EPZ005687

EZH2 (Ki = 24 nM)

EPZ005687 的 IC50 值为 54±5 nM，表明 PRC2 酶活性呈浓度依赖性降低。 EPZ005687 特别能抑制淋巴瘤细胞中的 H3K27 甲基化。 EPZ005687 显着影响携带 EZH2Y641F 的细胞系的增殖。在突变型 EZH2 淋巴瘤细胞中，EPZ005687 抑制增殖，但在野生型细胞中则不然[1]。 U937 细胞对 0.5、1、5 和 10 µM 剂量的 EPZ005687 产生明显的细胞凋亡反应。 EPZ005687 明显抑制 U937 细胞的增殖，而 NBMCD34+ 细胞生长受到的影响非常轻微。 EPZ005687 导致 G1 期阻断并减少 U937 细胞中 S 期细胞的比例。此外，EPZ005687 明显消除了 U937 细胞中的 H3K27 甲基化，而 NBMCD34+ 细胞中的 H3K27 甲基化几乎不受影响[3]。

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EPZ005687对U937细胞有明显的诱导凋亡作用。0.5、1、5、10µmol/L EPZ005687作用48 h后，U937细胞的凋亡率分别为3.96%±0.79%、5.74%±0.73%、13.34%±1.77%和25.24%±2.55%。然而，EPZ005687对正常骨髓（NBM） CD34 +细胞有罕见的影响。0.5、1、5、10µmol/L EPZ005687作用于U937细胞48 h后，细胞凋亡率分别为3.64%±0.62%、4.28%±0.99%、6.18%±1.19%和7.56%±1.34%。EPZ005687对U937细胞的增殖有明显抑制作用，但对NBMCD34 +细胞的增殖作用较弱。0.5、1、5、10µmol/L EPZ005687作用12 ~ 96 h后，EPZ005687对U937细胞的抑制作用呈时间依赖性。EPZ005687诱导G1期阻滞（G1%, 64.18%±13.27% vs 49.43%±12.54%），降低U937细胞S期细胞比例（9.67%±2.61% vs15.26%±5.58%）。而EPZ005687对NBMCD34 +细胞的细胞周期没有影响。EPZ005687对U937细胞H3K27的甲基化有明显的抑制作用（P < 0.05），但对NBMCD34 +细胞H3K27的甲基化几乎没有影响。由此可见，EPZ005687具有抑制白血病细胞增殖、诱导细胞凋亡和阻断G1期细胞周期的作用。该药具有潜在的临床应用价值。[3]

体内EZH2抑制对tac诱导的PAH有保护作用[2]
为了评估EZH2对肺动脉高压发展的生物学影响，我们首先测量了自主呼吸小鼠的RVSP，作为肺动脉压的指标，在假对照和TAC手术后，EPZ005687或DMSO按方法腹腔注射。在TAC后第28天，TAC组RVSBP明显高于假对照组(图2（a)和2(d)）。此外，如图2(b)和2(c)所示，TAC小鼠的RV和肺重量与体重之比分别比假对照小鼠显著增加2.1倍和2.6倍。EPZ005687治疗可显著缓解RVSBP、LV和肺重/体重比值的进一步升高。这些发现表明，EPZ005687治疗可能在体内对tac诱导的PAH和RV肥大具有显著的保护作用。

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EZH2抑制调节肺氧化反应[2]
活性氧是生理和病理过程的重要组成部分。近年来，ROS被认为是一种信号分子，可以介导血管系统中的特定细胞反应。此外，有证据表明ROS的积累有助于PAH的发展。为了研究ROS在tac诱导的PAH模型中的作用，我们利用DHE荧光探针检测小鼠冷冻肺切片中ROS的产生。图3(a)显示，与假对照组相比，EZH2沉默使tac诱导的PAH诱导的ROS产生从18.3倍减少到4.8倍。正如预期的那样，EPZ005687处理显著抑制了tac诱导的PAH引起的肺硝基酪氨酸升高（图3(b)）。这些发现表明，抑制EZH2可减少tac诱导的多环芳烃引起的肺部氧化反应。

