG2 蛋白表达水平受到 elacridar 盐酸盐（5 μM；24 小时）的影响[2]。在 MCF-7 和 786-O 细胞中，elacridar 盐酸盐（5 μM；24 小时）会影响 99mTc-MIBI 的细胞内积累[2]。

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研究人员假设，Elacridar（P-糖蛋白和ABCG 2的双重抑制剂）对多药耐药转运蛋白的抑制可能会克服实验性肾细胞癌对舒尼替尼的耐药性。人肾癌细胞系786-O、ACHN和Caki-1单独或联合用舒尼替尼或依拉克里达治疗。研究显示，Elacridar显著增强了舒尼替尼对786-O细胞的细胞毒性。通过P-糖蛋白功能测定证实，发现依拉克里达抑制P-糖蛋白活性。ABCG2在所有肾癌细胞系中的表达均较低，仅在786-O细胞中通过联合治疗受到抑制。舒尼替尼单独或与依曲达联合使用可抑制ABCG2功能，但依曲达单独使用则不能。这些发现表明，舒尼替尼的耐药性涉及多药耐药转运蛋白，与依拉克里达联合使用可以通过P-糖蛋白抑制在肾癌细胞中逆转。

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Elacridar使786-O细胞对舒尼替尼诱导的细胞毒性敏感[2]
在这项试验中，我们评估了依拉克里达逆转多药耐药性的疗效。与每种单一治疗相比，Elacridar和舒尼替尼的联合治疗显著降低了786-O和ACHN的细胞存活率，并且呈Elacridar浓度依赖性（图1）。在相同的治疗下，包括联合用药，MCF-7或Caki-1细胞中没有观察到这些作用。这些结果表明，Elacridar/依拉克里达能够逆转与临床抗癌药物舒尼替尼相关的P-糖蛋白和/或ABCG2介导的多药耐药性。

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蛋白质印迹法检测P-糖蛋白和ABCG2[2]
Western blot分析显示，细胞间P-糖蛋白和ABCG2蛋白的表达模式存在差异。如图3所示，结果与我们的推测一致，即786-O细胞中P-糖蛋白的表达高于其他细胞系，尽管没有显著差异。此外，缺氧条件下786-O细胞中P-糖蛋白的表达增加了2倍。在Caki-1和MCF-7细胞中，其表达保持稳定。与MCF-7相比，RCC细胞（Caki-1和786-O）中的ABCG2蛋白相对较低，在缺氧条件下有显著差异。此外，还研究了舒尼替尼和依拉克里达对P-糖蛋白（图4A）和ABCG2（图4B）表达的影响。这两种药物都以5µM的浓度作为单一治疗或联合治疗（每种5µM）进行了测试。如图5所示，舒尼替尼和依拉克里达的组合导致786-O中ABCG2的表达显著降低，表明依拉克里达尔能够抑制舒尼替尼刺激的该蛋白的过表达，而P-糖蛋白的表达没有改变。

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99mTc-MIBI对多药耐药P-糖蛋白转运功能的体外成像[2]
为了研究Elacridar使786-O细胞对舒尼替尼敏感的潜在机制，我们使用P-糖蛋白底物99mTc-MIBI作为放射性示踪剂来观察功能性P-糖蛋白的表达。MCF-7和786-O细胞分别用预定浓度的舒尼替尼（5µM）或依来昔达（5µM）单独或组合（每种5µM的浓度）处理24小时。细胞用99mTc-MIBI处理，并对γ辐射进行计数，以确定99mTc-MIBI在每个细胞系中的积累。因此，完整的MCF-7细胞显示出较高的99mTc-MIBI积累，而786-O细胞显示出几乎可以忽略不计的放射性示踪剂（图5A）。这些结果表明，786-O细胞在提取P-糖蛋白方面表现更好，这与蛋白质印迹分析的结果一致，蛋白质印迹分析表明，786-O-细胞与MCF-7细胞相比，这种转运蛋白的表达更高（图3）。正如预测的那样，我们注意到，在单独或与舒尼替尼联合使用Elacridar后，786-O细胞中99mTc-MIBI的细胞内积累呈剂量依赖性增加（图5B）。舒尼替尼单次治疗导致786-O细胞内99mTc-MIBI水平略有升高，尽管这种影响不如依拉克里达治疗后明显。99mTc-MIBI累积在60分钟内的增加是时间依赖性的。我们观察到，在60分钟时，幼稚786-O细胞和联合处理的细胞之间99mTc-MIBI的积累差异约为7倍。正如预测的那样，用依拉克里达处理MCF-7细胞对细胞内99mTc-MIBI的积累没有影响。舒尼替尼和依拉克里达均未改变Caki-1细胞中99mTc-MIBI的细胞内水平，其中P-糖蛋白表达与786-O细胞相比相对较低（数据未显示）。

