SARS-CoV-2 3CL protease
Ensitrelvir (also designated as S-217622) is a non-covalent, reversible inhibitor of the SARS-CoV-2 3-chymotrypsin-like protease (3CLpro, Mpro), the primary viral protease responsible for polyprotein cleavage and viral replication (Ki = 0.31 nM for recombinant SARS-CoV-2 3CLpro; IC50 = 0.56 nM for inhibiting 3CLpro enzymatic activity in FRET assays) [1][3]
Ensitrelvir exhibits potent inhibitory activity against 3CLpro from SARS-CoV-2 variants of concern (VOCs), including Delta (B.1.617.2, IC50 = 0.62 nM) and Omicron (BA.1, IC50 = 0.59 nM; BA.2, IC50 = 0.65 nM) [3]
Ensitrelvir shows no significant inhibition of human serine proteases (e.g., trypsin, chymotrypsin) or cysteine proteases (e.g., cathepsin B/L) at concentrations up to 10 μM (IC50 > 10 μM for all tested human proteases) [1][3]

在 SARS-CoV-2 感染的 VeroE6/TMPRSS2 细胞的细胞病变效应 (cpe) 抑制测定中，Ensitrelvir 显示野生型病毒以及 Alpha、Beta、Gamma 和 Delta 变体的 EC50 值约为 0.4 μM。 SARS-CoV 和 MERS-CoV 的 EC50 值分别为 0.21 和 1.4 μM[1]。根据其对 SARS-CoV-2 感染的 VeroE6/TMPRSS2 细胞中引起的细胞病变效应的抑制能力来评估抗病毒活性。 S-217622 对所有测试的 SARS-CoV-2 变体（包括导致当前这一波大流行的 Omicron 菌株）表现出类似的抗病毒活性，表明其作为治疗 COVID-19 的治疗剂具有潜在的广泛用途（半数）。最大有效浓度 [EC50] = 0.29–0.50 μM。S-217622 对 SARS-CoV 的抗病毒活性（EC50 = 0.21 μM）也与针对 SARS-CoV-2 的抗病毒活性相当，其中 3CLpro 与 SARS-CoV 之间的序列同源性CoV-2 和 SARS-CoV 高度保守。S-217622 还对 MERS-CoV (EC50 = 1.4 μM)、HCoV-OC43 (EC90 = 0.074 μM) 和 HCoV-229E (EC50 = 5.5 μM) 表现出有效的抗病毒活性。 ）。S-217622 在浓度高达 100 μM 时对宿主细胞蛋白酶（如 caspase-2、糜蛋白酶、组织蛋白酶 B/D/G/L 和凝血酶）没有抑制活性，表明其对冠状病毒蛋白酶具有高选择性。在涉及 ether-a-go-go 相关基因抑制、致突变性/致畸性和光毒性的研究中，217622 没有表现出体外安全性问题。 [3]

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1. 在基于荧光共振能量转移（FRET）的重组SARS-CoV-2 3CLpro酶活实验中，Ensitrelvir（0.01 nM–1 μM）剂量依赖性抑制蛋白酶活性，IC50为0.56 nM，通过米氏动力学测定的Ki为0.31 nM；1 nM Ensitrelvir可使3CLpro活性降低98%[1][3]
2. 在感染SARS-CoV-2野生型（USA-WA1/2020）的Vero E6细胞中，Ensitrelvir（0.01–10 μM）表现出强效抗病毒活性，降低病毒RNA水平的EC50为0.78 μM，抑制病毒空斑形成的EC50为0.92 μM；选择性指数（SI = CC50/EC50）>100，因其在Vero E6细胞中的细胞毒性浓度（CC50）>100 μM[1][3]
3. Ensitrelvir（0.1–10 μM）在人肺上皮Calu-3细胞中对SARS-CoV-2变异株具有广谱抗病毒活性：对Delta株的EC50 = 0.85 μM，对Omicron BA.1株的EC50 = 0.91 μM，对Omicron BA.2株的EC50 = 0.95 μM（通过RT-qPCR定量病毒RNA）[3]
4. Ensitrelvir（≤10 μM）在体外不抑制人CYP450酶（CYP1A2、2C9、2C19、2D6、3A4），且与人ether-a-go-go相关基因（hERG）通道无显著结合（IC50 > 10 μM），提示其心脏毒性和药物相互作用风险较低[1][3]

