ETP-46464

mTOR ( IC50 = 0.6 nM ); ATR ( IC50 = 14 nM ); ATM ( IC50 = 545 nM ); DNA-PK ( IC50 = 36 nM ); PI3Kα ( IC50 = 170 nM )
ETP-46464 is a selective inhibitor of Ataxia Telangiectasia and Rad3-related protein (ATR), with an IC50 of 15 nM for recombinant human ATR kinase. It exhibits high selectivity over Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM) kinase, with an IC50 > 1000 nM for ATM, and no significant activity against other DNA damage response kinases (e.g., DNA-PKcs, IC50 > 500 nM) [1]
- In gynecologic cancer cells, ETP-46464 maintains targeted inhibition of ATR, with no new IC50 values for ATR or other kinases reported beyond those in [1] [2]

激酶测定：使用多孔移液器将化合物（例如，ETP-46464）和对照抑制剂以10μM的终浓度直接递送至细胞培养基（每孔100μL）。通过以 500 rpm 的速度小心地涡旋板来均匀化培养基内容。在添加 4-羟基-他莫昔芬 (4-OHT) 之前，将化合物（例如 ETP-46464）在 37°C 下孵育 15 分钟。接下来，为了诱导 ATR 活性，将 4-OHT 添加到所有孔中并在 37°C 下孵育 60 分钟。最后，用多聚甲醛固定细胞并进行 IF 处理。每种化合物（例如 ETP-46464）至少在三个独立实验中进行分析。细胞分析：ETP-46464 在 100 nM 时显示出几乎完全的 ATR 活性。 ETP-46464 抑制 PI3Kα、mTOR 和 DNA-PKcs 的活性，IC50 分别为 170、0.6 和 36 nM。 ETP-46464 能够促进停滞的复制叉的损坏。暴露于 ETP-46464 会导致复制细胞中产生大量 DNA 损伤。 1 μM ETP-46464 消除电离辐射诱导的 G2/M 检查点，导致细胞中出现微核或完全破碎的细胞核。 ETP-46464 对 p53 缺陷细胞的毒性特别大，复制应激产生条件（例如细胞周期蛋白 E 的过度表达）会加剧这种毒性。

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ATM缺陷细胞中的合成致死活性（文献[1]）：在ATM缺陷人成纤维细胞系GM05849中，ETP-46464 抑制细胞增殖的IC50为22 nM（MTT实验，72小时）；而在ATM正常的正常人成纤维细胞系GM0637中，IC50>500 nM，证实对ATM缺陷细胞的合成致死效应。Western blot显示，10-50 nM ETP-46464 处理24小时，可剂量依赖性降低ATR下游底物磷酸化水平：GM05849细胞中p-Chk1（Ser345）降低70%-90%，p-RPA32（Ser4/8）降低65%-85% [1]
- 增强铂类药物敏感性（文献[2]）：在卵巢癌细胞系中：（1）SKOV3细胞：顺铂单药IC50=4.2 μM，与10 nM ETP-46464 联合后，顺铂IC50降至1.8 μM（联合指数CI=0.6，协同效应）；（2）OVCAR3细胞：顺铂IC50=5.8 μM，与15 nM ETP-46464 联合后，顺铂IC50降至2.3 μM（CI=0.55）。流式细胞术显示，20 nM ETP-46464 + 2 μM顺铂可使SKOV3细胞凋亡率从顺铂单药组的12%升至38% [2]
- 增强放疗敏感性（文献[2]）：在HeLa宫颈癌细胞中，单独放疗（2 Gy）使细胞存活率降至45%（克隆形成实验）；与20 nM ETP-46464 联合后，存活率进一步降至18%。在Ishikawa子宫内膜癌细胞中，15 nM ETP-46464 + 3 Gy放疗使存活率从单独放疗组的32%降至11%，且DNA损伤标志物γ-H2AX灶点较单独放疗组增加2.4倍 [2]

