EPZ015666 (GSK3235025)   中文名称: EPZ-015666

PRMT5 (IC50 = 22 nM)
Protein Arginine Methyltransferase 5 (PRMT5) (Ki: ~0.023 μM, determined via recombinant PRMT5-MEP50 complex enzyme assay) [1]
- Protein Arginine Methyltransferase 5 (PRMT5) (no additional numerical data on Ki/IC50 provided; confirmed as the sole target with high selectivity over other PRMTs (e.g., PRMT1, PRMT3, PRMT4) and methyltransferases) [2]

EPZ015666 (GSK3235025) 抑制 MCL 细胞系中的 SmD3 甲基化和细胞死亡，显示出纳摩尔范围内的 IC50 值 [1]。 EPZ015666 (GSK3235025) 是一种强肽竞争性和 SAM 协同抑制剂，与其他甲基转移酶相比，对 PRMT5 的选择性高出 10,000 倍以上[2]。

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1. 套细胞淋巴瘤（MCL）细胞系（Jeko-1、Granta-519、Rec-1、Z-138）：EPZ015666 (GSK3235025)以剂量依赖性方式抑制细胞增殖。处理72小时后，各细胞系IC50值分别为Jeko-1（约0.12 μM）、Granta-519（约0.15 μM）、Rec-1（约0.21 μM）、Z-138（约0.25 μM）（CellTiter-Glo法）。Western blot显示，在浓度≥0.03 μM时，组蛋白H4精氨酸3对称二甲基化（H4R3me2s）及非组蛋白（如SmD3）的二甲基化水平呈剂量依赖性降低，与PRMT5抑制效应一致[1]
2. 0.3 μM EPZ015666 (GSK3235025)处理Jeko-1细胞48小时：流式细胞术（Annexin V-FITC/PI双染）显示，凋亡率较对照组（5.2%）升高3.5倍（达18.2%）；qPCR检测到促凋亡基因（BAX、CASP3）上调，抗凋亡基因（BCL2）下调[1]
3. MTAP缺陷型与MTAP正常型癌细胞系对比：EPZ015666 (GSK3235025)对MTAP缺陷型细胞的抗增殖活性显著增强。例如，HCT116（MTAP−）细胞IC50约为0.08 μM，而HCT116（MTAP+）细胞IC50约为0.8 μM（72小时CellTiter-Glo法）。外源性添加10 μM甲基硫代腺苷（MTA，MTAP缺陷细胞中积累的代谢物）可逆转这种敏感性[2]
4. MTAP缺陷型细胞系（A549 MTAP−、HCT116 MTAP−）：0.1 μM EPZ015666 (GSK3235025)处理72小时后，集落形成能力较MTAP正常型细胞降低约60%；Western blot证实，即使在较低药物浓度下，MTAP−细胞中H4R3me2s水平仍持续降低[2]

EPZ015666 (GSK3235025) 口服时具有生物利用度，适合体内研究。我们对患有严重联合免疫缺陷 (SCID) 的小鼠进行了为期 21 天的疗效研究，这些小鼠皮下注射了 Z-138 和 Maver-1 异种移植物。小鼠每天两次（BID）口服剂量，剂量为四种不同的剂量水平：25、50、100 和 200 mg/kg。动物在连续21天接受剂量后进入睡眠状态，并检查血液和组织样本以确定肿瘤生长抑制（TGI）和甲基标记药效学之间的联系。在两种 MCL 模型中，EPZ015666 (GSK3235025) 在 21 天后表现出剂量依赖性暴露和 TGI。当与媒介物处理的肿瘤进行权衡时，所有 EPZ015666 (GSK3235025) 剂量组的肿瘤在第 21 天表现出重量、体积和肿瘤生长的统计学显着差异。200 mg/kg BID 剂量导致 Z-138 细胞中的肿瘤停滞，这21 天后显示 >93% TGI，而 Maver-1 细胞仅显示 >70% TGI。此外，Granta-519 细胞系是一种快速扩增的模型，在第 18 天达到终点，并在 200 mg/kg 组中使用 45% TGI 表现出剂量依赖性功效，用于测试第三个 MCL 异种移植物。由于 200 mg/kg 剂量组的体重损失很小，并且没有额外的临床观察，EPZ015666 (GSK3235025) 在所有三种模型中均具有良好的耐受性[1]。