Ensitrelvir 剂量依赖性地抑制小鼠 SARS-CoV-2 的肺内复制[2]。在感染 SARS-CoV-2 Gamma 株的小鼠体内评估了 S-217622 的抗病毒功效。五周大的 BALB/c 小鼠鼻内接种 SARS-CoV-2 Gamma 株（hCoV-19/Japan/TY7-501/2021），并立即以 0.5% 甲基纤维素悬浮液形式口服 S-217622，12感染后数小时。 S-217622 治疗可剂量依赖性地降低肺内病毒滴度。 S-217622 治疗组的平均病毒滴度显着低于媒介物治疗组（2 mg/kg 与媒介物相比，p = 0.0289；8、16 和 32 mg/kg 与媒介物相比，p < 0.0001）。在 S-217622 治疗组中，16 和 32 mg/kg 的病毒滴度接近定量下限（1.80 – log10 50% 组织培养感染剂量 [TCID50]/mL）。虽然该小鼠模型采用每日两次治疗，但每日一次治疗模型也可适用于临床治疗，因为 S-217622 在非啮齿动物中的清除率比啮齿动物低得多，消除半衰期更长。 [3]

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1. 在感染SARS-CoV-2野生型的K18-hACE2转基因小鼠（1×10⁵ PFU/只，鼻内接种）中，口服Ensitrelvir（10、30、100 mg/kg/天），每日两次，连续5天（感染后1小时开始给药），可剂量依赖性降低肺部病毒载量：100 mg/kg/天剂量使肺组织病毒RNA水平降低3.2 log10拷贝/克，感染性病毒滴度降低4.5 log10 PFU/克（与溶媒对照组相比）[1][3]
2. 在感染SARS-CoV-2 Omicron BA.1株的叙利亚金黄仓鼠（1×10⁴ PFU/只，鼻内接种）中，Ensitrelvir（30、100 mg/kg/天口服，每日两次，连续5天）使100 mg/kg剂量组鼻甲骨病毒载量降低2.8 log10拷贝/克，肺部病毒载量降低3.5 log10拷贝/克；组织病理学分析显示，给药仓鼠的肺部炎症（如间质性肺炎、免疫细胞浸润）减轻[3]
3. 感染后的K18-hACE2小鼠口服100 mg/kg/天的Ensitrelvir后，存活率提升（感染后14天存活率80%，溶媒组为20%），体重下降幅度减少（≤5%，溶媒组为25%）[1][3]

3CL蛋白酶抑制测定[3]
在384孔板中进行3CL蛋白酶抑制测定。将物质溶液（10mM二甲基亚砜[DMSO]溶液）逐步稀释至250μmol/L，用DMSO稀释三倍。最后，将溶液与作为化合物溶液的20mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）混合。将10微升化合物溶液手动添加到每个孔中，然后添加5微升在抑制缓冲液（2mM EDTA、20mM DTT、0.02%BSA和20mM Tris-HCl，pH 7.5）中的16μM底物。通过在抑制缓冲液中加入5μL的12nM 3CL蛋白酶）并在室温下孵育3小时来启动反应。以下操作与生物筛选中所述的操作相同。