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基于流式细胞术的ABCG2转运蛋白表达和功能检测方法[2]
为了评估ABCG2转运蛋白在786-O细胞中的功能，并评估舒尼替尼和Elacridar作为该转运蛋白体外抑制剂的效力，我们使用了叶绿素分解代谢物Ph A，据报道它是测量ABCG2功能的特异性探针（Robey等人，2004）。流式细胞术分析显示，用25µM依拉克里达处理细胞后，786-O细胞中Ph A的积累增加了约5倍。此外，在5µM的剂量下，舒尼替尼导致的Ph a积累是未治疗对照组的10倍（图6）。与单用依拉克里达处理的细胞相比，联合治疗似乎进一步增加了积累，尽管这与单用舒尼替尼处理的细胞中观察到的水平几乎相同。该测定也在MCF-7中进行，单独暴露于舒尼替尼治疗会使Ph A的积累增加12倍。用舒尼替尼处理的ACHN细胞积累的Ph-A比对照组高14.5倍（数据未显示）。这些结果表明，舒尼替尼导致肾细胞癌细胞内Ph a水平呈剂量依赖性增加。在这种情况下，依拉克里达的活性低于舒尼替尼，尽管它对P-糖蛋白功能的抑制作用更强。

Elacridar 盐酸盐（100 mg/kg；腹腔注射）在血浆和大脑中的分布不同[1]。 1.19 盐酸依拉立达小鼠血浆药代动力学参数[1]。 AUC0-inf (μg·min/ml) 1460 90.3 161.4 F 0.22 0.013 1 小鼠 PO 100 mg/kg 小鼠 IP 100 mg/kg 小鼠 IV 2.5 mg/kg CL/F (ml/min) 2.05 33.2 0.46 Vd/F (升) 3.5 12.3 0.17 t1/2 (h) 20 4.3 4.4

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静脉注射Elacridar。[1]
在静脉注射FVB野生型小鼠后，研究了依拉克里达在血浆和脑中的分布。血浆浓度呈双指数下降，表明存在明显的分布和消除阶段（图1A）。静脉注射给药后0.5小时内，脑中的浓度迅速达到峰值，在第一个测量时间点0.5小时观察到最大浓度（Cmax）。脑与血浆浓度比在初始时间点（长达2小时）很高，此后随着脑中浓度比血浆中浓度下降得更快而降低（图1B）。这与观察到的血浆中4.4小时和脑中1.5小时的t1/2终点一致（表1）。总血浆清除率估计为0.46ml/min。20-g小鼠的肝脏血流量为1.8ml/min（Davies和Morris，1993），这意味着依拉克里达在小鼠体内的肝脏提取率最多为低至中等。从时间零点到无穷大的AUC（AUC0-inf）在血浆中为161μg·min/ml，在脑中为131μg·min/ml。由此产生的脑Kp比值为0.82，表明在静脉注射2.5mg/kg后，依拉克里达作为血浆大致等量地分配到脑中。

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Elacridar腹膜内给药。[1]
在FVB野生型小鼠中测量腹腔注射100mg/kg剂量后的血浆和脑浓度。腹腔给药后，除给药后4小时外，所有测量时间点的脑浓度均显著低于血浆浓度（图2A）。在所有测量的时间点，相应的脑与血浆浓度比均小于1（图2B）。值得注意的是，静脉注射后的血浆浓度高于腹腔注射后的最大血浆浓度，在静脉注射后，我们观察到脑与血浆的浓度比大于1。依拉克里达的脑分布比（即分配系数）可能取决于其血浆水平。腹腔注射后观察到的血浆Cmax为0.295±0.06μg/ml，脑Cmax为0.061±0.024μg/ml。通过非房室分析，表观血浆清除率（Cl/F）估计为33 ml/min。血浆中AUC0-inf为90.3μg·min/ml，脑中为43.5μg·min/ml。非房室分析后，依拉克里达的消除期t1/2在血浆中估计为4.3小时，在脑中估计为9.2小时。Kp比值为0.48，表明腹膜内给药后进入大脑的分配较低，即使剂量比静脉内给药高40倍。

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口服Elacridarr。[1]
在FVB野生型小鼠口服100mg/kg剂量后，研究了依拉克里达的脑和血浆药代动力学。给药后1小时，脑浓度低于血浆浓度，之后脑浓度比血浆浓度高几倍（图3A）。口服给药后的脑与血浆比值在初始时间点小于1，然后增加，在给药后4小时达到最大值约6，然后缓慢下降（图3B）。血浆和脑浓度-时间数据的非房室分析显示，血浆AUC0-inf为1460μg·min/ml，脑AUC0-inf为6296μg·min/ml（表1）。口服给药后脑内Cmax为4.34±0.79μg/ml，明显高于腹腔给药后的Cmax。血浆中达到Cmax的时间为4小时，表明肠道的溶解和吸收缓慢。口服给药后，发现脑Kp为4.31，表明口服高剂量依拉克里达在脑中分布很广。口服给药后，药物在大脑中的t1/2反映了其血浆t1/2，值分别为19.8和15.6小时。

