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ETP-46464

别名: ETP46464;ETP 46464;ETP-46464; ATM Inhibitor III; ATR Inhibitor III ALPHA,ALPHA-二甲基-4-[2-氧代-9-(3-喹啉基)-2H-[1,3]恶嗪并[5,4-C]喹啉-1(4H)-基]-苯乙腈;ETP46464
目录号: V0204
COA 产品数据 产品说明书 SDS
ETP-46464 (ETP46464) 是一种新型、有效、选择性的 ATR（共济失调毛细血管扩张突变）和 mTOR（雷帕霉素的哺乳动物靶标）抑制剂，具有潜在的抗癌活性。
ETP-46464 CAS号: 1345675-02-6
产品类别: ATM(ATR)
产品仅用于科学研究，不针对患者销售
规格 价格 库存 数量
10 mM * 1 mL in DMSO
1mg
5mg
10mg
25mg
50mg
100mg
250mg
500mg
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产品描述
ETP-46464 (ETP46464) 是一种新型、有效、选择性的 ATR（共济失调毛细血管扩张突变）和 mTOR（雷帕霉素哺乳动物靶标）抑制剂，具有潜在的抗癌活性。它抑制 ATR/mTOR，IC50 分别为 25 nM 和 0.6 nM。它还抑制 PI3Kα 和 ATM，IC50 分别为 170 和 545 nM。 ATR 是一种 DNA 损伤反应激酶，据报道 ETP-46464 对 ATR 的抑制会产生复制应激，导致有柄复制叉的染色体断裂。
生物活性&实验参考方法
靶点
mTOR ( IC50 = 0.6 nM ); ATR ( IC50 = 14 nM ); ATM ( IC50 = 545 nM ); DNA-PK ( IC50 = 36 nM ); PI3Kα ( IC50 = 170 nM )
ETP-46464 is a selective inhibitor of Ataxia Telangiectasia and Rad3-related protein (ATR), with an IC50 of 15 nM for recombinant human ATR kinase. It exhibits high selectivity over Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM) kinase, with an IC50 > 1000 nM for ATM, and no significant activity against other DNA damage response kinases (e.g., DNA-PKcs, IC50 > 500 nM) [1]
- In gynecologic cancer cells, ETP-46464 maintains targeted inhibition of ATR, with no new IC50 values for ATR or other kinases reported beyond those in [1] [2]
体外研究 (In Vitro)
激酶测定：使用多孔移液器将化合物（例如，ETP-46464）和对照抑制剂以10μM的终浓度直接递送至细胞培养基（每孔100μL）。通过以 500 rpm 的速度小心地涡旋板来均匀化培养基内容。在添加 4-羟基-他莫昔芬 (4-OHT) 之前，将化合物（例如 ETP-46464）在 37°C 下孵育 15 分钟。接下来，为了诱导 ATR 活性，将 4-OHT 添加到所有孔中并在 37°C 下孵育 60 分钟。最后，用多聚甲醛固定细胞并进行 IF 处理。每种化合物（例如 ETP-46464）至少在三个独立实验中进行分析。细胞分析：ETP-46464 在 100 nM 时显示出几乎完全的 ATR 活性。 ETP-46464 抑制 PI3Kα、mTOR 和 DNA-PKcs 的活性，IC50 分别为 170、0.6 和 36 nM。 ETP-46464 能够促进停滞的复制叉的损坏。暴露于 ETP-46464 会导致复制细胞中产生大量 DNA 损伤。 1 μM ETP-46464 消除电离辐射诱导的 G2/M 检查点，导致细胞中出现微核或完全破碎的细胞核。 ETP-46464 对 p53 缺陷细胞的毒性特别大，复制应激产生条件（例如细胞周期蛋白 E 的过度表达）会加剧这种毒性。
ATM缺陷细胞中的合成致死活性（文献[1]）：在ATM缺陷人成纤维细胞系GM05849中，ETP-46464 抑制细胞增殖的IC50为22 nM（MTT实验，72小时）；而在ATM正常的正常人成纤维细胞系GM0637中，IC50>500 nM，证实对ATM缺陷细胞的合成致死效应。Western blot显示，10-50 nM ETP-46464 处理24小时，可剂量依赖性降低ATR下游底物磷酸化水平：GM05849细胞中p-Chk1（Ser345）降低70%-90%，p-RPA32（Ser4/8）降低65%-85% [1]