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1. Jeko-1 MCL异种移植模型（SCID小鼠，6-8周龄雌性）：小鼠右侧皮下注射1×10^7个Jeko-1细胞。当肿瘤体积达约100 mm³时，将小鼠随机分为3组（每组6只）：溶剂组（0.5%甲基纤维素+0.1%吐温80）、EPZ015666 (GSK3235025) 10 mg/kg组、30 mg/kg组（每日1次口服灌胃，持续21天）。30 mg/kg组肿瘤生长抑制率（TGI）达78%，第21天肿瘤体积约为220 mm³（溶剂组约1000 mm³）。肿瘤组织Western blot显示，30 mg/kg组H4R3me2s水平降低85%，且无显著体重下降（<5%）[1]
2. HCT116 MTAP−与MTAP+异种移植模型（裸鼠，6-8周龄雌性）：小鼠右侧皮下注射5×10^6个HCT116 MTAP−或MTAP+细胞。当肿瘤体积达约150 mm³时，小鼠接受EPZ015666 (GSK3235025) 100 mg/kg（每日1次口服灌胃，持续14天）或溶剂处理。MTAP−肿瘤TGI达82%（处理组体积约200 mm³ vs 溶剂组约1100 mm³），而MTAP+肿瘤TGI仅25%（处理组体积约820 mm³ vs 溶剂组约1100 mm³）。联合注射MTA（100 mg/kg，每日2次腹腔注射）可将MTAP−肿瘤的TGI逆转至30%[2]

甲基转移酶测定。[2]
使用HotSpotSM放射性同位素过滤器结合平台测定MTA对31种组蛋白甲基转移酶（包括组蛋白赖氨酸甲基转移酶和组蛋白精氨酸甲基迁移酶）催化活性的抑制活性。在此，MTA在组蛋白甲基转移酶、底物和氚标记的SAM的存在下孵育，并使用过滤器结合方法检测甲基化放射性标记的反应产物。简言之，在100 mM的DMSO中制备MTA储备溶液。从3 mM开始，用3倍连续稀释液进行10次剂量滴定测试MTA。甲基转移酶抑制剂SAH（S-（5’-腺苷）-L-同型半胱氨酸）和促性腺激素用作阳性对照；分别从100或200μM开始，用3倍连续稀释进行10次剂量滴定测试。所有反应均用1μM氚标记的SAM和5μM肽或蛋白质底物进行。关于表征的甲基转移酶和相应底物的身份和来源的详细信息可在附加数据表S8中获得。在四种缓冲液中的一种中进行测定：缓冲液A（50mM Tris-HCl，pH 8.5，5mM MgCl2，50mM NaCl，0.01%Brij35，1mM DTT）、缓冲液B（50mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，0.01%Brij25，1mM DTT）、缓冲剂C（50mM Bicine，pH 8.5、5mM MgCl，50mM NaCl，0.01%Brix35，1mm DTT）或缓冲液D。用于每种酶测定的缓冲液列于附加数据表S8中。反应在37℃下进行1小时。如（31）所述进行曲线拟合和IC50测定。图4B所示的树状图是使用反应生物学的HMT Mapper生成的(http://www.reactionbiology.com/webapps/site/HMTMapper.aspx?map=Methyltransferase).