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腹膜内和口服给药/Elacridar后生物利用度的测定。[1]
绝对生物利用度是通过腹腔或口服给药后的剂量标准化AUC与静脉给药后剂量标准化的AUC之比来确定的（表2）。混悬剂腹腔给药后的生物利用度为1.3%，口服给药后为22%。腹腔给药后的生物利用度非常低，表明腹腔给药可能不是使用这种简单的悬浮制剂获得可重复的依拉克里达血浆和脑暴露的有利给药途径。口服依拉克里达后的生物利用度高于腹腔注射等剂量后的生物使用度；这可能是由于更大的溶剂可用性或胆汁盐的胶束效应增强了肠道中的溶解。口服依拉克里达后的t1/2大约是静脉注射或腹腔注射后的5倍。依拉克里达的吸收、分布和消除可能存在非线性。然而，在计算生物利用度时，假设药物的清除率不会随着药物血浆暴露量的增加而变化。

Elacridar的液相色谱-串联质谱分析。 采用高效液相色谱-质谱联用技术测定小鼠血浆和脑中Elacridar的浓度。将冷冻的脑样本解冻，并使用组织匀浆器用3倍体积的5%牛血清白蛋白均质化。将50微升血浆和100μl脑匀浆中加入20 ng内标酪氨酸磷酸酶（AG 1478）和100μl pH 11的缓冲液（0.1 M氢氧化钠和0.04 M碳酸氢钠）。通过用1ml乙酸乙酯剧烈涡旋5分钟，然后在4°C下以7500 rpm离心15分钟来提取样品。将600微升有机层转移到微量离心管中，用温和的氮气流干燥。样品在100μl流动相中复溶，并转移到自动进样瓶中。使用保持在10°C的温度控制自动取样器注入5-μl体积。使用安捷伦科技公司Eclipse XDB-C18 RRHT螺纹柱（内径4.6 mm×12.5 mm，5μ）进行色谱分析。流动相由乙腈：20 mM甲酸铵（含0.1%甲酸）（42:58 v/v）组成，流速为0.25 ml/min。使用Thermo Finnigan TSQ Quantum 1.5检测器监测洗脱液。该仪器配备了电喷雾接口。样品被电喷雾探针电离，并在4500 V的喷雾电压下以正电离模式对样品和内标进行分析。光谱仪被编程为允许m/z 564.6的依拉克里达[MH+]离子和m/z 316.67的内标[MH+]i离子通过第一四极杆（Q1）并进入碰撞室（Q2）。Elacridar的碰撞能量设定为39V，tyrphostin的碰撞能量为9V。通过四极杆3（Q3）监测依拉克里达（m/z 252.9）和内标（m/z 300.9）的产物离子。用于监测两种产物离子的扫描宽度和扫描时间分别为m/z 1.5和0.5秒。该测定在2.5至1500 ng/ml的范围内精确且线性（所有浓度的CV均小于10%）。

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锝-99m标记的甲氧基异丁基异腈（99mTc-MIBI）体外摄取研究[2]
99mTc-MIBI被用作P-糖蛋白的转运底物（Piwnica Worms等人，1993）。在生理盐水中获得Na99mTcO4作为商业99Mo/99mTc发生器洗脱液，并通过将Na99mTcO4加入MIBI试剂瓶中并在95°C下加热混合物15分钟来制备99mTc-MIBI。用盐水将放射性药物稀释至10 MBq/ml。将细胞以每皿2.0×106的密度接种到100毫米的培养皿中。孵育24小时后，吸出培养基，用含有适当浓度药物的5%FBS的10ml培养基替换。再孵育24小时后，彻底吸出上清液，制备5.0×105个细胞/ml的单细胞悬浮液。使用在37°C下孵育的5.0×105个细胞/ml的单细胞悬浮液研究了99mTc-MIBI在MCF-7、Caki-1、ACHN和786-O细胞中积累的时间过程。将80µl 99mTc-MIBI的等分试样加入含有5ml细胞悬浮液的小瓶中，在加入示踪剂后，将细胞在37°C下孵育1、15、30、60和90分钟。从每个小瓶中取出400µl的重复样品，转移到含有500µl冰冷盐水的1.5ml微量离心管中，然后在14000g下离心2分钟。吸出上清液，将细胞沉淀小心地重新悬浮在900µl冰冷盐水中，并使用γ细胞计数器测定放射性。生成舒尼替尼和Elacridar的剂量反应曲线，然后使用校准的伽马计数器测量放射性（Ballinger等人，1996）。通过测量细胞颗粒中的放射性，确定了细胞内相对于细胞外的放射性积聚（Cin/Cout）。