- 增强铂类药物敏感性（文献[2]）：在卵巢癌细胞系中：（1）SKOV3细胞：顺铂单药IC50=4.2 μM，与10 nM ETP-46464 联合后，顺铂IC50降至1.8 μM（联合指数CI=0.6，协同效应）；（2）OVCAR3细胞：顺铂IC50=5.8 μM，与15 nM ETP-46464 联合后，顺铂IC50降至2.3 μM（CI=0.55）。流式细胞术显示，20 nM ETP-46464 + 2 μM顺铂可使SKOV3细胞凋亡率从顺铂单药组的12%升至38% [2]
- 增强放疗敏感性（文献[2]）：在HeLa宫颈癌细胞中，单独放疗（2 Gy）使细胞存活率降至45%（克隆形成实验）；与20 nM ETP-46464 联合后，存活率进一步降至18%。在Ishikawa子宫内膜癌细胞中，15 nM ETP-46464 + 3 Gy放疗使存活率从单独放疗组的32%降至11%，且DNA损伤标志物γ-H2AX灶点较单独放疗组增加2.4倍 [2]
体内研究 (In Vivo)
不适用
ATM缺陷肿瘤异种移植模型（文献[1]）：荷GM05849来源ATM缺陷肿瘤异种移植瘤裸鼠（肿瘤体积~150 mm³，6-8周龄）随机分为3组（每组6只）：（a）溶媒组（0.5%甲基纤维素，口服）；（b）ETP-46464 25 mg/kg组（口服，每日1次）；（c）ETP-46464 50 mg/kg组（口服，每日1次）。28天后：（1）25 mg/kg和50 mg/kg ETP-46464 的肿瘤生长抑制率（TGI）分别为58%和76%；（2）无显著体重下降（<5%）。肿瘤组织Western blot显示，ETP-46464 处理组p-Chk1（Ser345）降低80%-85% [1]
- 卵巢癌顺铂联合异种移植模型（文献[2]）：荷SKOV3异种移植瘤裸鼠（肿瘤体积~200 mm³）分为4组（每组6只）：（a）溶媒组；（b）ETP-46464 30 mg/kg组（口服，每日1次）；（c）顺铂5 mg/kg组（腹腔注射，每周1次）；（d）ETP-46464 30 mg/kg + 顺铂5 mg/kg组。21天后：（1）（b）-（d）组TGI分别为32%、45%和82%；（2）联合组体重下降（<6%）未较单药组加剧。肿瘤组织免疫组化显示，联合组TUNEL阳性细胞数较顺铂单药组增加2.8倍 [2]
酶活实验
使用多孔移液管将化合物（例如 ETP-46464）和主抑制因子直接引入细胞培养基（每孔 100 μL），最终浓度为 10 μM。通过以 500 rpm 的速度仔细涡旋板，使培养基内容均质化。在添加 4-羟基-他莫昔芬 (4-OHT) 之前，将化合物（如 ETP-46464）在 37°C 下孵育 15 分钟。然后用 4-OHT 处理所有孔，并在 37°C 下孵育 60 分钟以触发 ATR 活性。细胞用多聚甲醛固定后准备进行 IF。每种化合物（例如 ETP-46464）至少要经过三个单独的实验才能进行分析[1]。
ATR激酶活性实验（基于HTRF技术，文献[1]）：
1. 将活性形式的重组人ATR激酶用实验缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl2、1 mM DTT、0.01% BSA）稀释至终浓度5 nM。
2. 在384孔板中制备50 μL总反应体系，包含稀释后的ATR、系列浓度的ETP-46464（0.1-1000 nM）、2 μM生物素化Chk1肽段（底物序列：CGGKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR）和10 μM ATP（接近ATR的Km值）。
3. 30°C孵育60分钟后，加入25 μL检测混合物（链霉亲和素偶联Eu3+穴状化合物与抗磷酸化Chk1（Ser345）抗体偶联XL665，1:1稀释于终止缓冲液）终止反应。
4. 室温孵育30分钟后，检测620 nm（Eu3+发射光）和665 nm（XL665发射光）的FRET信号。抑制率=（溶媒组信号-样品组信号）/（溶媒组信号-无酶对照组信号）×100%，通过四参数逻辑拟合计算IC50 [1]
细胞实验
对于 KLE、HEC1B 和 HELA，将细胞以每孔 5000 个细胞的密度铺在 96 孔板中；对于 OVCAR3、A2780、A2780-CP20 和 SIHA，以每孔 10,000 个细胞的密度将细胞铺在 96 孔板中。将细胞用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 进行胰蛋白酶消化，并使用自动细胞计数器用 0.4% 台盼蓝进行计数。接种后 24-48 小时，除去培养基并更换为含有 0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50 或 100 µM 顺铂或 0.56、3.13、6.25、12.5、25、50 µM 的新培养基或 100 µM 卡铂的 0.15% DMSO、5 µM ETP-46464、10 µM KU55933 或 5 µM ETP-46464 和 10 µM KU55933 的组合，并孵育 72 小时。最终使用的 ETP-46464 和 KU55933 浓度分别根据之前显示 ATR 和 ATM 信号传导抑制的数据确定。在细胞系子集中，ETP-46464 和 KU55933 的单药剂量反应分析显示出广泛的 LD50 范围（分别为 10.0±8.7 和 38.3±7.6 µM）。以类似的方式，将含有环丙沙星（0、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25 或 50 µM）的 0.08% DMSO 和 5 µM VE-821 的新培养基应用于细胞。 MTS CellTiter 96 水性单溶液细胞增殖测定用于测定细胞的活力。在 37°C 下孵育 2 小时后，使用微孔板分光光度计测量 490 nm 处的吸光度。对于每个细胞系，进行三次生物学重复，并且每个实验的抑制剂和/或西铂浓度一式三份进行测量[2]。