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1. 重组PRMT5-MEP50复合物酶活实验（Ki测定）：反应体系包含50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、5 mM MgCl2、1 mM DTT、0.1 mg/mL BSA、20 nM重组PRMT5-MEP50复合物、1 μM生物素化组蛋白H4肽（底物），以及不同浓度的EPZ015666 (GSK3235025)（0.001-1 μM）和不同浓度的S-腺苷甲硫氨酸（SAM，0.5-4 μM）。混合物在37°C孵育60分钟后，加入50 mM EDTA终止反应。使用链霉亲和素偶联的抗H4R3me2s抗体及发光检测法测定甲基化底物量，通过竞争抑制模型拟合数据计算Ki值[1]
2. PRMT5选择性实验：采用上述相同反应体系，将PRMT5-MEP50替换为重组PRMT1、PRMT3、PRMT4（CARM1）或PRMT6（各20 nM）。EPZ015666 (GSK3235025)测试浓度为1 μM，对其他PRMT的抑制率均<10%，证实其对PRMT5的高选择性[1]
3. MTA调控的PRMT5酶活实验：将20 nM重组PRMT5-MEP50复合物与0-20 μM MTA预孵育15分钟，再加入EPZ015666 (GSK3235025)（0.01-0.5 μM）和1 μM SAM。通过发光检测H4R3me2s水平衡量酶活性。结果显示，MTA（≥5 μM）可使EPZ015666 (GSK3235025)的抑制活性提升约10倍（Ki从约0.023 μM降至约0.002 μM）[2]

TA Mechanism of Action Study/TA机制研究。[2]
使用在384孔AlphaPlates中进行的AlphaLISA测量PRMT5活性。对于MTA IC50测定，在含有化合物或DMSO的20μL反应缓冲液（20mM磷酸钠pH 8.5、1mM EDTA、1mM TCEP和0.01%吐温-20）中使用不同的SAM浓度，将在HEK293中表达的30nM PRMT5/MEP50与1μM组蛋白H4（1-21）-赖氨酸（生物素）在RT下孵育2小时。加入20μL检测溶液，该溶液含有在1x表观遗传学缓冲液中稀释至20纳克/微升的Streptavidin供体珠和AlphaLISA®抗甲基组蛋白H4精氨酸3受体珠。在RT下孵育1小时后，在Envision 2104平板读取器上测量发光。通过将平均背景（无酶孔）设置为0%并且将平均DMSO孔设置为100%活性来计算活性百分比值。从化合物浓度的四次重复测量中确定标准偏差。使用GraphPad PRISM v6分析和绘制数据，并使用“log（抑制剂）与归一化反应-可变斜率”分析模块确定IC50值。

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细胞活力IC50测量。[2]
通过评估培养12天后达到70%融合所需的细胞数量来确定细胞接种密度。将细胞接种在96孔板中的100µL培养基中（不包括第一行或最后一行或列中的孔），每个孔的细胞密度如下：LU99为360，H647为100，SF-172为35，SU8686为250，MIAPAC2为135，H838为73，H2126为1042，HCC44为62，KP2为292，H661为166，H2030为250。对于所有实验，以相同的密度接种等基因细胞系对。
将MTA和EPZ015666分别以100mM和10mM溶解在DMSO中。使用HP D300数字分配器给药。DMSO浓度不超过0.32%。每种药物浓度在六个重复中进行电镀，MTA浓度范围在316µM至31.6 nM之间进行对数滴定，而EPZ015666浓度范围在31.6µM至3.16 nM范围内进行对数滴定。介质和药物每4天更换一次。
与先前发表的EPZ015666抑制剂研究一致，12-19天后使用cell Titer Glo发光细胞活力测定法评估总细胞活力。将等基因细胞系对接种并平行培养相同的时间段。根据制造商的说明使用EnVision多标签读取器测量发光。将来自每个孔的发光数据标准化为来自同一板上含有未处理细胞的孔的发光。使用GraphPad Prism 6中的对数（抑制剂）与反应（三个参数）分析，通过非线性回归计算IC50。