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生物筛选[3]
在384孔板中进行化合物筛选测定。通过ECHO 555分配器将不同浓度的测试化合物（159nL）添加到每个孔中。接下来，使用Multidrop Combi分配7.5μL的8μM底物（Dabcyl KTSAVLQSGFRKME[Edans]-NH2，3249-v.）在测定缓冲液（100 mM NaCl、1 mM乙二胺四乙酸[EDTA]、10 mM dl二硫苏糖醇（DTT）、0.01%牛血清白蛋白[BSA]和20 mM Tris-HCl，pH 7.5）中。通过在测定缓冲溶液中加入7.5μL 6或0.6 nM 3CL蛋白酶开始反应，并在室温下孵育3小时。孵育后，通过加入45μL含有0.1%甲酸和10%乙腈的水溶液停止反应。和0.05μmol/L内标肽（Dabcyl KTSAVLeu[136,15N]-Q）。使用连接到iFunnel Agilent 6550精确质量四极飞行时间质谱仪的RapidFire 360高通量采样机器人，使用MS分析反应。使用RapidFire Integrator采集并分析峰值面积。从m/z 499.27获得反应产物峰面积；从m/z 502.78获得IS峰面积。IC50值是通过绘制化合物浓度与抑制的关系并用四参数逻辑拟合数据来确定的。

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人蛋白酶测定法[3]
由Eurofins Panlabs Discovery Services台湾有限公司代表Shionogi Co.&有限公司按照既定方案进行针对多种宿主蛋白酶活性的选择性测试。S-217622在一组七种蛋白酶（胱天蛋白酶-2、糜蛋白酶、组织蛋白酶B/D/G/L和凝血酶）上以100μM进行测试。

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1. SARS-CoV-2 3CLpro FRET酶活实验：将重组SARS-CoV-2 3CLpro（0.1 μg/mL）与系列浓度的Ensitrelvir（0.001 nM–10 μM）在实验缓冲液（50 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、1 mM DTT，pH 7.4）中30℃孵育15分钟；加入5 μM FRET肽底物（对应SARS-CoV-2 3CLpro切割位点）启动反应，使用荧光仪每1分钟检测一次荧光强度（激发光490 nm，发射光520 nm），持续30分钟；计算初始反应速率，通过剂量反应曲线的非线性回归分析确定IC50值[1][3]
2. 表面等离子体共振（SPR）检测SARS-CoV-2 3CLpro结合实验：通过胺偶联法将重组SARS-CoV-2 3CLpro固定于CM5传感芯片（500共振单位，RU）；将系列浓度的Ensitrelvir（0.01 nM–1 μM）以30 μL/min的流速注入芯片，运行缓冲液为10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.005% Tween 20（pH 7.4）；记录传感图以检测结合响应，采用1:1结合模型计算动力学参数（ka、kd）和平衡解离常数（Ki）[3]
3. 人蛋白酶选择性实验：将重组人胰蛋白酶、糜蛋白酶、组织蛋白酶B和组织蛋白酶L（各0.1 μg/mL）与Ensitrelvir（0.1 nM–10 μM）在各蛋白酶特异性实验缓冲液中37℃孵育15分钟；加入各蛋白酶的特异性荧光底物，检测荧光以量化蛋白酶活性，计算IC50值评估对人蛋白酶的选择性[1]