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流式细胞术测量Ph A摄取量[2]
通过流式细胞术使用荧光化合物脱镁叶滨A（Ph A）测定ABCG2转运蛋白的表达，该化合物根据小鼠Amcg2-/-敲除研究被鉴定为ABCG2底物。细胞被胰蛋白酶消化，3.0×105个细胞在37°C、5%CO2、10µM Ph A、所需浓度的舒尼替尼或Elacridar的完全培养基（含10%FBS的无酚红DMEM）中孵育30分钟。然后用冷的完全培养基洗涤细胞，然后在37°C的无Ph A完全培养基中孵育1小时。随后用冷完全培养基洗涤细胞，然后在37°C的无Ph A完全培养基中孵育1小时。最后，用冷PBS洗涤细胞两次，并通过流式细胞术测定荧光。共收集了2.0×104个事件，并通过控制正向散射和侧向散射来消除碎片。用480nm的激发波长和530nm的发射波长分析细胞内荧光。

细胞活力测定[2]
细胞类型： 786-O 细胞
测试浓度： 2.5 和 5 μM
孵育时间： 2 hrs（小时）
实验结果： 剂量依赖性地抑制 786-O 细胞的细胞活力，并且添加 sunitnib 后表现出更好的抑制效果。

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蛋白质印迹分析[2]
细胞类型： MCF-7、Caki-1 和 786-O 细胞系
测试浓度： strong> 5 μM
孵育时间： 24 小时
实验结果： 786-O 细胞中 P-糖蛋白表达水平降低，ABCG2 增加Caki-1细胞中的蛋白质表达水平。

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细胞活力测定[2]
细胞类型： MCF-7 和 786-O 细胞系
测试浓度： 5 μM
孵育持续时间：24 小时
实验结果：MCF-7 和 786-O 细胞中 99mTc-MIBI 细胞内积累呈剂量依赖性增加。

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细胞毒性试验（MTT法）[2]
为了检查舒尼替尼和Elacridar的联合抗细胞增殖作用，将每孔3.0×103个细胞接种在96孔板上。孵育24小时后，将舒尼替尼、Elacridar或每种组合的最佳浓度梯度加入每个孔中，然后培养48小时。最后，根据制造商的说明，使用增殖试剂MTT评估细胞存活率。对照细胞仅用0.1%DMSO的载体处理。在最后一次孵育后，吸出培养基，将沉淀的甲赞晶体溶解在DMSO（100μL/孔）中。在540nm处测量每个孔的吸光度，并用multiskan JX酶标仪读取650nm的参考波长。细胞活力以对照值的百分比计算。

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蛋白质印迹分析[2]
免疫印迹法检测多药耐药蛋白的表达。细胞以每60 mm培养皿2.5×105个细胞的密度铺板，并允许其粘附24小时。然后将细胞与舒尼替尼或单独或组合的Elacridar在5%FBS培养基中孵育24小时。在常氧或缺氧条件下分析每个细胞的基础表达，而在常氧条件下分析药物处理的细胞。细胞在含有0.5 M Tris-HCl、100 mMβ-磷酸甘油酯、3 M NaCl、50 mM EDTA、100 mM Na3VO4和10%Triton-X的冰冷缓冲液中裂解，通过在4°C下以12000g离心20分钟来清除裂解物，并使用以BSA为标准的DC蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。ABC亚家族成员2的蛋白质裂解物以25-30µg的浓度装载，每条泳道的P-糖蛋白为5060µg，在通过罐转移电泳转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上之前，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行解析。分析P-糖蛋白的细胞裂解物通过7.5%SDS-PAGE解析，而分析ABCG2的细胞裂解液通过10%SDS-PAGE解析。通过在5%脱脂乳中孵育膜来阻断非特异性抗体结合。然后，在4°C下以1:1000的比例在1%的牛奶中稀释1小时，用第一单克隆抗体（P-糖蛋白，小鼠抗体：在室温下以1:500的比例稀释1%的牛奶，ABCG2，兔抗体）顺序探测膜过夜。随后，用含吐温20（TBS-T）的tris缓冲盐水洗涤膜，然后用辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗孵育（小鼠二抗：在室温下以1:1000稀释于1%牛奶中1小时，兔二抗：室温下以1:2000稀释于1%奶中1小时）。

