EPZ015866 (GSK591; GSK3203591)

PRMT5 (protein methyltransferase 5; IC50 = 4 nM)

GSK591（5 μM；MCF7、T47D 和 MCF10A 细胞）处理可抑制乳腺癌干细胞 (BCSC) 的增殖和自我更新。在体外，GSK591 降低 BCSC 的数量[2]。

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药物抑制PRMT5可减少体外BCSC数量[2]
因为我们证明了驱动BCSC功能和FOXP1表达需要PRMT5的催化活性（图1G和6C），我们想确定靶向PRMT5的小分子抑制剂是否会影响BCSC功能。因此，我们用经过验证的PRMT5抑制剂GSK3203591 (EPZ015866；以下简称GSK591)(图7A；Duncan et al., 2015)。与PRMT5缺失类似，抑制PRMT5显著抑制mcf7衍生的BCSC增殖和自我更新以及ALDEFLUOR+ T47D细胞的数量（图7B和S7I），而过表达FOXP1能够挽救GSK591诱导的BCSC增殖缺陷（图7C）。因此，我们的数据表明，靶向PRMT5的药物降低了BCSCs的活性，但考虑到FOXP1和GSK591的缺失在减少原发性和继发性乳腺微球中不是显性的（图7B）， FOXP1对BCSCs中所有PRMT5依赖性事件都是重要的，但不是充分的。
据报道，PRMT5是正常干细胞功能的关键组成部分（Chittka et al., 2012, Liu et al., 2015），因此，PRMT5定向治疗乳腺癌的一个潜在限制是抑制正常的乳腺干细胞功能。有趣的是，尽管PRMT5的敲除和抑制减少了MCF10A细胞的原代乳房微球数量，但自我更新不受影响（图7B、S7I和S7J）。作为支持，通过ALDEFLUOR染色测定的干细胞数量不受GSK591的影响（图S7I）。此外，PRMT5缺失或抑制对MCF10A自我更新的影响不足并不是因为受体状态，因为GSK591表型与MCF7细胞相同的三阴性乳腺癌细胞SUM159治疗，减少了BCSC的增殖和自我更新（图7B）。因此，PRMT5活性似乎特异性地影响癌症的自我更新，而不是正常的乳腺干细胞。

EPZ015666 (an analog of EPZ015866) 或媒介物（0.5% 甲基纤维素水溶液）以 10 mL/kg 剂量口服 BID，持续 21 天（Granta-519 给药 18 天）。 EPZ015666 (GSK3235025, an analog of EPZ015866) 口服时具有生物利用度，适合体内研究。我们对患有严重联合免疫缺陷 (SCID) 的小鼠进行了为期 21 天的疗效研究，这些小鼠皮下注射了 Z-138 和 Maver-1 异种移植物。小鼠每天两次（BID）口服剂量，剂量为四种不同的剂量水平：25、50、100 和 200 mg/kg。动物在连续21天接受剂量后进入睡眠状态，并检查血液和组织样本以确定肿瘤生长抑制（TGI）和甲基标记药效学之间的联系。在两种 MCL 模型中，EPZ015666 (GSK3235025) 在 21 天后表现出剂量依赖性暴露和 TGI。当与媒介物处理的肿瘤进行权衡时，所有 EPZ015666 (GSK3235025) 剂量组的肿瘤在第 21 天表现出重量、体积和肿瘤生长的统计学显着差异。200 mg/kg BID 剂量导致 Z-138 细胞中的肿瘤停滞，这21 天后显示 >93% TGI，而 Maver-1 细胞仅显示 >70% TGI。此外，Granta-519 细胞系是一种快速扩增的模型，在第 18 天达到终点，并在 200 mg/kg 组中使用 45% TGI 表现出剂量依赖性功效，用于测试第三个 MCL 异种移植物。由于 200 mg/kg 剂量组的体重损失很小，并且没有额外的临床观察，EPZ015666 (GSK3235025) 在所有三种模型中均具有良好的耐受性 [Nat Chem Biol. 2015 Jun;11(6):432-7.]。