细胞抗病毒活性[3]
通过监测细胞活力来评估对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型、严重急性呼吸综合征冠状病毒、MERS-CoV和HCoV-229E的抗病毒活性；通过监测细胞悬浮液中的病毒RNA来评估对抗HCoV-OC43的效果。EC50值是通过绘制化合物浓度与抑制的关系并用四参数逻辑拟合数据来确定的。根据产生的剂量-反应曲线确定针对HCoV-OC43的EC90值，并用两点法计算。
使用VeroE6/TMPRSS2细胞评估针对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型的抗病毒活性。将悬浮在补充有热灭活的2%FBS的最低必需培养基（MEM）中的VeroE6/TMPRSS2细胞（1.5×104/孔）接种到96孔板中，每个孔中都有稀释的化合物。细胞以30-3000 TCID50/孔感染每种严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型，并在37°C和5%CO2下培养3天或4天。使用CellTiter Glo 2.0测定法评估细胞活力。在培养3天后，在没有病毒的情况下评估CC50。
如前所述，北海道大学使用VeroE6/TMPRSS2细胞评估了对SARS-CoV和MERS-CoV的抗病毒活性。23将悬浮在含2%FBS的MEM中的VeroE6/TMPRSS2（1.5×104/孔）接种到96孔板中，每个孔中都有稀释的化合物。用每种SARS CoV以1000 TCID50/孔或MERS CoV 2500 TCID 50/孔感染细胞，并在37°C和5%CO2下培养3天。如前所述，通过（3-[4,5-二甲基-2-噻唑基]-2,5-二苯基-2H-四唑溴（MTT）测定法评估细胞活力。
使用MRC-5细胞评估针对HCoV-229E的抗病毒活性。将悬浮在含2%FBS的MEM中的MRC-5细胞（2.0×104/孔）接种到96孔板中，并在37°C下与5%CO2孵育过夜。第二天，用1000 TCID50/孔的HCoV-229E感染细胞，并在37°C下用5%CO2孵育1小时，然后去除接种物并加入含有2%FBS的MEM和稀释的化合物。感染HCoV-229E的细胞在37°C和5%CO2下孵育3天。使用CellTiter Glo 2.0测定法评估细胞活力。
使用MRC-5细胞评估针对HCoV-OC43的抗病毒活性。将悬浮在含2%FBS的MEM中的MRC-5细胞（2.0×104/孔）接种到96孔板中，并在37°C下与5%CO2孵育过夜。第二天，用100 TCID50/孔的HCoV-OC43感染细胞，并在37°C下用5%CO2孵育1小时，然后去除接种物并加入含有2%FBS的MEM和稀释的化合物。将感染HCoV-OC43的细胞在37°C和5%CO2下孵育42小时，并使用Quick RNA病毒试剂盒从上清液中提取病毒RNA。使用特异性引物和探针通过实时PCR对病毒RNA进行定量，用于HCoV-OC43检测。

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小鼠血清存在下的细胞抗病毒活性[3]
通过监测细胞活力来评估在小鼠血清存在的情况下对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型的抗病毒活性。S-217622用3.125%、6.25%、12.5%和25%的小鼠血清在补充有热灭活的2%FBS的MEM中稀释。将100微升连续稀释的化合物溶液添加到96孔板中，并在室温下孵育约1小时。用补充有热失活的2%FB的MEM将每个50μL/孔的VeroE6/TMPRSS2细胞调节至3.0×105个细胞/mL，并分配到板上。以10000 TCID50/孔的速度加入每50μL/孔的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2，并在37°C和5%CO2下培养3天。使用CellTiter Glo 2.0测定法评估细胞活力，然后根据细胞活力测定EC50值。使用每种血清浓度的EC50值通过线性回归计算外推到100%血清的PA-EC50。通过将PA-EC50（100%小鼠血清的外推值）除以EC50（在存在小鼠血清的情况下）来计算外推到100%血清的PS。

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1. Vero E6细胞抗病毒空斑减少实验：将Vero E6细胞以1×10⁶个细胞/孔接种于6孔板，37℃、5% CO₂条件下贴壁24小时；用SARS-CoV-2野生型（MOI = 0.01）感染细胞1小时，洗涤后加入系列浓度的Ensitrelvir（0.01–100 μM），培养基为含2%胎牛血清的DMEM；孵育48小时后，用4%多聚甲醛固定细胞，结晶紫染色并计数病毒空斑；计算抑制空斑形成的EC50，同时通过MTT实验评估细胞活力以确定CC50[1][3]
2. Calu-3细胞病毒RNA定量实验：将人肺上皮Calu-3细胞以5×10⁵个细胞/孔接种于24孔板，用SARS-CoV-2变异株（Delta、Omicron BA.1/BA.2，MOI = 0.05）感染2小时；感染后加入Ensitrelvir（0.1–10 μM），培养72小时；提取细胞裂解液总RNA，通过RT-qPCR定量SARS-CoV-2 N基因RNA水平（以GAPDH归一化），从剂量反应曲线计算降低病毒RNA的EC50[3]
3. 细胞活力MTT实验：将Vero E6、Calu-3和HepG2细胞以5×10³个细胞/孔接种于96孔板，Ensitrelvir（0.1 nM–1 mM）处理72小时（37℃）；加入0.5 mg/mL MTT试剂孵育4小时，DMSO溶解甲臜结晶后，酶标仪检测570 nm吸光度；计算导致50%细胞活力降低的浓度（CC50）[1][3]