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EZH2抑制tac诱导的PAH小鼠肺SOD1表达[2]
SOD1负责破坏体内的游离超氧化物自由基。根据肺内氧化反应，与假对照组相比，TAC + DMSO组SOD1表达明显下调，EZH2表达上调(图4（a)和4(b)）。由于EZH2与SOD1表达呈负相关，接下来，我们研究了EZH2与SOD1的关系。有趣的是，我们观察到EPZ005687处理可以抑制EZH2的表达，逆转SOD1的表达下降(图4（a)和4(b)）。因此，我们假设EZH2可能通过靶向SOD1促进tac诱导的PAH。染色质免疫沉淀（ChIP）分析显示，TAC + DMSO组EZH2和三甲基化组蛋白H3K27 （H3K27Me3）在SOD1启动子上积累，而在Gapdh启动子上没有积累。使用EPZ005687处理来验证EZH2在SOD1转抑制中的作用。事实上，EPZ005687治疗可以逆转SOD1启动子上EZH2和H3K27Me3积累的增加（图4(c)），并增加tac诱导的PAH小鼠肺中SOD1的表达(图4（a)和4(b)）。综上所述，这些数据表明EZH2通过抑制SOD1转录来调节细胞内ROS水平，以响应tac诱导的PAH刺激。

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关节内注射 EPZ005687 延迟了小鼠 OA 的发展。

生化酶测定[2]
重组纯化的人PRC2复合物含有WT EZH2、Y641 EZH2突变体、A677G EZH2或WT EZH1，如前所述1,2。鸡红细胞寡核小体按照前面描述的方法纯化。生物素化组蛋白肽由21世纪生物化学公司合成，高效液相色谱纯化纯度为95%。384孔闪片和Microscint 0闪烁液购自商业公司，96孔Multiscreen HTS滤网结合板购自Millipore公司。3H标记的S-腺苷蛋氨酸（3H- SAM）经市售获得，比活性为80 Ci/mmol。未标记的SAM和S-‐腺苷型同型半胱氨酸（SAH）在商业上获得。闪光板在Biotek ELx- 405中用0.1%的Tween洗涤。384孔闪光板和96孔滤镜结合板在TopCount微孔板读取仪上读取。在Freedom EVO上进行化合物系列稀释，并使用Thermo Scientific Matrix PlateMate将其标记到分析板上。

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酶抑制IC50值测定[2]
EPZ005687在DMSO中连续稀释3倍，从2.5 mM开始（化合物的最终最高浓度为50 μM， DMSO为2%），绘制10点曲线。在384孔微滴板上检测1 μL抑制剂稀释系列。100%抑制对照为1mm终浓度的产物抑制剂S—‐腺苷型同型半胱氨酸（SAH）。化合物在1X缓冲液（20 mM比辛[pH 7.6]， 0.002%吐温20,0.005%牛皮明胶和0.5 mM DTT）中以每孔40 μL 5 nM PRC2 （50 μL最终测定浓度为4 nM）孵育30 min。每孔加入10 μL的底物混合物，包括实验缓冲液3H- SAM，未标记的SAM和代表组蛋白H3残基21 - 44的肽，其中含有C-末端生物素（附加在C-末端酰胺覆盖的赖氨酸上），以启动反应(两种底物都以各自的Km值存在于最终的反应混合物中，实验格式称为“平衡条件”4。底物的最终浓度和底物肽的甲基化状态在补充表7中显示。反应在室温下孵育90分钟，用每孔10 μL的600 μM未标记的SAM淬灭，然后转移到384孔的Flashplate上，30分钟后清洗。

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EPZ005687——底物竞争[2]
384孔中50 μL总容积的SAM竞赛实验条件与IC50实验相似，但有以下不同。EPZ005687在DMSO（终浓度2%）中连续稀释2倍，得到10点曲线。在0.012 ~ 15 μM范围内对SAM进行滴定。为了监测反应，在每个反应中使用放射性示踪剂3H—‐SAM，相当于高达250 nM（占总SAM浓度）。当SAM浓度小于250 nM时，反应中只含有3H—‐SAM。每个SAM浓度都有对应的孔，反应中不存在酶作为阴性对照，以减去3H—‐SAM对背景信号的贡献。反应孵育90 min后，以每孔10 μL的600 μM SAM溶液淬灭。寡核小体竞争在与IC50测定中描述的相同的实验缓冲液中以96孔格式进行，只是补充了100 mM KCl。EPZ005687在DMSO（终浓度2%）中连续稀释2倍，得到10点曲线。寡核小体用2倍稀释方案滴定8个点，最高浓度为500 nM，最终酶反应体积为50 μL。反应通过加入SAM和3H-‐SAM的混合物开始，最终浓度分别为450和150 nM。加入10 μL的SAM （600 μM）淬灭反应，并将30 μL的反应加入96孔过滤结合板中。用200 μL 10%三羧酸洗涤3次，再用95%乙醇洗涤1次。将膜风干，加入30 μL Microscint 0，然后在TopCount中读取。