动物/疾病模型： FVB 野生型小鼠[1]
剂量： 100 mg/kg
给药途径： 腹腔注射 (ip)；100 mg/kg，单次
实验结果： 除给药后 4 小时外，脑组织中的药物浓度高于血浆浓度。

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伊拉克达的静脉给药。[1]
伊拉克达静脉给药溶液于实验当天配制，方法是将伊拉克达溶解于二甲基亚砜、丙二醇和生理盐水（体积比 2:2:1）的溶剂中，浓度为 1.25 mg/ml。FVB 野生型小鼠经尾静脉注射 2.5 mg/kg（2 μl 体积/g 体重）的伊拉克达。给药后0.5、1、2、4和8小时采集血液和脑组织（每个时间点n=4）。使用二氧化碳室对动物实施安乐死。通过心脏穿刺采集血液，并在4℃下以7500 rpm离心10分钟获得血浆。迅速取出整个脑组织，并用冰冷的生理盐水冲洗。脑组织立即用液氮速冻。样本储存在-80℃直至进行液相色谱-串联质谱分析。

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腹腔注射和口服给药Elacridar。[1]
实验当天制备用于腹腔注射和口服给药的Elacridar，方法是使用0.5%羟丙基甲基纤维素和1%吐温80制备稳定的Elacridar悬浮液，得到浓度为10 mg/ml的制剂。小鼠腹腔注射给药，剂量为100 mg/kg。口服给药方面，小鼠经口灌胃给予100 mg/kg剂量。分别于腹腔注射给药后15分钟、0.5小时、1小时、2小时、4小时和8小时，以及口服给药后0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、17小时和24小时采集血液和脑组织样本。血浆和脑组织样本的采集和处理方法与前文所述相同。

本研究旨在测定小鼠经不同给药途径后，血浆和脑组织中依拉克达（Elacridar，GF120918；N-(4-(2-(1,2,3,4-四氢-6,7-二甲氧基-2-异喹啉基)乙基)苯基)-9,10-二氢-5-甲氧基-9-氧代-4-吖啶甲酰胺）的生物利用度和分布情况。依拉克达是一种强效的P-糖蛋白和乳腺癌耐药蛋白抑制剂，已被用于研究这些外排转运蛋白对药物脑分布的影响。本研究采用口服或腹腔注射的方式，给予Friend白血病病毒B株小鼠100 mg/kg的依拉克达。以2.5 mg/kg的静脉注射剂量为参照，测定口服或腹腔注射依拉克达后的绝对生物利用度。在这些剂量下，口服给药的绝对生物利用度为0.22，腹腔注射给药的绝对生物利用度为0.01。依拉克达的终末半衰期在腹腔注射和静脉注射后约为4小时，口服给药后接近20小时。依拉克达的脑血浆分配系数（Kp,brain）随血浆暴露量的增加而增加，提示血脑屏障的外排转运蛋白已达到饱和。静脉注射、腹腔注射和口服给药后的Kp,brain分别为0.82、0.43和4.31。依拉克达水溶性低、亲脂性高，导致口服吸收不良，很可能是受溶解速率限制。这些结果表明，给药途径及其导致的血浆暴露量对于达到有效的血浆和脑组织药物浓度至关重要，并可作为未来开展依拉克达给药研究以及开发制剂策略以克服其吸收不良的指导。[1]

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依拉克达的静脉给药。[1]
本研究在FVB野生型小鼠中，研究了静脉注射依拉克达后其在血浆和脑组织中的分布情况。血浆浓度呈双指数下降，表明存在明显的分布相和消除相（图1A）。静脉给药后0.5小时内，脑组织中的药物浓度迅速达到峰值，最大浓度（Cmax）出现在0.5小时，即首次测量时间点。在初始时间点（2小时内），脑组织与血浆的浓度比值较高，之后随着脑组织中药物浓度下降速度快于血浆浓度而降低（图1B）。这与观察到的血浆中末端半衰期（t1/2）为 4.4 小时，脑组织中为 1.5 小时（表 1）的结果一致。总血浆清除率估计为 0.46 ml/min。20 克小鼠的肝脏血流量为 1.8 ml/min（Davies 和 Morris，1993），这意味着 elacridar 在小鼠体内的肝脏提取率至多为低至中等。血浆中从零到无穷大的 AUC（AUC0-inf）为 161 μg·min/ml，脑组织中为 131 μg·min/ml。由此得到的脑组织 Kp 比值为 0.82，表明静脉注射 2.5 mg/kg 后，elacridar 在脑组织和血浆中的分配大致相等。