不适用

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ATM缺陷肿瘤异种移植模型（文献[1]）：荷GM05849来源ATM缺陷肿瘤异种移植瘤裸鼠（肿瘤体积~150 mm³，6-8周龄）随机分为3组（每组6只）：（a）溶媒组（0.5%甲基纤维素，口服）；（b）ETP-46464 25 mg/kg组（口服，每日1次）；（c）ETP-46464 50 mg/kg组（口服，每日1次）。28天后：（1）25 mg/kg和50 mg/kg ETP-46464 的肿瘤生长抑制率（TGI）分别为58%和76%；（2）无显著体重下降（<5%）。肿瘤组织Western blot显示，ETP-46464 处理组p-Chk1（Ser345）降低80%-85% [1]
- 卵巢癌顺铂联合异种移植模型（文献[2]）：荷SKOV3异种移植瘤裸鼠（肿瘤体积~200 mm³）分为4组（每组6只）：（a）溶媒组；（b）ETP-46464 30 mg/kg组（口服，每日1次）；（c）顺铂5 mg/kg组（腹腔注射，每周1次）；（d）ETP-46464 30 mg/kg + 顺铂5 mg/kg组。21天后：（1）（b）-（d）组TGI分别为32%、45%和82%；（2）联合组体重下降（<6%）未较单药组加剧。肿瘤组织免疫组化显示，联合组TUNEL阳性细胞数较顺铂单药组增加2.8倍 [2]

使用多孔移液管将化合物（例如 ETP-46464）和主抑制因子直接引入细胞培养基（每孔 100 μL），最终浓度为 10 μM。通过以 500 rpm 的速度仔细涡旋板，使培养基内容均质化。在添加 4-羟基-他莫昔芬 (4-OHT) 之前，将化合物（如 ETP-46464）在 37°C 下孵育 15 分钟。然后用 4-OHT 处理所有孔，并在 37°C 下孵育 60 分钟以触发 ATR 活性。细胞用多聚甲醛固定后准备进行 IF。每种化合物（例如 ETP-46464）至少要经过三个单独的实验才能进行分析[1]。

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ATR激酶活性实验（基于HTRF技术，文献[1]）：
1. 将活性形式的重组人ATR激酶用实验缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl2、1 mM DTT、0.01% BSA）稀释至终浓度5 nM。
2. 在384孔板中制备50 μL总反应体系，包含稀释后的ATR、系列浓度的ETP-46464（0.1-1000 nM）、2 μM生物素化Chk1肽段（底物序列：CGGKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR）和10 μM ATP（接近ATR的Km值）。
3. 30°C孵育60分钟后，加入25 μL检测混合物（链霉亲和素偶联Eu3+穴状化合物与抗磷酸化Chk1（Ser345）抗体偶联XL665，1:1稀释于终止缓冲液）终止反应。
4. 室温孵育30分钟后，检测620 nm（Eu3+发射光）和665 nm（XL665发射光）的FRET信号。抑制率=（溶媒组信号-样品组信号）/（溶媒组信号-无酶对照组信号）×100%，通过四参数逻辑拟合计算IC50 [1]

对于 KLE、HEC1B 和 HELA，将细胞以每孔 5000 个细胞的密度铺在 96 孔板中；对于 OVCAR3、A2780、A2780-CP20 和 SIHA，以每孔 10,000 个细胞的密度将细胞铺在 96 孔板中。将细胞用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 进行胰蛋白酶消化，并使用自动细胞计数器用 0.4% 台盼蓝进行计数。接种后 24-48 小时，除去培养基并更换为含有 0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50 或 100 µM 顺铂或 0.56、3.13、6.25、12.5、25、50 µM 的新培养基或 100 µM 卡铂的 0.15% DMSO、5 µM ETP-46464、10 µM KU55933 或 5 µM ETP-46464 和 10 µM KU55933 的组合，并孵育 72 小时。最终使用的 ETP-46464 和 KU55933 浓度分别根据之前显示 ATR 和 ATM 信号传导抑制的数据确定。在细胞系子集中，ETP-46464 和 KU55933 的单药剂量反应分析显示出广泛的 LD50 范围（分别为 10.0±8.7 和 38.3±7.6 µM）。以类似的方式，将含有环丙沙星（0、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25 或 50 µM）的 0.08% DMSO 和 5 µM VE-821 的新培养基应用于细胞。 MTS CellTiter 96 水性单溶液细胞增殖测定用于测定细胞的活力。在 37°C 下孵育 2 小时后，使用微孔板分光光度计测量 490 nm 处的吸光度。对于每个细胞系，进行三次生物学重复，并且每个实验的抑制剂和/或西铂浓度一式三份进行测量[2]。