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磁下拉EZH2以确定EPZ005687对PRC2复合物内蛋白-蛋白相互作用的影响[2]
Anti- FLAG M2磁珠的50%悬浮液在1X实验缓冲液中洗涤3次，缓冲液由20 mM比辛（pH = 7.6）和0.002% Tween20组成。含有FLAG标记EED的PRC2复合物（500 nM）与10 μM EPZ005687在1X实验缓冲液中孵育。添加的化合物对DMSO的贡献为1%，因此还包括1% DMSO的车辆对照。然后将孵育液加入50 μL洗涤珠中，在96孔聚丙烯微孔板的孔中重悬于50 μL 1X实验缓冲液中，室温孵育1小时。用微孔板磁铁拉下微珠，取50 μL上清。用100 μL 1X缓冲液洗涤3次，用50 μL 1X缓冲液重悬。然后将上清液和微球与等体积的2X SDS-‐PAGE凝胶上样缓冲液混合，煮沸10分钟。样品在8% Tris -- -甘氨酸SDS -- - PAGE凝胶上在125V下运行90分钟，然后用GelCode Blue染色。

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Yonetani—theorll分析法测定SAH与EPZ005687的互斥结合[2]
SAH和EPZ005687被连续稀释，并在384孔的微孔板上以网格模式进行标记，这样就可以获得SAH和EPZ005687的所有浓度组合。为此，40 μL含有PRC2 （4 nM）和生物素的混合物在1X实验缓冲液中（20 mM比辛[pH 7.6]， 0.002%吐温20,0.005%牛皮明胶和0.5 mM DTT）。每孔加入10 μL底物混合物，包括实验缓冲液3H- SAM （150 nM）、未标记的SAM （1800 nM）和代表组蛋白H3残基21 - 44(含C-末端生物素（附加在C-末端酰胺覆盖的赖氨酸上）的肽段（185 nM），以启动反应(两种底物都以各自的Km值存在于最终的反应混合物中，实验格式称为“平衡条件”4。反应在室温下孵育90分钟，用每孔10 μL的600 μM未标记的SAM淬灭，然后转移到384孔的Flashplate上，30分钟后清洗。在几种不同浓度的EPZ005687下，反应速度的反比作为SAH浓度的函数绘制，得到Yonetani—‐theorll图。

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EPZ005687对77个人体离子通道和gpcr的选择性研究[2]
EPZ005687在Cerep提供的标准面板上进行了放射性标记配体的位移测试，已知这些配体可以结合77个人体离子通道和gpcr。EPZ005687在10 μM的浓度下进行了重复测试，并将受体的特异性配体结合定义为在过量未标记配体存在的情况下确定的总结合和非特异性结合之间的差异。补充表1中的结果表示为特异性结合控制的百分比（（测量的特异性控制/特异性控制结合）× 100）。补充表1还显示了参考放射配体的身份及其结合亲和力。

甲基化过程 [1]
在时间过程的第1- 4天，将WSU- DLCL2细胞在每个时间点的T- 75烧瓶中镀上，最终密度为5x104- 1x105个细胞/mL，并用DMSO或1.5或5.6uM EPZ005687处理。在每个时间点，通过离心收集细胞，用PBS洗涤，并按前面描述的方法提取组蛋白6。用DMSO或1.5或5.6uM EPZ005687处理的第二组WSU -- DLCL2细胞在第0天建立，在第4天计数，并在第5天和第6个时间点分裂回原始电镀密度。