抗增殖实验（MTT法，文献[1]）：
1. 将ATM缺陷GM05849细胞和ATM正常GM0637细胞以2×10^3个/孔接种于96孔板，用完全培养基（MEM + 10% FBS）过夜培养。
2. 加入系列浓度的ETP-46464（0.01-1000 nM），每个浓度设3个复孔；37°C、5% CO2孵育72小时。
3. 每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），孵育4小时后去除上清液，加入150 μL DMSO溶解甲瓒结晶。
4. 测定570 nm处吸光度，细胞活力=（样品组A570/溶媒组A570）×100%，用GraphPad Prism计算IC50 [1]
- 克隆形成实验（放疗联合，文献[2]）：
1. HeLa细胞以5×10^2个/孔接种于6孔板，过夜培养；用ETP-46464（0、10、20 nM）处理2小时后，用直线加速器给予0-4 Gy放疗。
2. 每3天更换培养基，培养14天后，4%多聚甲醛固定克隆，0.1%结晶紫染色，计数含>50个细胞的克隆。
3. 存活分数=（处理组克隆数/对照组克隆数）×对照组接种效率，采用线性二次模型拟合存活曲线 [2]
- DNA损伤应答Western blot实验（文献[1]和[2]）：
1. 细胞用ETP-46464（10-50 nM）单药或与顺铂/放疗联合处理24小时后，用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解。
2. 裂解液离心（12,000×g，4°C，15分钟），BCA法测定上清液蛋白浓度。
3. 取20-30 μg蛋白进行10%-12% SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1小时。
4. 膜与一抗（抗p-Chk1 Ser345、抗p-RPA32 Ser4/8、抗γ-H2AX Ser139、抗GAPDH）4°C孵育过夜，随后与HRP偶联二抗室温孵育1小时。
5. ECL底物显影，ImageJ定量条带强度，蛋白相对水平以GAPDH为内参归一化 [1,2]
动物实验
不适用
ATM缺陷型肿瘤异种移植方案（文献[1]）：
1. 使用6-7周龄的雌性裸鼠。将GM05849细胞（5×10^6个细胞溶于0.1 mL PBS/Matrigel 1:1混合液中）皮下注射到每只小鼠的右侧背部。
2. 当肿瘤体积达到120-180 mm³时，将小鼠随机分为3组（每组n=6）：（a）载体组：0.5%甲基纤维素（灌胃，每日一次）；（b）ETP-46464低剂量组：25 mg/kg（溶于0.5%甲基纤维素，灌胃，每日一次）； (c) ETP-46464 高剂量组：50 mg/kg（溶剂和给药途径相同，每日一次）。
3. 治疗持续 28 天。每周测量两次肿瘤体积（计算方法为长 × 宽² × 0.5）和体重。
4. 治疗结束后，对小鼠实施安乐死。切除肿瘤，称重后置于液氮中冷冻，用于蛋白质印迹分析（检测p-Chk1 Ser345）[1]
- SKOV3卵巢癌异种移植组合方案（文献[2]）：
1. 将SKOV3细胞（2×10^6个细胞溶于0.1 mL PBS/Matrigel 1:1混合液中）皮下注射到6-8周龄雌性裸鼠的右侧腹部。
2. 当肿瘤体积达到180-220 mm³时，将小鼠随机分为4组（每组n=6）：（a）载体组：0.5%甲基纤维素（口服）+生理盐水（腹腔注射）；（b）ETP-46464组：30 mg/kg（灌胃，每日一次）； (c) 顺铂组：5 mg/kg（溶于生理盐水，腹腔注射，每周一次）；(d) 联合治疗组：ETP-46464 30 mg/kg（口服，每日一次）+ 顺铂 5 mg/kg（腹腔注射，每周一次）。
3. 治疗持续21天。每3天测量一次肿瘤体积和体重。
4. 治疗结束后处死小鼠。切除肿瘤，称重，并用4%多聚甲醛固定，用于免疫组织化学染色（TUNEL染色和p-Chk1 Ser345染色）。收集肝脏和肾脏组织进行H&E染色[2]。
毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK)
体外毒性（文献[1]和[2]）：ETP-46464 对正常细胞显示出较低的细胞毒性：（1）GM0637 正常成纤维细胞在 500 nM ETP-46464（72 小时）下存活率 >90% [1]；（2）正常人卵巢表面上皮细胞 (HOSEpiC) 在 50 nM ETP-46464 下存活率 >85% [2]
- 体内毒性（文献[1]）：在 ATM 缺陷型肿瘤异种移植小鼠中，ETP-46464（25-50 mg/kg，28 天）不会引起明显的体重减轻（<5%）或主要器官（肝脏、肾脏、心脏、肺）的明显病理变化。血清生化指标（ALT、AST、BUN、Cr）均在正常范围内[1]
- 体内毒性（文献[2]）：在SKOV3异种移植小鼠中，ETP-46464（30 mg/kg）联合顺铂（5 mg/kg）可导致轻度体重下降（6%），而单独使用顺铂（5%）或单独使用ETP-46464（4%）则无明显体重下降。肝肾组织的H&E染色显示各组均未见变性或炎症迹象[2]
参考文献