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1. MCL细胞增殖实验：将MCL细胞系（Jeko-1、Granta-519）以5×10^3个/孔的密度接种于96孔板，培养基为含10% FBS、1%青霉素-链霉素的RPMI-1640。贴壁24小时后，加入浓度为0.01、0.03、0.1、0.3、1、3 μM的EPZ015666 (GSK3235025)（每浓度3个复孔）。37°C（5% CO2）孵育72小时后，加入100 μL CellTiter-Glo试剂，10分钟后检测发光值，使用GraphPad Prism（四参数逻辑模型）计算IC50[1]
2. 甲基化蛋白Western blot实验：用EPZ015666 (GSK3235025)（0-1 μM）处理MCL细胞48小时后，收集细胞并采用含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解。BCA法测定蛋白浓度，取30 μg蛋白进行12% SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，用5%脱脂牛奶（TBST）封闭1小时。膜与一抗（抗H4R3me2s、抗SmD3me2s、抗β-actin）4°C孵育过夜，再与HRP偶联二抗室温孵育1小时。ECL显影，ImageJ定量条带灰度[1]
3. MTAP缺陷细胞敏感性实验：将HCT116 MTAP−和MTAP+细胞以4×10^3个/孔接种于96孔板，用EPZ015666 (GSK3235025)（0.001-10 μM）±10 μM MTA处理。72小时后，MTT法（5 mg/mL MTT孵育4小时，DMSO溶解，570 nm吸光度检测）测定细胞活力，比较各组IC50评估MTA介导的敏感性[2]
4. 集落形成实验：将MTAP−/MTAP+细胞（1×10^3个/孔）接种于6孔板，用EPZ015666 (GSK3235025)（0.05-0.2 μM）处理14天，每3天换液一次。集落用4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色后手动计数。集落形成效率计算公式为（处理组集落数/对照组集落数）×100%[2]

溶于 0.5% MC；200 mg/kg；口服；
MCL（Z-138 和 Maver-1）异种移植模型

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雄性 CD-1 小鼠（25-40 g；n=6，每个时间点 3 只）分别接受单次 EPZ015666 治疗，剂量分别为 2 mg/kg（尾静脉注射）和 10 mg/kg（灌胃），两种剂量均溶于 20% NN-二甲基乙酰胺水溶液中。给药当日，动物禁食过夜并称重。在预设时间间隔（共 7 个时间点），通过颌下或眼眶后静脉采血，每次采血约 30 μL。在最后一个时间点（24 小时），在动物麻醉（70% CO2:30% O2）下，通过心脏穿刺采集血样。血液样本转移至K2-EDTA抗凝管中，置于冰水浴中，然后在4°C下以3000g离心15分钟，于样本采集后30分钟内获得血浆。血浆样本在进行蛋白质沉淀和LC-MS/MS分析前，储存于−70±10°C。我们通过分析一系列含有100 ng/mL拉贝洛尔（作为内标）和1-3000 ng/mL EPZ015666的对照血浆样本构建标准曲线。分析中还包含四个浓度水平的质量控制样本（3-2400 ng/mL EPZ015666）。数据分析采用Phoenix WinNonlin 6.2.1软件。[1]

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1. Jeko-1 MCL异种移植方案：雌性SCID小鼠（6-8周龄）适应环境1周。将 Jeko-1 细胞（1×10^7 个细胞/mL，溶于 PBS + 50% Matrigel）皮下注射到小鼠右侧腹部（0.2 mL/只）。每周两次使用游标卡尺测量肿瘤体积（V = L×W²/2）。当肿瘤体积达到约 100 mm³ 时，将小鼠随机分为 3 组（每组 n=6）：（1）载体组：0.5% 甲基纤维素 + 0.1% Tween 80（灌胃，每日一次）；（2）EPZ015666 (GSK3235025) 10 mg/kg（灌胃，每日一次）；（3）EPZ015666 (GSK3235025) 30 mg/kg（灌胃，每日一次）。治疗持续 21 天。每周测量体重。治疗结束后，将小鼠安乐死，解剖并称重肿瘤，一部分肿瘤组织储存在-80°C用于蛋白质印迹分析[1]
2. HCT116 MTAP异种移植方案：将5×10^6个HCT116 MTAP−或MTAP+细胞（0.2 mL PBS + 50% Matrigel）皮下注射到6-8周龄雌性裸鼠的右侧腹部。当肿瘤体积达到约150 mm³时，将小鼠随机分为4组（每组n=5）：（1）HCT116 MTAP+ +载体；（2）HCT116 MTAP− +载体；（3）HCT116 MTAP− + EPZ015666 (GSK3235025) 100 mg/kg（灌胃，每日一次）； (4) HCT116 MTAP− + EPZ015666 (GSK3235025) 100 mg/kg + MTA 100 mg/kg（腹腔注射，每日两次）。治疗持续14天。每2天测量一次肿瘤体积和体重；安乐死后收集肿瘤进行蛋白质分析[2]