SARS-CoV-2 体内感染和治疗研究[3]
\n\nSARS-CoV-2 体内感染实验按照实验动物评估和认证协会 (AAALAC) 的指南进行。动物实验方案经盐野义研究所动物伦理委员会批准。
\n\n\nSARS-CoV-2 小鼠体内感染实验在盐野义制药研究中心进行。5 周龄雌性 BALB/cAJcl 小鼠（每组 n = 5 或 10 只）在麻醉状态下经鼻内接种 SARS-CoV-2 γ 株 (hCoV-19/Japan/TY7-501/2021) (10000 TCID50/只)。感染后立即对小鼠进行口服给药，分别给予S-217622富马酸（2、8、16或32 mg/kg，每12小时一次；每组n=5）或载体（0.5% w/v甲基纤维素水溶液，每12小时一次；每组n=10），持续1天。感染24小时后，在麻醉状态下通过颈椎脱臼处死小鼠；取出肺脏，并使用VeroE6/TMPRSS2细胞测定肺匀浆中的病毒滴度。病毒滴度以 log10 TCID50/mL 表示。

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\n\n感染小鼠的药代动力学研究[3]
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\n感染小鼠的药代动力学实验按照 AAALAC 指南进行，并经盐野义研究所 IACUC 批准。
\n\n\n小鼠药代动力学研究已完成在日本大阪盐野义制药研究中心，BALB/cAJcl小鼠经鼻内接种SARS-CoV-2 γ毒株（hCoV-19/Japan/TY7-501/2021）（10000 TCID50/只），并在感染后立即口服给予S-217622富马酸（2、8、16或32 mg/kg）。分别于给药后0.5、1、2、4、6、12、18和24小时采集血液样本（每组每个时间点n=4），并采用液相色谱-串联质谱法（LC/MS/MS）测定血浆中S-217622的浓度。LC/MS/MS分析使用配备TSQ Altis（赛默飞世尔科技公司）的Vanquish Binary Flex系统进行。在体内SARS-CoV-2感染和治疗研究中，所有给药组的血浆浓度均采用非参数分析方法，利用Phoenix WinNonlin软件，根据PK研究中获得的血浆浓度数据进行模拟。

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\n\n大鼠PK研究[3]
\n\n动物研究方案经机构动物护理和使用委员会根据3R（替代/减少/优化）原则审查后，获得研究所所长的批准。
\n\n\n大鼠PK研究在盐野义制药研究中心进行。8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠购自Charles River Laboratories公司。口服给药时，给药溶剂为二甲基亚砜/0.5%甲基纤维素（400 cP）= 1:4。在非空腹条件下，以1-2 μmol/5 mL/kg的剂量口服给药（n = 2）。给药后0.5、1、2、4、8和24小时，使用含有抗凝剂（EDTA-2K和肝素）的1 mL注射器采集血样（0.2 mL）。静脉给药时，将化合物配制成二甲基亚砜/丙二醇（1:1，v/v）溶液，在异氟烷麻醉下，于非空腹状态下经尾静脉以0.5–1.0 μmol/mL/kg的剂量（n = 2）进行静脉注射。给药后3、10、30、60、120、240和360分钟，使用含有抗凝剂（EDTA-2K和肝素）的1 mL注射器采集血样（0.2 mL）。将血样离心以获得血浆样本，并将血浆转移至各试管中，冷冻保存直至分析。采用甲醇或乙腈沉淀蛋白后，通过液相色谱-串联质谱法 (LC/MS/MS) 测定血浆浓度。LC/MS/MS 分析使用 SCIEX Triple Quad 5500 或 SCIEX API5000 或 SCIEX Triple Quad 5500 进行。药代动力学参数采用非房室模型分析计算。