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ELISA [1]
用EPZ005687（指定终浓度）处理线性对数相生长的细胞，制备酸提取组蛋白。用等量浓度的组蛋白在包衣缓冲液（PBS+0.05%BSA）中制备，得到0.5 ng/ul样品，并将100 ul样品或标准品一式添加到两个96孔ELISA板中。将培养皿密封，在4°C下孵育过夜。第二天，用300 ul/孔PBST (PBS+0.05% Tween 20；10X PBST, KPL #51—‐14—‐02)在Bio Tek洗板机上。用300 ul/孔的稀释液（PBS+2%BSA+0.05% Tween 20）封板，RT孵育2小时，用PBST洗涤3次。所有抗体用稀释液稀释。在每个板中加入100 ul/孔的抗H3K27me3或抗总H3。板在RT下孵育90分钟，用PBST洗涤3次。在H3K27Me3板和H3板中分别加入1:20 00和1:6 00的anti- Rb- IgG- HRP，每孔100 ul，在室温下孵育90分钟。用PBST洗涤4倍。检测时，加入100 ul/孔的TMB底物，在室温下黑暗孵育5分钟。用100 ul/孔的1N H2SO4停止反应。在SpectaMax M5微孔板读取仪上读取450 nm处的吸光度。

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表达谱样品制备[1]
在时间过程的第1、2和4天，将WSU- DLCL2细胞在每个时间点的6孔板中，最终初始播种密度为1x105个细胞/mL，并用DMSO或1.5或5.6uM EPZ005687处理。在每个时间点，通过离心收集细胞，用PBS洗涤，细胞颗粒快速冷冻。第二组用DMSO或1.5或5.6uM EPZ005687处理的WSU- DLCL2细胞在第0天建立，在第4天计数，分裂回原始电镀密度，并在第6天时间点重新给药DMSO或1.5或5.6uM EPZ005687。

Balb/c mice (6–8 weeks) were assigned randomly to three experimental groups: (a) sham control group, injected peritoneally with DMSO for 4 weeks once a week; (b) TAC group, injected peritoneally with DMSO for 4 weeks once a week; and (c) TAC group, injected peritoneally with EPZ005687 (10 mg kg−1) for 4 weeks once a week. The injection was performed at 1, 8, 15, and 22 days post-TAC or sham operation.[2]

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5.6 μM, 50 μL; intra-articular injection

Osteoarthritis (OA) mouse model

[1]. A selective inhibitor of EZH2 blocks H3K27 methylation and kills mutant lymphoma cells. Nat Chem Biol. 2012;8(11):890-6.

[2]. EZH2 Inhibition Ameliorates Transverse Aortic Constriction-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice. Can Respir J. 2018 Feb 28;2018:9174926.

[3]. Effects of H3K27 methylation inhibitor EPZ005687 on apoptosis, proliferation and cell cycle of U937 cells and normal CD34 positive cells. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2014 Dec;22(6):1561-6.

1-cyclopentyl-N-[(4,6-dimethyl-2-oxo-1H-pyridin-3-yl)methyl]-6-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-4-indazolecarboxamide is a member of indazoles.

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EZH2 catalyzes trimethylation of histone H3 lysine 27 (H3K27). Point mutations of EZH2 at Tyr641 and Ala677 occur in subpopulations of non-Hodgkin's lymphoma, where they drive H3K27 hypertrimethylation. Here we report the discovery of EPZ005687, a potent inhibitor of EZH2 (K(i) of 24 nM). EPZ005687 has greater than 500-fold selectivity against 15 other protein methyltransferases and has 50-fold selectivity against the closely related enzyme EZH1. The compound reduces H3K27 methylation in various lymphoma cells; this translates into apoptotic cell killing in heterozygous Tyr641 or Ala677 mutant cells, with minimal effects on the proliferation of wild-type cells. These data suggest that genetic alteration of EZH2 (for example, mutations at Tyr641 or Ala677) results in a critical dependency on enzymatic activity for proliferation (that is, the equivalent of oncogene addiction), thus portending the clinical use of EZH2 inhibitors for cancers in which EZH2 is genetically altered.[1]