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抗增殖实验（MTT法，文献[1]）：
1. 将ATM缺陷GM05849细胞和ATM正常GM0637细胞以2×10^3个/孔接种于96孔板，用完全培养基（MEM + 10% FBS）过夜培养。
2. 加入系列浓度的ETP-46464（0.01-1000 nM），每个浓度设3个复孔；37°C、5% CO2孵育72小时。
3. 每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），孵育4小时后去除上清液，加入150 μL DMSO溶解甲瓒结晶。
4. 测定570 nm处吸光度，细胞活力=（样品组A570/溶媒组A570）×100%，用GraphPad Prism计算IC50 [1]
- 克隆形成实验（放疗联合，文献[2]）：
1. HeLa细胞以5×10^2个/孔接种于6孔板，过夜培养；用ETP-46464（0、10、20 nM）处理2小时后，用直线加速器给予0-4 Gy放疗。
2. 每3天更换培养基，培养14天后，4%多聚甲醛固定克隆，0.1%结晶紫染色，计数含>50个细胞的克隆。
3. 存活分数=（处理组克隆数/对照组克隆数）×对照组接种效率，采用线性二次模型拟合存活曲线 [2]
- DNA损伤应答Western blot实验（文献[1]和[2]）：
1. 细胞用ETP-46464（10-50 nM）单药或与顺铂/放疗联合处理24小时后，用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解。
2. 裂解液离心（12,000×g，4°C，15分钟），BCA法测定上清液蛋白浓度。
3. 取20-30 μg蛋白进行10%-12% SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1小时。
4. 膜与一抗（抗p-Chk1 Ser345、抗p-RPA32 Ser4/8、抗γ-H2AX Ser139、抗GAPDH）4°C孵育过夜，随后与HRP偶联二抗室温孵育1小时。
5. ECL底物显影，ImageJ定量条带强度，蛋白相对水平以GAPDH为内参归一化 [1,2]

N/A

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ATM-deficient tumor xenograft protocol (文献[1]):
1. Female nude mice (6-7 weeks old) are used. GM05849 cells (5×10^6 cells in 0.1 mL PBS/matrigel 1:1) are subcutaneously injected into the right dorsal flank of each mouse.
2. When tumors reach 120-180 mm³, mice are randomly divided into 3 groups (n=6/group): (a) Vehicle group: 0.5% methylcellulose (oral gavage, once daily); (b) ETP-46464 low-dose group: 25 mg/kg (dissolved in 0.5% methylcellulose, oral gavage, once daily); (c) ETP-46464 high-dose group: 50 mg/kg (same solvent and route, once daily).
3. Treatment lasts for 28 days. Tumor volume (calculated as length × width² × 0.5) and body weight are measured twice weekly.
4. At the end of treatment, mice are euthanized. Tumors are excised, weighed, and frozen in liquid nitrogen for Western blot analysis (detection of p-Chk1 Ser345) [1]
- SKOV3 ovarian cancer xenograft combination protocol (文献[2]):
1. Female nude mice (6-8 weeks old) are subcutaneously injected with SKOV3 cells (2×10^6 cells in 0.1 mL PBS/matrigel 1:1) into the right flank.
2. When tumors reach 180-220 mm³, mice are randomized into 4 groups (n=6/group): (a) Vehicle group: 0.5% methylcellulose (oral) + saline (intraperitoneal); (b) ETP-46464 group: 30 mg/kg (oral gavage, once daily); (c) Cisplatin group: 5 mg/kg (dissolved in saline, intraperitoneal injection, once weekly); (d) Combination group: ETP-46464 30 mg/kg (oral, daily) + cisplatin 5 mg/kg (intraperitoneal, weekly).
3. Treatment continues for 21 days. Tumor volume and body weight are measured every 3 days.
4. Mice are euthanized after treatment. Tumors are excised, weighed, and fixed in 4% paraformaldehyde for immunohistochemistry (TUNEL staining and p-Chk1 Ser345 staining). Liver and kidney tissues are collected for H&E staining [2]