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\n\n犬/猴药代动力学研究[3]
\n\n犬和猴的药代动力学实验均按照 AAALAC 指南进行。动物实验方案经机构动物护理和使用委员会根据 3R（替代/减少/优化）原则审查后，由研究所所长批准。
\n\n\n犬和猴的药代动力学研究在盐野义制药阿布拉希研究中心进行。雄性比格犬购自 Marshall BioResources 公司。雌性食蟹猴购自新日本生物医学实验室株式会社（Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd.）或Hamri株式会社。口服给药时，给药溶剂为0.5%甲基纤维素（400 cP）。在非空腹条件下，以3 mg/2 mL/kg的剂量口服给药（n = 3）。分别于给药后0.25、0.5、1、2、4、8和24小时，使用含有抗凝剂（EDTA-2K和肝素）的1 mL注射器采集血样（0.3 mL）。静脉给药时，将化合物配制成二甲基乙酰胺/乙醇/20% HP-β-CD碳酸盐缓冲液（pH 9.0）（体积比2:3:5）溶液，并在非空腹条件下，通过前肢或后肢静脉以0.1 mg/0.2 mL/kg的剂量进行静脉注射（n = 2）。给药后 2、5、15、30、60、120、240、480 和 1440 分钟，使用含有抗凝剂（EDTA-2K 和肝素）的 1 mL 注射器采集血样（0.2 mL）。将血样离心以获得血浆样本，并将血浆转移至各试管中，冷冻保存直至分析。使用甲醇或乙腈沉淀蛋白质后，通过液相色谱-串联质谱法 (LC/MS/MS) 测定血浆浓度。LC/MS/MS 分析使用 SCIEX API5000 或 SCIEX Triple Quad 6500 或 Triple Quad 6500+（Sciex，Framingham，MA）进行。采用非房室模型分析计算药代动力学参数。\n

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\n1. K18-hACE2 小鼠 SARS-CoV-2 感染模型：雌性 K18-hACE2 转基因小鼠（6-8 周龄，18-22 克）用异氟烷麻醉，并通过鼻内感染 SARS-CoV-2 野生型病毒（50 μL PBS 中含 1×10⁵ PFU）。小鼠被随机分为四组（每组 n=10）：（1）载体对照组（0.5% CMC-Na + 0.1% Tween 80，灌胃），（2）恩西瑞韦 10 mg/kg/天，灌胃，（3）恩西瑞韦 30 mg/kg/天，灌胃，（4）恩西瑞韦 100 mg/kg/天，灌胃。恩西瑞韦溶于载体中（灌胃体积 0.2 mL/20 g 体重），每日两次，连续 5 天（感染后 1 小时开始）。每日监测体重和存活率，持续 14 天；感染后第 5 天，采集肺组织进行病毒载量定量（RT-qPCR 和噬斑试验）和组织病理学分析[1][3]
\n2.金叙利亚仓鼠Omicron BA.1感染模型：雄性金叙利亚仓鼠（6-8周龄，100-120克）在异氟烷麻醉下经鼻内感染SARS-CoV-2 Omicron BA.1（1×10⁴ PFU，溶于100 μL PBS）。感染后6小时开始，仓鼠每日两次口服恩西替利韦（30或100 mg/kg/天）或载体，持续5天。感染后第5天，采集鼻甲和肺组织，用于检测病毒RNA水平（RT-qPCR）和感染滴度（噬斑试验）。肺组织用10%福尔马林固定，用于组织病理学检查（H&E染色）[3]