PRMT生化分析[3]
所有测定均在96孔板中用化合物或DMSO预缓冲（49x，2%最终）进行。PRMT1、PRMT3、PRMT6和PRMT8的测定使用H4 1-21肽和由50mM Tris（pH 8）、0.002%Tween-20、0.5mM EDTA和1mM DTT组成的缓冲液。简言之，Flag-his-tev-PRMT8（61-394）在杆状病毒表达系统中表达，并使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析和Superdex 200凝胶过滤层析纯化。对于所有测定，列出的最终腺苷-L-蛋氨酸（SAM）浓度包含未标记的SAM和3H-SAM的混合物。所有反应在加入SAH（最终0.5mM）后终止。
对于竞争研究，将底物加入到复合板中，然后加入酶。对于SAM竞争研究，最终测定浓度由2 nM PRMT1、40 nM肽和滴定SAM（50-8000 nM）组成。对于肽竞争研究，最终测定浓度由2 nM PRMT1、1000 nM和滴定肽（1.6-1000 nM）组成。在骤冷之前，将反应物在室温下孵育18分钟。
对于时间依赖性研究，将酶/SAM混合物添加到化合物板中，并在添加肽之前孵育3-60分钟。对于无预培养测定，将肽加入到化合物板中，然后加入酶/SAM混合物以引发反应。最终PRMT1测定浓度为0.5 nM PRMT1、40 nM肽和1100 nM SAM。反应在室温下孵育20分钟，然后淬灭。

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甲基转移酶生化测定[3]
总之，将甲基转移酶加入底物溶液中并轻轻混合。底物根据测试的甲基转移酶而变化，并且是核小体、核心组蛋白、组蛋白H3、组蛋白H4或H3 1-21肽。加入化合物（最终10μM）并在室温下孵育10分钟。加入3H-SAM（1μM）后开始反应，并在30°C下孵育1小时。将反应混合物输送到P81滤纸中，并用PBS洗涤以通过HotSpot专有技术进行检测。

细胞增殖测定[2]
细胞类型： MCF7、T47D 和 MCF10A 细胞
测试浓度： 5 μM
孵育时间：
实验结果： 抑制 BCSC 增殖和自我更新。

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乳球测定法[2]
将MCF7、T47D和MCF10A细胞接种到pHEMA涂布的六孔板上，并在37°C下培养5天。使用网格对大于50μm的Mammspheres进行评分。对于连续复制，在评分之前，分解并再培养5天的乳细胞。对于药物治疗，将细胞与5μM GSK591或2.5μM 4-OHT或载体对照一起孵育。有关更多详细信息，请参阅补充实验程序。

Dissolved in 0.5% methylcellulose in water; 10 and 100 mg/kg; oral
Male CD-1 Mouse

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Xenograft Studies and In Vivo Imaging[2]
Animal experiments were conducted in accordance with United Kingdom Home Office regulations. For the limiting dilution assay, 5- to 7-week-old female NSG mice were injected with the appropriate number of cells and a slow release estrogen pellet was subcutaneously implanted at the base of the tail. Two hours prior to harvest at the experimental endpoint, mice were injected with 100 mg/kg BrdU. For in vivo depletion of PRMT5, female NSG mice were injected with 5 × 106 cells and once tumors were palpable, maintained on a diet of dox chow. For imaging, mice were injected intraperitoneally (i.p.) with 150 mg/kg of luciferin, and images were captured on an IVIS Spectrum. See Supplemental Experimental Procedures for more detail.

