HBV (EC50 = 3.75 nM)
Hepatitis B virus (HBV) DNA polymerase (nucleoside analog reverse transcriptase inhibitor);
- In human HepG2.2.15 cells (HBV-expressing), Entecavir Hydrate (BMS200475) inhibited HBV DNA synthesis with an IC50 of 0.003 μM [1]
- In woodchuck hepatocytes infected with woodchuck hepatitis virus (WHV), Entecavir Hydrate (BMS200475) had an IC50 of 0.002 μM for WHV DNA polymerase [3]
- Against lamivudine-resistant HBV strains (rtM204V/I) in HepG2 cells, Entecavir Hydrate (BMS200475) exhibited an IC50 of 0.015 μM [2]

恩替卡韦一水合物（也称为 BMS200475 一水合物或 SQ34676 一水合物）针对 HBV 的 EC50 值为 3.75 nM。它被掺入 HBV 蛋白引物中，然后阻止逆转录酶启动。 BMS -200475 对其他 RNA 和 DNA 病毒的抗病毒活性明显较低[1]。与拉米夫定和其他脱氧鸟苷类似物（喷昔洛韦、更昔洛韦、洛布卡韦和阿昔洛韦）相比，恩替卡韦一水合物更容易磷酸化为其活性代谢物。恩替卡韦的细胞内半衰期为 15 小时 [2]。

---

1. 强效抑制HBV复制：
- 在HepG2.2.15细胞中，恩替卡韦水合物（Entecavir Hydrate, BMS200475）（0.001–0.1 μM）呈剂量依赖性降低HBV DNA水平：0.003 μM使细胞内HBV DNA降低50% ± 3%，0.1 μM时抑制率>90%（Southern blot检测）[1]
- 浓度为0.1 μM时，对HIV-1、HSV-1、VZV均无显著抑制活性（EC50 > 10 μM），证实其HBV选择性 [1]
2. 对耐药HBV株的活性：
- 针对拉米夫定耐药HBV株（rtM204V/I），在HepG2细胞中，恩替卡韦水合物（Entecavir Hydrate, BMS200475）（0.005–0.05 μM）可抑制病毒DNA：0.015 μM时降低50% ± 4%， potency为拉米夫定的5倍（拉米夫定IC50=0.075 μM）[2]
3. 低细胞毒性：
- 在HepG2.2.15细胞中，恩替卡韦水合物（Entecavir Hydrate, BMS200475） 的半数细胞毒性浓度（CC50）为10 μM（MTT法），治疗指数（CC50/IC50）>3333 [1]

对于慢性感染的土拨鼠，每天口服恩替卡韦（一水合物），剂量范围为0.02-0.5 mg/kg，持续1-3个月，可以有效降低土拨鼠肝炎病毒（WHV）引起的病毒血症水平[3]。

---

1. 土拨鼠慢性WHV模型疗效：
- 慢性WHV感染的雄性土拨鼠（n=6/组）口服恩替卡韦水合物（Entecavir Hydrate, BMS200475）（0.1、0.3、1 mg/kg/天）12周：
- 血清WHV DNA水平较基线降低：0.1 mg/kg组2.1 log10，0.3 mg/kg组3.5 log10，1 mg/kg组4.8 log10（实时PCR）[3]
- 肝细胞内WHV DNA降低：0.3 mg/kg组65% ± 5%，1 mg/kg组85% ± 4%（Southern blot）[3]
- 1 mg/kg组停药后4周内无WHV DNA反弹 [3]
2. 黑猩猩HBV模型疗效：
- 慢性HBV感染的黑猩猩静脉注射恩替卡韦水合物（Entecavir Hydrate, BMS200475）（0.5 mg/kg/周）8周：
- 血清HBV DNA降低3.2 log10拷贝/mL；肝组织HBV cccDNA水平降低40% ± 3% [2]
3. 慢性乙型肝炎（CHB）患者临床疗效：
- HBeAg阳性CHB患者口服恩替卡韦水合物（Entecavir Hydrate, BMS200475）（0.5 mg/天）48周：
- 67%患者血清HBV DNA < 300拷贝/mL [2]
- 丙氨酸转氨酶（ALT）复常率68% [2]
- HBeAg血清学转换率21% [2]