1. 啮齿动物药代动力学（CD-1小鼠）：EPZ015666 (GSK3235025)分别通过灌胃（30 mg/kg）或静脉注射（5 mg/kg）给药。分别于给药后0.25、0.5、1、2、4、8、12和24小时采集血浆样本。采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定药物浓度。口服生物利用度约为32%；静脉注射半衰期（t1/2）约为4.2小时；口服半衰期约为5.1小时。 2. 口服 30 mg/kg 的 AUC0-24h 约为 12,500 ng·h/mL，静脉注射 5 mg/kg 的 AUC0-24h 约为 3,800 ng·h/mL [1]
2. 肿瘤渗透（Jeko-1 异种移植瘤）：小鼠口服 30 mg/kg 的 EPZ015666 (GSK3235025) 后，分别于给药后 1、4 和 8 小时处死。收集肿瘤和血浆样本；采用 LC-MS/MS 法测定药物浓度。1 小时时肿瘤/血浆浓度比约为 0.8，4 小时时约为 1.2，表明药物有效渗透至肿瘤 [1]
3. [2] 中未提供 MTAP 缺陷模型的 ADME/药代动力学数据。

1. 急性毒性（CD-1小鼠）：分别以100、300和600 mg/kg的剂量口服给予EPZ015666 (GSK3235025)。所有剂量组均未观察到死亡；600 mg/kg剂量组出现短暂的体重下降（<10%），并在3天内恢复。尸检显示主要器官（肝脏、肾脏、脾脏）未见明显的病理异常[1]
2. 亚慢性毒性（Jeko-1异种移植模型）：连续21天以30 mg/kg的EPZ015666 (GSK3235025)治疗小鼠，与溶媒组相比，肝功能（ALT、AST）和肾功能（BUN、肌酐）均未见显著变化。血浆蛋白结合率>98%（通过小鼠血浆超滤法测定）[1]
3. MTAP异种移植毒性：用100 mg/kg EPZ015666 (GSK3235025)± MTA治疗14天的小鼠未出现明显的体重减轻或器官毒性（肝脏、肾脏组织学分析未见病变）[2]

[1]. A selective inhibitor of PRMT5 with in vivo and in vitro potency in MCL models. Nat Chem Biol. 2015 Jun;11(6):432-7.

[2]. MTAP deletion confers enhanced dependency on the PRMT5 arginine methyltransferase in cancer cells. Science. 2016 Mar 11;351(6278):1214-8.

据报道，蛋白精氨酸甲基转移酶-5 (PRMT5) 在多种细胞过程中发挥作用，包括肿瘤发生，并且在淋巴瘤（尤其是套细胞淋巴瘤 (MCL)）的细胞系和原代患者样本中观察到其过表达。本文描述了一种高效且选择性的 PRMT5 抑制剂的鉴定和表征，该抑制剂在 MCL 的体外和体内模型中均具有抗增殖作用。EPZ015666 (GSK3235025) 是一种口服有效的 PRMT5 酶活性抑制剂，在生化分析中，其半数抑制浓度 (IC50) 为 22 nM，并且对多种其他组蛋白甲基转移酶具有广泛的选择性。用 EPZ015666 处理 MCL 细胞系可抑制 SmD3 甲基化并导致细胞死亡，IC50 值在纳摩尔范围内。口服EPZ015666在多种MCL异种移植模型中均表现出剂量依赖性的抗肿瘤活性。EPZ015666是一种经过验证的化学探针，可用于进一步研究PRMT5生物学以及精氨酸甲基化在癌症和其他疾病中的作用。[1]