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From these combined data, EPZ015666 emerged as the compound with the best combination of low plasma clearance and high oral bioavailability maintaining potent antiproliferative activity against a known mantle cell lymphoma cell line (Z-138 cells). Plasma protein binding in mouse plasma was determined to be approximately 30%. Further PK studies revealed that at 100 mg/kg in mouse, the unbound plasma concentration was equivalent to or above, the methyl mark IC90 for a period of 12 h, thus suggesting that BID dosing of EPZ015666 could effectively inhibit PRMT5 in vivo (Figure ​Figure44). Additional species PK and ADME characterization data on EPZ015666 were reported by Rioux et al.[1]

[1]. Kenneth W. Duncan et al. Structure and Property Guided Design in the Identification of PRMT5 Tool Compound EPZ015666. ACS Med. Chem. Lett., 2016, 7 (2), pp 162-166.
[2]. Chiang K, et al. PRMT5 Is a Critical Regulator of Breast Cancer Stem Cell Function via Histone Methylation and FOXP1 Expression. Cell Rep. 2017 Dec 19;21(12):3498-3513.
[3]. Fedoriw A, et al. Anti-tumor Activity of the Type I PRMT Inhibitor, GSK3368715, Synergizes with PRMT5 Inhibition through MTAP Loss. Cancer Cell. 2019 Jul 8;36(1):100-114.e25.

GSK591 (EPZ015866) is a potent and selective inhibitor of protein methyltransferase 5 (PRMT5).

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The recent publication of a potent and selective inhibitor of protein methyltransferase 5 (PRMT5) provides the scientific community with in vivo-active tool compound EPZ015666 (GSK3235025) to probe the underlying pharmacology of this key enzyme. Herein, we report the design and optimization strategies employed on an initial hit compound with poor in vitro clearance to yield in vivo tool compound EPZ015666 and an additional potent in vitro tool molecule EPZ015866 (GSK3203591).[1]

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Breast cancer progression, treatment resistance, and relapse are thought to originate from a small population of tumor cells, breast cancer stem cells (BCSCs). Identification of factors critical for BCSC function is therefore vital for the development of therapies. Here, we identify the arginine methyltransferase PRMT5 as a key in vitro and in vivo regulator of BCSC proliferation and self-renewal and establish FOXP1, a winged helix/forkhead transcription factor, as a critical effector of PRMT5-induced BCSC function. Mechanistically, PRMT5 recruitment to the FOXP1 promoter facilitates H3R2me2s, SET1 recruitment, H3K4me3, and gene expression. Our findings are clinically significant, as PRMT5 depletion within established tumor xenografts or treatment of patient-derived BCSCs with a pre-clinical PRMT5 inhibitor substantially reduces BCSC numbers. Together, our findings highlight the importance of PRMT5 in BCSC maintenance and suggest that small-molecule inhibitors of PRMT5 or downstream targets could be an effective strategy eliminating this cancer-causing population.[2]

C22H28N4O2

380.48

380.221

C, 69.45; H, 7.42; N, 14.73; O, 8.41

1616391-87-7

117072552

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

648.4±55.0 °C at 760 mmHg

345.9±31.5 °C

0.0±2.0 mmHg at 25°C

1.645

3.66

77.5Ų

3

5

7

28

513

1

O[C@@H](CNC(C1C=CN=C(C=1)NC1CCC1)=O)CN1CC2=CC=CC=C2CC1

TWKYXZSXXXKKJU-FQEVSTJZSA-N

InChI=1S/C22H28N4O2/c27-20(15-26-11-9-16-4-1-2-5-18(16)14-26)13-24-22(28)17-8-10-23-21(12-17)25-19-6-3-7-19/h1-2,4-5,8,10,12,19-20,27H,3,6-7,9,11,13-15H2,(H,23,25)(H,24,28)/t20-/m0/s1

(S)-2-(cyclobutylamino)-N-(3-(3,4-dihydroisoquinolin-2(1H)-yl)-2-hydroxypropyl)isonicotinamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.25 mg/mL (5.91 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 22.5 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.25 mg/mL (5.91 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 22.5 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.25 mg/mL (5.91 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 22.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。