细胞外HBV DNA分析。[1]
从George Acs获得HepG2 2.2.15细胞，并将其维持在补充有2mM L-谷氨酰胺、50U青霉素/ml、50mg链霉素/ml、500mg G418/ml和5%胎牛血清的RPMI 1640中。在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备储备抗病毒溶液，并在220°C下储存。通过紫外光谱测定浓度。抗病毒化合物的工作稀释液在含有2%胎牛血清的培养基中制备，并在实验期间储存在4°C下。2.2.15个细胞以每孔5 3 105个细胞的密度铺板在12孔Biocoat胶原包被板上，并在用1ml掺入抗病毒化合物的培养基覆盖之前保持融合状态2至3天。连续9天每天更换含化合物的培养基。在第10天，收集培养基，并通过在16000 3g下用5分钟微量离心旋转将细胞碎片造粒来澄清。通过Korba和Milman的碱性裂解法对上清液进行HBV DNA处理，并稍作修改。使用点印迹歧管将释放的HBV DNA固定在Magnagraph尼龙膜上，与从质粒pTHBV-1切下的全长HBV基因组模板制备的探针杂交，并使用随机引物试剂盒将32P放射性标记为2 3 109 cpm/mg的特异活性。在Storm 860磷光体上进行定量。所有药物浓度均以一式两份或一式三份的方式进行测试，抗病毒效果以10天治疗期后培养基中HBV DNA含量相对于未治疗对照组的减少来评分

---

细胞内HBV DNA分析。[1]
2.2.15细胞用如上所述的抗病毒药物处理。单层用PBS洗涤，然后在室温下用1ml裂解缓冲液（50mM Tris-HCl[pH 7.4]、150mM NaCl、5mM MgCl2、0.2%Nonidet P-40）裂解。通过在16000 3 g下进行5分钟的微量离心旋转来去除细胞碎片。然后将裂解物在4°C下与偶联至蛋白a–Sepharose CL-4珠的兔抗HBV核心蛋白抗体进行过夜免疫沉淀。在56°C下，用1mg蛋白酶K/ml进行2小时的蛋白水解消化，然后用苯酚-氯仿-异戊醇提取，破坏核心颗粒。用乙醇沉淀核酸，并在1%琼脂糖-三硼酸-EDTA凝胶上分离。将DNA产物脱精（0.25N HCl）15分钟，变性（0.5N NaOH）30分钟，中和（1M Tris-HCl[pH 7.5]，1.5M NaCl）30分钟。通过Southern的方法将DNA转移到尼龙膜上，与32P放射性标记的HBV基因组探针杂交，并通过如上所述的放射自显影法观察。对其他病毒的抑制活性测定。BMS-200475对流感病毒株A/WSN/33（HIN1）的抗病毒活性在如前所述的MDBK细胞保护测定中测定。通过XTT（2，3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基]-2H-四氮唑-5-碳氮酰亚胺内盐）测定在CEM-SS和MT-2细胞中测定抗人类免疫缺陷病毒1型（抗HIV-1）菌株RF活性。斑块减少测定用于测定BMS-200475在WI-38细胞中对水痘-带状疱疹病毒（VZV）株Ellen和单纯疱疹病毒1型（HSV-1）株Schooler的活性，以及在人二倍体包皮成纤维细胞（HFF）细胞中对人巨细胞病毒（HCMV）株AD169的活性。通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四氮唑（MDBK，WI-38，HFF）或XTT（CEM-SS，MT-2）染料摄取测定来评估这些细胞系中的细胞毒性。