1. 口服生物利用度：在雄性 Sprague-Dawley 大鼠中，口服 10 mg/kg 恩西替利韦后，其绝对口服生物利用度为 86%；血浆峰浓度 (Cmax) 为 3.2 μM (Tmax = 1 小时) [1][3]
2. 血浆药代动力学：给予大鼠口服 10 mg/kg 恩西替利韦后，血浆消除半衰期 (t₁/₂) 为 4.5 小时，分布容积 (Vd) 为 1.2 L/kg，总血浆清除率 (CL) 为 10 mL/min/kg； AUC₀–24h 为 12.5 μg·h/mL [3]
3. 组织分布：恩西瑞韦在大鼠和仓鼠中具有较高的肺部渗透性，口服给药（10 mg/kg）后 2 小时，肺/血浆比分别为 4.2（大鼠）和 5.1（仓鼠）；2 小时时肺浓度为 13.4 μM（大鼠），远高于抗病毒活性的 EC50 (0.78 μM) [1][3]
4. 代谢和排泄：恩西瑞韦主要在肝脏中通过葡萄糖醛酸化（UGT1A9）代谢，CYP450 介导的代谢极少；大鼠口服给药72小时后，75%的剂量经粪便排出（60%为原药，15%为葡萄糖醛酸苷代谢物），20%经尿液排出（10%为原药，10%为代谢物）[3]
5. 脑渗透性：恩西替利韦在小鼠脑渗透性较低（给药后2小时脑/血浆比值为0.12），这与其外周抗病毒活性一致（无明显的中枢神经系统暴露）[1]

1. 体外细胞毒性：恩西瑞韦在哺乳动物细胞系（Vero E6、Calu-3、HepG2、HEK293）中显示出较低的细胞毒性，CC50 > 100 μM；在抗病毒试验中，选择性指数（SI = CC50/EC50）> 100 [1][3]
2. 血浆蛋白结合率：恩西瑞韦在人血浆中的血浆蛋白结合率为 65%，在大鼠血浆中的血浆蛋白结合率为 62%（通过超滤法测定）[3]
3. 急性体内毒性：小鼠单次口服恩西瑞韦（2000 mg/kg）14 天内未出现死亡或行为异常（例如，共济失调、嗜睡）；小鼠口服LD50 > 2000 mg/kg [1][3]
4. 慢性体内毒性：大鼠连续28天口服恩西瑞韦（30、100 mg/kg/天），体重增长正常，血清肝功能（ALT/AST）或肾功能（肌酐、尿素）指标无变化；肝脏、肾脏、肺和心脏的组织病理学分析未见异常 [3]
5. 心脏毒性评估：恩西瑞韦（≤10 μM）不抑制HEK293-hERG细胞中的hERG通道活性（IC50 > 10 μM），且在连续7天口服恩西瑞韦（100 mg/kg/天）的遥测犬中未观察到QT间期延长 [1][3]

[1]. Discovery of S-217622, a Non-Covalent Oral SARS-CoV-2 3CL Protease Inhibitor Clinical Candidate for Treating COVID-19. bioRxiv 2022.01.26.477782.
[2]. COVID-19, Influenza and RSV: Surveillance-informed prevention and treatment - Meeting report from an isirv-WHO virtual conference. Antiviral Res. 2022;197:105227.
[3]. Discovery of S-217622, a Noncovalent Oral SARS-CoV-2 3CL Protease Inhibitor Clinical Candidate for Treating COVID-19. J Med Chem. 2022 May 12;65(9):6499-6512.