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腹腔注射 elacridar。 [1] 在FVB野生型小鼠中，测定了腹腔注射100 mg/kg剂量后的血浆和脑组织浓度。腹腔注射后，除给药后4小时外，所有测定时间点的脑组织浓度均显著低于血浆浓度（图2A）。所有测定时间点的脑组织与血浆浓度比均小于1（图2B）。值得注意的是，静脉给药后观察到脑组织与血浆浓度比大于1时的血浆浓度高于腹腔注射后观察到的最大血浆浓度。依拉瑞达的脑组织分布比（即分配系数）可能取决于其血浆浓度。腹腔注射后血浆中观察到的Cmax为0.295 ± 0.06 μg/ml，脑组织中观察到的Cmax为0.061 ± 0.024 μg/ml。通过非房室模型分析，表观血浆清除率 (Cl/F) 估计为 33 ml/min。血浆中的 AUC0-inf 为 90.3 μg·min/ml，脑组织中的 AUC0-inf 为 43.5 μg·min/ml。非房室模型分析估计，elacridar 的消除相 t1/2 在血浆中为 4.3 小时，在脑组织中为 9.2 小时。Kp 比值为 0.48，表明即使剂量比静脉给药高 40 倍，腹腔给药后药物在脑组织中的分配也较低。

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Elacridar 的口服给药。[1]
在 FVB 野生型小鼠中，研究了口服 100 mg/kg 剂量 elacridar 后的脑和血浆药代动力学。给药后 1 小时内，脑组织浓度低于血浆浓度，之后脑组织浓度比血浆浓度高数倍（图 3A）。口服给药后，脑血浆比值在初始时间点小于1，随后逐渐升高，在给药后4小时达到约6的峰值，之后缓慢下降（图3B）。血浆和脑组织浓度-时间数据的非房室模型分析显示，血浆AUC_0-inf为1460 μg·min/ml，脑组织AUC_0-inf为6296 μg·min/ml（表1）。口服给药后脑组织C_max为4.34 ± 0.79 μg/ml，显著高于腹腔注射给药后的C_max。血浆C_max的达到时间为4小时，表明药物在肠道内溶解和吸收缓慢。口服给药后，脑组织K_p为4.31，提示口服高剂量依拉克达可使其在脑组织中分布广泛。口服给药后，药物在脑内的半衰期（t1/2）与其血浆半衰期（t1/2）相似，分别为19.8小时和15.6小时。

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腹腔和口服给药后生物利用度的测定。[1]
绝对生物利用度定义为腹腔或口服给药后剂量标准化AUC与静脉给药后剂量标准化AUC的比值（表2）。腹腔给药后的生物利用度为1.3%，口服混悬液后的生物利用度为22%。腹腔给药后的生物利用度极低，表明使用这种简单的混悬液制剂，腹腔给药可能并非获得可重复的血浆和脑暴露量的理想给药途径。口服给药后，依拉克达的生物利用度高于等剂量腹腔给药后的生物利用度；这可能是由于肠道内溶剂可用性增强或胆汁酸的胶束效应促进了药物溶解。口服依拉克达后的半衰期约为静脉或腹腔注射给药后的5倍。依拉克达的吸收、分布以及可能的消除可能存在非线性关系。然而，生物利用度的计算基于药物清除率不会随血浆药物暴露量的增加而改变的假设。

[1]. Brain distribution and bioavailability of elacridar after different routes of administration in the mouse. Drug Metab Dispos. 2012 Aug;40(8):1612-9.

[2]. Elacridar enhances the cytotoxic effects of sunitinib and prevents multidrug resistance in renal carcinoma cells. Eur J Pharmacol. 2015 Jan 5;746:258-66.

艾拉克达 (GW120918) 是一种口服生物增强剂，靶向肿瘤的多药耐药性。在许多情况下，癌症多药耐药性的出现是由于蛋白质抑制剂表达的改变。截至 2007 年 8 月，艾拉克达未列入葛兰素史克 (GSK) 的产品线。据推测，其研发已终止。

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药物适应症
用于治疗实体瘤。

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作用机制
P-糖蛋白是 MDR/TAP 亚家族中一种特征明确的人类 ABC 转运蛋白。它是一种 ATP 依赖性外排泵，具有广泛的底物特异性。它很可能是作为一种防御有害物质的机制而进化而来的。肠道中 P-糖蛋白表达增加会降低 P-糖蛋白底物药物的吸收。因此，生物利用度降低，无法达到治疗所需的血浆浓度。艾拉克达通过抑制P-糖蛋白发挥作用，从而提高联合用药的生物利用度。

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药效学
艾拉克达是一种口服生物增强剂，靶向肿瘤的多药耐药性。在许多情况下，癌症多药耐药性的出现是由于蛋白质抑制剂表达的改变。