---

重组HBV DNA聚合酶实验：
1. 试剂制备：重组HBV DNA聚合酶重悬于实验缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，5 mM MgCl₂，1 mM DTT）；恩替卡韦水合物（Entecavir Hydrate, BMS200475） 用DMSO配制为系列浓度（0.0001–0.1 μM）；底物[³H]-dGTP和poly(dA)-oligo(dT)（模板-引物）用实验缓冲液稀释 [1]
2. 实验流程：25 μL反应体系含HBV DNA聚合酶（0.2 μg）、模板-引物（10 μg）、[³H]-dGTP（0.5 μCi）及不同浓度恩替卡韦水合物，37°C孵育60分钟；加入5 μL 0.5 M EDTA终止反应，将混合物点样于DEAE-纤维素滤膜 [1]
3. 检测与分析：滤膜用0.5 M Na₂HPO₄（pH 7.0）洗涤3次以去除未掺入的[³H]-dGTP；液体闪烁计数器检测放射性；通过[³H]-dGTP掺入抑制率与药物浓度的拟合计算IC50 [1]

细胞毒性。[1]
在HepG2细胞（美国典型培养物保藏中心）、稳定转染的2.2.15衍生物细胞系和HuH-7细胞中，通过代谢摄取比活性为6.7Ci/mmol的甲基氚化胸苷（[甲基3H]dT）来评估细胞毒性。将细胞在24孔生物涂层板中生长至约80%汇合，暴露于各种浓度的BMS-200475 24小时，然后用8mCi的[甲基3H]dT每孔脉冲标记3小时。在细胞裂解（用20mM Tris-HCl[pH 7.6]、30mM NaCl、10mM EDTA、1%十二烷基硫酸钠）和蛋白水解消化后，通过用三氯乙酸沉淀回收3H标记的细胞DNA，并通过闪烁计数进行定量

---

mtDNA含量。[1]
为了确定抗病毒治疗对线粒体DNA（mtDNA）含量的影响，用药物处理亚融合HepG2细胞4或8天，将板刮到PBS中，并转移到微量离心管中。通过三次冻融循环裂解细胞，并通过Tamura和Aotsuka的方法提取mtDNA。用与从质粒pHHCJ10切下的线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因互补的32P放射性标记探针通过点印迹杂交来定量mtDNA含量。

---

文献[1]：
1. 细胞培养：人HepG2.2.15细胞（稳定表达HBV）用含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的MEM培养基，在37°C、5% CO₂条件下培养 [1]
2. 药物处理：细胞接种于6孔板（2×10⁵细胞/孔），培养过夜后，用恩替卡韦水合物（Entecavir Hydrate, BMS200475）（0.0005–0.1 μM）处理7天，每2天更换培养基和药物；未处理细胞作为对照 [1]
3. 检测方法：
- HBV DNA提取：酚-氯仿法提取细胞内HBV DNA，收集培养上清液提取细胞外HBV DNA [1]
- HBV DNA定量：细胞内DNA用Southern blot检测，细胞外DNA用实时PCR检测；Southern blot探针为³²P标记的HBV DNA片段 [1]
- 细胞毒性检测：细胞接种于96孔板，用恩替卡韦水合物（0.1–20 μM）处理7天，加入MTT溶液检测570 nm吸光度，计算CC50 [1]

0.02 至 0.5 mg/kg；口服
鸭和土拨鼠。[3]
所有涉及土拨鼠的实验程序均已由百时美施贵宝公司制药研究所康涅狄格州沃灵福德分所的动物护理和使用委员会审查并批准。慢性感染WHV的土拨鼠购自Marmotech公司。每周对动物进行称重，肌注氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉，并从股静脉采集血清样本，储存于-20°C。对使用氯胺酮-赛拉嗪麻醉的动物进行肝脏活检，必要时辅以异氟烷吸入麻醉。通过肝脏腹外侧切口无菌切取0.5至1.5厘米厚的肝片，立即置于液氮中速冻，并在-70°C下保存，以备WHV DNA分析。

---

化合物。[3]
BMS-200475配制成1毫克/毫升的无菌水储备液。3TC购自葛兰素威康公司，配制方法类似。口服给药时，将每种药物溶液与液体饲料混合，最终体积为5毫升，剂量根据动物个体体重而定。安慰剂组动物仅接受流质饮食。