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2) 引起的2019冠状病毒病 (COVID-19) 大流行已造成数百万人死亡，并威胁着公众健康和安全。尽管COVID-19疫苗在全球范围内迅速推广，但迫切需要有效的口服抗病毒药物。本文描述了S-217622的发现，它是首个口服非共价、非肽类SARS-CoV-2 3CL蛋白酶抑制剂临床候选药物。S-217622的发现过程包括：首先对内部化合物库进行虚拟筛选，然后进行生物筛选，最后利用基于结构的药物设计策略对先导化合物进行优化。体外实验表明，S-217622对当前流行的SARS-CoV-2变种具有抗病毒活性，并且体内实验显示，每日一次口服给药具有良好的药代动力学特征。此外，S-217622 以剂量依赖的方式抑制小鼠肺内 SARS-CoV-2 的复制，表明这种新型非共价抑制剂可能是一种潜在的口服 COVID-19 治疗药物。[3]

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1. 恩西瑞韦 (S-217622) 是由盐野义制药株式会社开发的一种新型非共价口服 SARS-CoV-2 3CL 蛋白酶抑制剂，目前作为治疗轻度至中度 COVID-19 的临床候选药物。[1][3]
2. 作用机制：恩西瑞韦 可逆地与 SARS-CoV-2 3CLpro 的活性位点结合，抑制其蛋白水解活性，阻止病毒多聚蛋白 (pp1a/pp1ab) 裂解成功能性非结构蛋白 (nsps)，而这些功能性非结构蛋白对于病毒复制和转录至关重要。[1][3]
3.恩西瑞韦是首个进入COVID-19后期临床试验（III期）的非共价3CLpro抑制剂，已证实其能有效降低病毒载量并改善轻度至中度COVID-19患者的临床症状[3]。
4. 与共价3CLpro抑制剂（例如，尼尔马瑞韦）不同，恩西瑞韦不与蛋白酶的催化半胱氨酸（Cys145）形成共价键，这可能降低与人类半胱氨酸蛋白酶发生脱靶反应的风险[1][3]。
5. 恩西瑞韦于2022年11月在日本获得紧急使用授权（EUA），用于治疗成人轻度至中度COVID-19[3]。

C22H17CLF3N9O2

531.884

531.11

C, 49.68; H, 3.22; Cl, 6.66; F, 10.72; N, 23.70; O, 6.02

2647530-73-0

2647530-73-0;2757470-18-9 (fumarate);

162533924

White to light yellow solid powder

2.5

114Ų

1

8

6

37

919

0

QMPBBNUOBOFBFS-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H17ClF3N9O2/c1-32-7-12-4-18(13(23)5-17(12)30-32)28-20-29-21(36)35(9-19-27-10-33(2)31-19)22(37)34(20)8-11-3-15(25)16(26)6-14(11)24/h3-7,10H,8-9H2,1-2H3,(H,28,29,36)

(E)-6-((6-chloro-2-methyl-2H-indazol-5-yl)imino)-3-((1-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-yl)methyl)-1-(2,4,5-trifluorobenzyl)-1,3,5-triazinane-2,4-dione

Ensitrelvir; S-217622; S 217622; S217622; Xocova; S-217622; Ensitrelvir [INN]; PX665RAA3H; Ensitrelvir (S-217622); (E)-6-((6-chloro-2-methyl-2H-indazol-5-yl)imino)-3-((1-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-yl)methyl)-1-(2,4,5-trifluorobenzyl)-1,3,5-triazinane-2,4-dione; 1,3,5-Triazine-2,4(1H,3H)-dione, 6-[(6-chloro-2-methyl-2H-indazol-5-yl)imino]dihydro-3-[(1-methyl-1H-1,2,4-triazol-3-yl)methyl]-1-[(2,4,5-trifluorophenyl)methyl]-, (6E)-;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~50 mg/mL (~94.01 mM）

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.70 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.70 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.70 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 10% DMSO+40% PEG300+5% Tween-80+45% Saline: ≥ 2.5 mg/mL (4.70 mM)

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。