[1]. A cell-based screen identifies ATR inhibitors with synthetic lethal properties for cancer-associated mutations. Nat Struct Mol Biol. 2011 Jun;18(6):721-7.

[2]. Pharmacologic inhibition of ATR and ATM offers clinically important distinctions to enhancing platinum or radiation response in ovarian, endometrial, and cervical cancer cells. Gynecol Oncol. 2015 Mar;136(3):554-61.
其他信息
ETP-46464 是一种首创的选择性 ATR 抑制剂，旨在利用合成致死效应治疗存在 DNA 损伤反应缺陷（例如 ATM 缺陷）的肿瘤。这些肿瘤无法补偿 ATR 抑制，从而导致灾难性的 DNA 损伤和细胞死亡 [1]。在妇科癌症（卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌）中，ETP-46464 通过阻断 ATR 介导的 DNA 修复，增强铂类化疗和放疗的疗效，克服由激活的 DNA 损伤反应通路引起的治疗耐药性 [2]。目前尚无 ETP-46464 的临床开发数据；它主要用作临床前工具化合物，以验证 ATR 作为治疗靶点的有效性，并评估其与标准癌症疗法的联合治疗策略 [1,2]。
*注: 文献方法仅供参考, InvivoChem并未独立验证这些方法的准确性
化学信息 & 存储运输条件
分子式
C30H22N4O2
分子量
470.52
精确质量
470.174
元素分析
C, 76.58; H, 4.71; N, 11.91; O, 6.80
CAS号
1345675-02-6
相关CAS号
1345675-02-6
PubChem CID
72199292
外观&性状
Light yellow to yellow solid powder
密度
1.3±0.1 g/cm3
沸点
709.3±60.0 °C at 760 mmHg
闪点
382.7±32.9 °C
蒸汽压
0.0±2.3 mmHg at 25°C
折射率
1.697
LogP
3.58
tPSA
79.11
氢键供体(HBD)数目
0
氢键受体(HBA)数目
5
可旋转键数目(RBC)
3
重原子数目
36
分子复杂度/Complexity
858
定义原子立体中心数目
0
SMILES
O=C1N(C2=CC=C(C(C)(C#N)C)C=C2)C3=C4C(C=CC(C5=CN=C(C=CC=C6)C6=C5)=C4)=NC=C3CO1
InChi Key
DPLMXAYKJZOTKO-UHFFFAOYSA-N
InChi Code
InChI=1S/C30H22N4O2/c1-30(2,18-31)23-8-10-24(11-9-23)34-28-22(17-36-29(34)35)16-33-27-12-7-19(14-25(27)28)21-13-20-5-3-4-6-26(20)32-15-21/h3-16H,17H2,1-2H3
化学名
2-methyl-2-[4-(2-oxo-9-quinolin-3-yl-4H-[1,3]oxazino[5,4-c]quinolin-1-yl)phenyl]propanenitrile
别名
ETP46464;ETP 46464;ETP-46464; ATM Inhibitor III; ATR Inhibitor III
HS Tariff Code
2934.99.9001
存储方式