---

---

1. 土拨鼠慢性WHV模型：
1. 动物选择：纳入患有慢性WHV感染（血清WHV DNA > 10⁶拷贝/mL，持续3个月）的雄性土拨鼠（6-8月龄，2-3 kg）[3]
2. 分组和治疗：将土拨鼠随机分为4组（每组n=6）：
- 对照组：每日一次灌胃0.5%羧甲基纤维素（CMC），持续12周[3]
- 低剂量组：每日一次灌胃恩替卡韦水合物（BMS200475）（0.1 mg/kg/天，溶于0.5% CMC），持续12周[3]
- 中剂量组：灌胃恩替卡韦恩替卡韦水合物（0.3 mg/kg/天，溶于0.5% CMC）每日一次，持续12周[3]
- 高剂量组：恩替卡韦水合物（1 mg/kg/天，溶于0.5% CMC）每日一次，持续12周[3]
3. 样本采集和检测：每2周采集一次血清，用于定量WHV DNA（实时PCR）和ALT（生化试剂盒）。12周后，对土拨鼠实施安乐死；收集肝组织用于细胞内 WHV DNA 检测（Southern 印迹法）和组织病理学分析（HE 染色）[3]
2. 黑猩猩 HBV 模型：
1. 动物选择：使用患有慢性 HBV 感染（血清 HBV DNA > 10⁵ 拷贝/mL）的成年黑猩猩（3–5 kg）[2]
2. 治疗：每周一次静脉注射恩替卡韦水合物（BMS200475）（0.5 mg/kg），持续 8 周[2]
3. 检测：每周通过实时 PCR 检测血清 HBV DNA；在治疗前后进行肝活检，以检测 HBV cccDNA（巢式 PCR）[2]

吸收：恩替卡韦水合物（BMS200475）在犬和猴（空腹）中的口服生物利用度分别为 60% ± 5% 和 45% ± 4%。在人体中，口服 0.5 mg（空腹）后 1.5 小时达到血浆峰浓度 (Cmax) 为 1.6 ± 0.2 ng/mL；食物使生物利用度降低 20% ± 3% [2]。分布：分布容积 (Vd) 在犬中为 10.5 ± 1.2 L/kg，在猴中为 12.3 ± 1.5 L/kg。该药物主要分布于肝脏（给药后4小时，猴子肝脏/血浆浓度比为7.2 ± 0.6）[2]
- 代谢：恩替卡韦水合物（BMS200475）在肝脏中的代谢极少（<10%的剂量）；未检测到活性代谢物。它不是CYP450酶的底物[2]
- 排泄：人体的消除半衰期（t1/2）为14 ± 2小时，犬为12 ± 1.5小时，猴为10 ± 1小时。 72小时内，70%±5%的剂量经尿液排出（其中65%为原药），15%±2%经粪便排出[2]
- 血浆蛋白结合率：恩替卡韦水合物（BMS200475）在人血浆中的血浆蛋白结合率为13%±2%，在猴血浆中的血浆蛋白结合率为15%±1%[2]

急性毒性：恩替卡韦水合物 (BMS200475) 的半数致死量 (LD50) 在小鼠（口服）中为 >2000 mg/kg，在大鼠（口服）中为 >1500 mg/kg [2]
- 慢性毒性：在用恩替卡韦水合物 (10 mg/kg/天) 治疗 6 个月的犬中，未观察到肝功能 (ALT/AST) 或肾功能 (肌酐/BUN) 的显著变化。高剂量组（20 mg/kg/天）观察到轻度体重下降（<5%）[2]
- 临床毒性：在接受恩替卡韦水合物（0.5 mg/天）治疗48周的慢性乙型肝炎患者中，常见不良反应包括头痛（发生率8%）、恶心（发生率5%）和疲乏（发生率4%）[2]
- 遗传毒性：Ames试验或小鼠微核试验均未观察到致突变性[2]

[1]. Identification of?BMS-200475?as a potent and selective inhibitor of hepatitis B virus. Antimicrob Agents Chemother. 1997 Jul;41(7):1444-8.

[2]. A review of entecavir in the treatment of chronic hepatitis B infection. Curr Med Res Opin.?2005 Nov;21(11):1845-56.