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艾拉克达是P-gp和BCRP转运蛋白的第三代抑制剂（Hyafil等，1993；Witherspoon等，1996）。它已被用于确定P-gp和BCRP对P-gp和BCRP底物药物脑分布的影响（Breedveld等，2005；Bihorel等，2007；Chen等，2009；Agarwal等，2010，2011b）。也有研究表明，伊拉克达可作为一种提高舒尼替尼等药物治疗胶质瘤疗效的工具（Tang et al., 2012a）。本研究旨在探讨小鼠脑内和血浆中伊拉克达的药代动力学，并测定其口服和腹腔注射给药后的生物利用度。
伊拉克达的理化性质，例如溶解度低和亲脂性高，可能是导致本研究中观察到的血浆浓度差异的原因。这种个体间差异此前已在人体口服伊拉克达后观察到（Kuppens et al., 2007），并被归因于伊拉克达溶解度的差异。一项小鼠研究发现，尽管增加了剂量，但口服伊拉克达的溶解速率仍然是限制其血浆暴露量的因素之一（Ward 和 Azzarano，2004）。
口服给药是啮齿动物和人类的便捷给药途径，尤其适用于长期给药。研究表明，TKI舒尼替尼及其活性代谢物的脑渗透受到血脑屏障处P-gp和BCRP的限制。在野生型小鼠中，口服100 mg/kg剂量的伊拉克达可使舒尼替尼的脑渗透率提高近12倍（Tang等，2012a,b）。口服100 mg/kg剂量的伊拉克达后，其血浆和脑组织暴露量均显著高于腹腔注射给药后的暴露量。口服给药后，伊拉克达在脑内的分配系数为 4.31，表明口服该剂量后，伊拉克达能从体循环良好地分布到脑内。口服 100 mg/kg 剂量后的消除半衰期 (t1/2) 接近 20 小时，约为腹腔或静脉给药后 t1/2 的 5 倍。这种现象可能有多种原因。口服 t1/2 延长可能是由于溶解速率缓慢（鉴于其水溶性差），这限制了吸收速率，从而导致药物释放时间延长。因此，观察到的末端 t1/2 可能反映了较长的吸收半衰期（翻转动力学）。血浆中观察到的达峰时间 (Tmax) 为给药后 8 小时，这一发现支持了上述假设。t1/2 延长的另一个原因可能是由于伊拉克达血浆暴露量较高，导致药物的肝肾清除率发生变化。然而，体外实验表明，elacridar并非任何细胞色素P450酶的强效抑制剂（Ward和Azzarano，2004），其IC50值在微摩尔范围内。口服给药后的血浆AUC（剂量标准化）高于腹腔注射给药，从而导致更高的生物利用度。这可能是由于口服elacridar后抑制了肠道P-gp，从而提高了其在胃肠道的吸收，使其生物利用度高于腹腔注射给药。另一种可能的解释是口服elacridar后发生了肠肝循环，这可能导致AUC值高于预期。无论这些可能性如何，结果表明，口服高剂量elacridar可使血浆和脑组织中的药物暴露量均较高。Tang等人。 (2012a) 的研究表明，100 mg/kg 的剂量可能对小鼠有效，并指出该剂量给药未观察到明显的毒性。尽管本研究未评估毒性，但小鼠单次给药后未出现明显的依拉克达相关不良反应。然而，如果考虑长期给药方案，则不能忽视毒性问题，尤其考虑到该剂量下依拉克达的血浆浓度较高且半衰期较长（可能导致稳态下药物显著蓄积）。
腹腔注射也是长期给药的一种理想选择，尤其是在临床前研究中。与口服给药相比，腹腔注射依拉克达的小鼠在相同剂量下血浆暴露量显著降低。这很可能是由于药物在腹腔内的溶解和/或吸收不良所致。血浆和脑组织中的药物浓度也存在显著的动物间差异。虽然腹腔注射给药途径便于小鼠长期给药，但会导致伊拉克达血浆暴露量降低；因此，目前该混悬剂型的腹腔注射给药方案应用受限。在本研究中，腹腔注射100 mg/kg剂量后，Kp（脑组织AUC/血浆AUC）比值为0.48。Padowski和Pollack（2010）的一项类似研究中，腹腔注射10 mg/kg剂量后，Kp值为0.0784。综上所述，这些结果可能表明，随着剂量的增加，血浆和脑组织暴露量存在非线性关系，尤其是在腹腔注射给药后。
静脉注射给药后的暴露量被用作计算其他两种给药途径绝对生物利用度的参考值。静脉注射2.5 mg/kg剂量后，血浆和脑组织中elacridar的AUC值大致相等，Kp比值为0.82（表1）。尽管静脉注射后观察到elacridar在脑组织中分布广泛，但由于难以进行重复注射，静脉给药并非非导管小鼠长期给药的可行方案。此外，用于静脉给药的给药溶液不稳定，容易产生沉淀。
elacridar的生物利用度受限于其较差的理化性质。口服高剂量elacridar后的生物利用度约为22%，而腹腔注射相同剂量后的生物利用度仅约为1%。口服给药后血浆AUC高于腹腔注射给药可能是由于胆汁酸在肠道中的增溶作用所致。使用这种简单的混悬剂口服依拉瑞达似乎是达到有效抑制血脑屏障处 P-gp 和 BCRP 所需的血浆暴露量的最有效方法。
本研究发现，不同给药途径后依拉瑞达的脑渗透性存在显著差异。首先，依拉瑞达的 Kp 值（衡量其脑分布的指标）与其血浆暴露量相关（见图 4）。当血浆暴露量相对较高时（如口服和静脉给药后），Kp 比值大于 1，其中口服给药后 Kp 比值最高，约为 5，这与最高的血浆暴露量相符。腹腔注射给药后血浆暴露量相对较低，Kp 比值小于 1。其次，所有给药途径的脑/血浆浓度比值随时间变化曲线均显示，该比值先升高至最大值，然后下降（见图 1B、2B 和 3B）。这出乎意料，因为在组织分布达到稳态（假分布平衡）后，脑血浆浓度比应保持不变。对这两个发现的一种解释可能是P-gp和BCRP主动将依拉克达从脑组织中排出。依拉克达在血脑屏障处抑制这两种转运蛋白，其抑制机制可能是竞争性的（因为它是这两种转运蛋白的底物）。一项利用正电子发射断层扫描成像和转运蛋白敲除小鼠研究P-gp和BCRP对依拉克达在血脑屏障处分布的影响的研究表明了这一点（Kawamura等，2011a,b）。目前正在另一项研究中进一步探讨这一发现。然而，这确实解释了为什么脑暴露量取决于血浆浓度。当血浆浓度降至血脑屏障（BBB）外排饱和所需水平以下时，脑组织的净外排量将大于被动扩散进入脑组织的量。这将导致脑组织浓度下降速度快于相应的血浆浓度，最终导致脑血浆比值随时间呈下降趋势。[1]
同时服用依拉瑞达和P-gp及BCRP底物药物可改善其在血脑屏障内的分布，并可能提高疗效。如果我们考虑脑肿瘤侵袭边缘或正常脑组织中存在完整血脑屏障后方的靶细胞问题，那么研究依拉瑞达在脑内的药代动力学就显得尤为重要（Agarwal等，2011a）。依拉瑞达在脑组织中的分布可能有助于解决表达BCRP和P-gp因而对化疗耐药的靶细胞问题（Lu和Shervington，2008）。脑内Elacridar可能有效抑制存在于这些细胞上的P-gp和BCRP，从而使化疗药物能够作用于这些细胞，并可能预防肿瘤复发。采用Elacridar进行中枢神经系统靶向给药的方法还可以降低达到有效脑浓度所需的剂量，从而降低全身毒性。
Elacridar在临床前和临床应用中均受到限制，部分原因是其溶解度和生物利用度低。提高Elacridar的生物利用度和溶解度是亟待解决的问题。有几种可能的方法可以探索，包括合成水溶性前药、制备固体分散体以及使用表面活性剂、环糊精和渗透促进剂。
总之，本研究考察了Elacridar在小鼠血浆和脑组织中的药代动力学，并测定了其在不同给药途径后的生物利用度。这些实验的结果可以帮助指导未来研究中埃拉克里达的剂量和给药途径的选择。[1]