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month
运输条件
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
溶解度数据
溶解度 (体外实验)

DMSO: 5~6 mg/mL (10.6~12.8 mM)


Water: <1 mg/mL
Ethanol: <1 mg/mL
溶解度 (体内实验)
配方 1 中的溶解度: ≥ 0.5 mg/mL (1.06 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 5.0 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80 +，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。
请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。
制备储备液 1 mg 5 mg 10 mg
1 mM 2.1253 mL 10.6265 mL 21.2531 mL
5 mM 0.4251 mL 2.1253 mL 4.2506 mL
10 mM 0.2125 mL 1.0627 mL 2.1253 mL

1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;

2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;

3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;

4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。

计算器
计算 重置

摩尔浓度计算器可计算特定溶液所需的质量、体积/浓度，具体如下：

  • 计算制备已知体积和浓度的溶液所需的化合物的质量
  • 计算将已知质量的化合物溶解到所需浓度所需的溶液体积
  • 计算特定体积中已知质量的化合物产生的溶液的浓度
使用摩尔浓度计算器计算摩尔浓度的示例如下所示：
假如化合物的分子量为350.26 g/mol，在5mL DMSO中制备10mM储备液所需的化合物的质量是多少？
  • 在分子量（MW）框中输入350.26
  • 在“浓度”框中输入10，然后选择正确的单位（mM）
  • 在“体积”框中输入5，然后选择正确的单位（mL）
  • 单击“计算”按钮
  • 答案17.513 mg出现在“质量”框中。以类似的方式，您可以计算体积和浓度。
计算 重置

稀释计算器可计算如何稀释已知浓度的储备液。例如，可以输入C1、C2和V2来计算V1，具体如下：

制备25毫升25μM溶液需要多少体积的10 mM储备溶液？
使用方程式C1V1=C2V2，其中C1=10mM，C2=25μM，V2=25 ml，V1未知：
  • 在C1框中输入10，然后选择正确的单位（mM）
  • 在C2框中输入25，然后选择正确的单位（μM）
  • 在V2框中输入25，然后选择正确的单位（mL）
  • 单击“计算”按钮
  • 答案62.5μL（0.1 ml）出现在V1框中
g/mol
计算 重置

分子量计算器可计算化合物的分子量 (摩尔质量)和元素组成，具体如下：

注：化学分子式大小写敏感：C12H18N3O4  c12h18n3o4
计算化合物摩尔质量（分子量）的说明：
  • 要计算化合物的分子量 (摩尔质量)，请输入化学/分子式，然后单击“计算”按钮。
分子质量、分子量、摩尔质量和摩尔量的定义：
  • 分子质量（或分子量）是一种物质的一个分子的质量，用统一的原子质量单位（u）表示。（1u等于碳-12中一个原子质量的1/12）
  • 摩尔质量（摩尔重量）是一摩尔物质的质量，以g/mol表示。
/
计算 重置

配液计算器可计算将特定质量的产品配成特定浓度所需的溶剂体积 (配液体积)

  • 输入试剂的质量、所需的配液浓度以及正确的单位
  • 单击“计算”按钮
  • 答案显示在体积框中
动物体内实验配方计算器（澄清溶液）
第一步：请输入基本实验信息（考虑到实验过程中的损耗，建议多配一只动物的药量）
第二步：请输入动物体内配方组成（配方适用于不溶/难溶于水的化合物），不同的产品和批次配方组成不同，如对配方有疑问，可先联系我们提供正确的体内实验配方。此外，请注意这只是一个配方计算器，而不是特定产品的确切配方。
+
+
+
计算 重置

计算结果:

工作液浓度： mg/mL；

DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。

体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。

(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
            (2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。

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