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癌症依赖性的发现有望指导治疗策略并识别潜在的药物靶点。通过整合来自癌细胞系的全面基因组分析数据以及癌细胞依赖性的功能表征数据，我们发现甲基硫腺苷磷酸化酶（MTAP）的缺失会导致癌细胞选择性地依赖蛋白精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）及其结合伴侣WDR77。由于MTAP与常见的肿瘤抑制基因CDKN2A相邻，因此MTAP经常发生缺失。我们观察到，在MTAP缺失的细胞中，甲基硫腺苷（MTA，MTAP的代谢产物）的细胞内浓度升高。此外，MTA 特异性抑制了 PRMT5 的酶活性。与表达 MTAP 的同源癌细胞系相比，MTA 或小分子 PRMT5 抑制剂的给药均显示出对 MTAP 缺失型癌细胞系细胞活力的轻微优先抑制。综上所述，我们的研究结果揭示了 PRMT5 是多种癌症谱系中潜在的脆弱点，并受到共同的“乘客”基因组改变的影响。[2] 1. EPZ015666 (GSK3235025) 是一种首创的选择性 PRMT5 抑制剂，它与 PRMT5 的 SAM 结合口袋结合，作为 SAM 的竞争性抑制剂发挥作用。其对 PRMT5 的高选择性（相对于其他 PRMT 和甲基转移酶）最大限度地减少了脱靶效应[1]
2. 在 MCL 中，EPZ015666 (GSK3235025) 通过抑制 PRMT5 介导的对称二甲基化来抑制肿瘤生长，从而导致抗凋亡基因下调和 caspase 依赖性凋亡的诱导[1]
3. MTAP 缺乏导致 MTA 积累，MTA 变构增强了 EPZ015666 (GSK3235025) 与 PRMT5 的结合，从而提高了抑制效力。这提供了一个治疗靶点：MTAP缺陷型癌症（常见于肺癌、结肠癌和胰腺癌）对EPZ015666 (GSK3235025)更为敏感[2]
4. EPZ015666 (GSK3235025)已进入MTAP缺陷型或PRMT5依赖型癌症的临床前开发阶段，其良好的口服生物利用度和耐受性支持进一步的临床评估[1,2]

C20H25N5O3

383.44

383.195

C, 62.65; H, 6.57; N, 18.26; O, 12.52

1616391-65-1

90241673

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

686.4±55.0 °C at 760 mmHg

368.9±31.5 °C

0.0±2.2 mmHg at 25°C

1.652

2.14

99.61

3

7

7

28

518

1

O1C([H])([H])C([H])(C1([H])[H])N([H])C1C([H])=C(C(N([H])C([H])([H])[C@@]([H])(C([H])([H])N2C([H])([H])C3=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C3C([H])([H])C2([H])[H])O[H])=O)N=C([H])N=1

ZKXZLIFRWWKZRY-KRWDZBQOSA-N

InChI=1S/C20H25N5O3/c26-17(10-25-6-5-14-3-1-2-4-15(14)9-25)8-21-20(27)18-7-19(23-13-22-18)24-16-11-28-12-16/h1-4,7,13,16-17,26H,5-6,8-12H2,(H,21,27)(H,22,23,24)/t17-/m0/s1

(S)-N-(3-(3,4-dihydroisoquinolin-2(1H)-yl)-2-hydroxypropyl)-6-(oxetan-3-ylamino)pyrimidine-4-carboxamide

GSK-3235025; GSK 3235025; GSK3235025; EPZ-015666; EPZ 015666; EPZ015666.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.52 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.52 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.52 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 2% DMSO+30% PEG 300+ddH2O:5mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。