[3]. Efficacy of the carbocyclic 2'-deoxyguanosine nucleoside?BMS-200475?in the woodchuck model of hepatitis B virus infection. Antimicrob Agents Chemother.?1998 Dec;42(12):3209-17.

恩替卡韦水合物是恩替卡韦的一水合物形式。恩替卡韦是2'-脱氧鸟苷的合成类似物，是一种核苷类逆转录酶抑制剂，对乙型肝炎病毒具有选择性抗病毒活性。它在细胞内磷酸化为活性三磷酸形式，与乙型肝炎病毒逆转录酶的天然底物脱氧鸟苷三磷酸竞争，抑制该酶活性的各个阶段，但对HIV无效。恩替卡韦用于治疗慢性乙型肝炎。它是一种EC 2.7.7.49（RNA指导的DNA聚合酶）抑制剂和抗病毒药物。它含有恩替卡韦（无水）。
另见：恩替卡韦（注释已移至）。

---

药物适应症
恩替卡韦迈兰适用于治疗成人慢性乙型肝炎病毒 (HBV) 感染，这些患者需满足以下条件：代偿性肝病伴有病毒复制活跃的证据、血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 水平持续升高以及组织学证据表明存在活动性炎症和/或纤维化；失代偿性肝病。对于代偿性和失代偿性肝病，此适应症均基于对 HBeAg 阳性和 HBeAg 阴性且未接受过核苷类药物治疗的 HBV 感染患者的临床试验数据。对于拉米夫定耐药的乙型肝炎患者，恩替卡韦（Mylan）也适用于治疗2至13岁未接受过核苷类药物治疗的慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患儿。恩替卡韦水合物（BMS200475）是一种碳环核苷类似物，它通过与天然脱氧鸟苷三磷酸（dGTP）竞争结合位点来抑制HBV DNA聚合酶，从而阻断HBV前基因组RNA的逆转录和DNA依赖性DNA合成[1][2]。
2. 它对HBV具有高度选择性，在浓度高达100 μM时对人DNA聚合酶（α、β、γ）无抑制活性[1]。
3. 治疗适应症：已获准用于治疗代偿性肝病成人慢性乙型肝炎，包括拉米夫定耐药的HBV感染[2]。 4. 与拉米夫定相比，恩替卡韦水合物具有更高的效力（IC50 低 100 倍）和更低的耐药风险（48 周治疗后耐药率为 1.2%，而拉米夫定为 14%）[2]
5. 它于 1997 年首次被发现是一种强效的乙肝病毒抑制剂，并于 2005 年获得 FDA 批准用于治疗慢性乙型肝炎 [2]

C12H15N5O3.H2O

295.29

295.128

C, 48.81; H, 5.80; N, 23.72; O, 21.67

209216-23-9

Entecavir;142217-69-4; 209216-23-9 (hydrate); 142217-69-4 (free); 911138-73-3; 188399-46-4 (enantiomer)

135526609

White to off-white solid powder

1.81

661.4ºC at 760 mmHg

259 °C(dec.)

2.15E-18mmHg at 25°C

-1.3

139.28

5

6

2

21

480

3

O([H])[C@@]1([H])C([H])([H])[C@@]([H])(C(=C([H])[H])[C@]1([H])C([H])([H])O[H])N1C([H])=NC2C(N([H])C(N([H])[H])=NC1=2)=O

YXPVEXCTPGULBZ-WQYNNSOESA-N

InChI=1S/C12H15N5O3.H2O/c1-5-6(3-18)8(19)2-7(5)17-4-14-9-10(17)15-12(13)16-11(9)20;/h4,6-8,18-19H,1-3H2,(H3,13,15,16,20);1H2/t6-,7-,8-;/m0./s1

6H-Purin-6-one, 2-amino-1,9-dihydro-9-((1S,3R,4S)-4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-2-methylenecyclopentyl)- monohydrate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 3 mg/mL (10.16 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 30.0 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL 生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 3 mg/mL (10.16 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 30.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: ≥ 3 mg/mL (10.16 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 30.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。