C34H33N3O5.HCL

600.1

599.219

C, 68.05; H, 5.71; Cl, 5.91; N, 7.00; O, 13.33

143851-98-3

Elacridar;143664-11-3

170320

Light yellow to yellow solid powder

701.6ºC at 760 mmHg

378.1ºC

1.57E-19mmHg at 25°C

6.373

92.89

3

7

8

43

925

0

COC1=CC=CC2=C1NC3=C(C2=O)C=CC=C3C(=O)NC4=CC=C(C=C4)CCN5CCC6=CC(=C(C=C6C5)OC)OC.Cl

IQOJZZHRYSSFJM-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C34H33N3O5.ClH/c1-40-28-9-5-7-26-32(28)36-31-25(33(26)38)6-4-8-27(31)34(39)35-24-12-10-21(11-13-24)14-16-37-17-15-22-18-29(41-2)30(42-3)19-23(22)20-37;/h4-13,18-19H,14-17,20H2,1-3H3,(H,35,39)(H,36,38);1H

N-[4-[2-(6,7-dimethoxy-3,4-dihydro-1H-isoquinolin-2-yl)ethyl]phenyl]-5-methoxy-9-oxo-10H-acridine-4-carboxamide;hydrochloride

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.08 mg/mL (3.47 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80+，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。