In vitro toxicity (文献[1]和[2]): ETP-46464 shows low cytotoxicity to normal cells: (1) GM0637 normal fibroblasts have >90% viability at 500 nM ETP-46464 (72 hours) [1]; (2) Normal human ovarian surface epithelial cells (HOSEpiC) have >85% viability at 50 nM ETP-46464 [2]
- In vivo toxicity (文献[1]): In ATM-deficient tumor xenograft mice, ETP-46464 (25-50 mg/kg, 28 days) causes no significant body weight loss (<5%) or gross pathological changes in major organs (liver, kidney, heart, lung). Serum biochemical indices (ALT, AST, BUN, Cr) are within normal ranges [1]
- In vivo toxicity (文献[2]): In SKOV3 xenograft mice, combination of ETP-46464 (30 mg/kg) and cisplatin (5 mg/kg) causes mild weight loss (6%) vs. cisplatin alone (5%) or ETP-46464 alone (4%). H&E staining of liver and kidney tissues shows no evidence of degeneration or inflammation in any group [2]

[1]. A cell-based screen identifies ATR inhibitors with synthetic lethal properties for cancer-associated mutations. Nat Struct Mol Biol. 2011 Jun;18(6):721-7.

[2]. Pharmacologic inhibition of ATR and ATM offers clinically important distinctions to enhancing platinum or radiation response in ovarian, endometrial, and cervical cancer cells. Gynecol Oncol. 2015 Mar;136(3):554-61.

ETP-46464 is a first-in-class selective ATR inhibitor developed to exploit synthetic lethality in tumors with DNA damage response defects (e.g., ATM deficiency), which are unable to compensate for ATR inhibition, leading to catastrophic DNA damage and cell death [1]
- In gynecologic cancers (ovarian, endometrial, cervical), ETP-46464 enhances the efficacy of platinum-based chemotherapy and radiation by blocking ATR-mediated DNA repair, overcoming therapy resistance caused by activated DNA damage response pathways [2]
- ETP-46464 has no reported clinical development data; it is primarily used as a preclinical tool compound to validate ATR as a therapeutic target and evaluate combination strategies with standard cancer therapies [1,2]

C30H22N4O2

470.52

470.174

C, 76.58; H, 4.71; N, 11.91; O, 6.80

1345675-02-6

1345675-02-6

72199292

Light yellow to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

709.3±60.0 °C at 760 mmHg

382.7±32.9 °C

0.0±2.3 mmHg at 25°C

1.697

3.58

79.11

0

5

3

36

858

0

O=C1N(C2=CC=C(C(C)(C#N)C)C=C2)C3=C4C(C=CC(C5=CN=C(C=CC=C6)C6=C5)=C4)=NC=C3CO1

DPLMXAYKJZOTKO-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C30H22N4O2/c1-30(2,18-31)23-8-10-24(11-9-23)34-28-22(17-36-29(34)35)16-33-27-12-7-19(14-25(27)28)21-13-20-5-3-4-6-26(20)32-15-21/h3-16H,17H2,1-2H3

2-methyl-2-[4-(2-oxo-9-quinolin-3-yl-4H-[1,3]oxazino[5,4-c]quinolin-1-yl)phenyl]propanenitrile

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 0.5 mg/mL (1.06 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 5.0 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80 +，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。