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EPZ005687 is a selective inhibiter of methyltransferase EZH2. In this article, we investigated the protective role and mechanism of EPZ005687 in transverse aortic constriction-induced pulmonary arterial hypertension in mice. Methods We assigned 15 (6–8 weeks old) male balb/c mice to 3 groups randomly: Sham control + DMSO group, TAC + DMSO group, and TAC + EPZ005687 group (10 mg kg−1, once a week for 4 weeks). On day 28 following TAC operation, the right ventricular systolic blood pressure (RVSBP) was measured, and lung tissues were collected for laboratory examinations (DHE, Western blot, real-time PCR, and ChIP). Results Murine PAH model was successfully created by TAC operation as evidenced by increased RVSBP and hypertrophic right ventricle. Compared with the sham control, TAC-induced PAH markedly upregulated the expression of EZH2 and ROS deposition in lungs in PAH mice. The inhibiter of methyltransferase EZH2, EPZ005687 significantly inhibits the development of TAC-induced PAH in an EZH2-SOD1-ROS dependent manner. Conclusion Our data identified that EZH2 serves a fundamental role in TAC-induced PAH, and administration of EPZ005687 might represent a novel therapeutic target for the treatment of TAC-induced PAH.[2] The aim of this study was to investigate the effects of H3K27 methylation inhibitor EPZ005687 on the apoptosis, proliferation and cell cycle of U937 cells and normal CD34⁺ cells. The U937 cells and normal CD34⁺ cells were treated with different concentration of EPZ005687 at different time points. The apoptosis rate was determined by Annexin V/PI staining. The cell proliferation and cell cycle was determined using WST-1 assay and 7-AAD assay, respectively. The activity of H3K27 methylation was detected by chemiluminescent immunoassay. The results showed that the EPZ005687 induced an obvious apoptosis of U937 cells. The apoptotic rate was 3.96% ± 0.79%,5.74% ± 0.73%,13.34% ± 1.77% and 25.24% ± 2.55% in U937 cells treated with 0.5, 1, 5 and 10 µmol/L EPZ005687 for 48 hours, respectively. However, EPZ005687 had rare effect on normal bone marrow(NBM) CD34⁺ cells. The apoptotic rate was 3.64% ± 0.62%,4.28% ± 0.99%,6.18% ± 1.19% and 7.56% ± 1.34% after U937 cells were treated with 0.5, 1, 5 and 10 µmol/L EPZ005687 for 48 hours, respectively. EPZ005687 inhibited obviously the proliferation of U937 cells but had weak effect on the proliferation of NBMCD34⁺ cells. The inhibitory effect of EPZ005687 on U937 cells was time-dependent after treated with 0.5, 1, 5 and 10 µmol/L EPZ005687 from 12 to 96 hours. EPZ005687 induced G1 phase blocking (G1%, 64.18% ± 13.27% vs 49.43% ± 12.54%) and decreased the percentage of cells in S phase (9.67% ± 2.61% vs15.26% ± 5.58%) in U937 cells. However, EPZ005687 had no effect on the cell cycle of NBMCD34⁺ cells. In addition, EPZ005687 produced obviously depletion of H3K27 methylation in U937 cells (P < 0.05), but hardly had effect on the H3K27 methylation of NBMCD34⁺ cells. It is concluded that the EPZ005687 inhibites proliferation, induces apoptosis and cell cycle blocking in G1 phase in leukemia cells. This agent may have potential value in clinical application.[3]

C32H37N5O3

539.67

539.289

1396772-26-1

60160561

Off-white to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

797.9±60.0 °C at 760 mmHg

436.4±32.9 °C

0.0±2.8 mmHg at 25°C

1.676

2.96

92.51

2

5

7

40

991

0

ZOIBZSZLMJDVDQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C32H37N5O3/c1-21-15-22(2)35-32(39)28(21)18-33-31(38)27-16-25(17-30-29(27)19-34-37(30)26-5-3-4-6-26)24-9-7-23(8-10-24)20-36-11-13-40-14-12-36/h7-10,15-17,19,26H,3-6,11-14,18,20H2,1-2H3,(H,33,38)(H,35,39)

1-cyclopentyl-N-((4,6-dimethyl-2-oxo-1,2-dihydropyridin-3-yl)methyl)-6-(4-(morpholinomethyl)phenyl)-1H-indazole-4-carboxamide.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (3.09 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 16.7 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (3.09 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 16.7mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (3.09 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 16.7 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。