Natural polyacetylenic oxylipin; PPARγ

Falcarindiol（3、6、12、24 μM）在 24 小时内显着降低 MDA-MB-231 和 MDA-MB-468 细胞的细胞活力。 MCF-10A 细胞的细胞活力一直维持到 Falcarindiol 剂量达到 24 μM，此时 Falcarindiol 优先诱导乳腺癌细胞死亡 [1]。在 MDA-MB-231、MDA-MB-468 和 SKBR3 细胞中，falcarindiol（6 μM；持续 2 小时）诱导自噬并导致 LC3-I 水平显着升高。 Falcarindiol（6 μM；持续 2、4、8 和 24 小时）剂量和时间补充可增加 MDA-MB-231 细胞中的 GRP78 水平 [1]。 Falcarindiol (1–20 μM) 对 HT-29 和 hMSC 细胞的活力没有影响。只有浓度大于 50 μM 的 falcarindiol 才会对细胞产生毒性影响 [2]。在 24 小时内，falcarindiol（5 μM；10 分钟、1 小时和 24 小时）显着增加 PPARγ2 表达 [2]。

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Falcarindiol (FAD)是一种天然的多聚物，存在于许多食品和膳食植物中。人们发现它具有多种有益的生物活性。在这项研究中，我们证实了它在乳腺癌细胞中的抗癌作用和机制。我们发现FAD优先诱导乳腺癌细胞死亡。fad诱导的细胞死亡是caspase依赖性的。然而，FAD诱导细胞自噬导致细胞死亡。通过化学抑制剂或基因敲除自噬信号成分阻断自噬可抑制fad诱导的细胞死亡。我们进一步发现fad诱导的细胞死亡是通过诱导内质网应激介导的。我们还发现FAD与已批准的抗癌药物5-FU和硼替佐米在杀死乳腺癌细胞方面具有协同作用。综上所述，这些数据表明FAD在乳腺癌细胞中具有很强的特异性抗肿瘤作用，并为自噬在FAD诱导的细胞死亡中的作用提供了一些见解。[1]

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Falcarindiol (FaDOH)是一种具有细胞毒性和抗炎作用的聚乙基氧脂素，存在于胡萝卜科食用植物中。FaDOH已被证明可以激活PPARγ并增加细胞中胆固醇转运体ABCA1的表达，这两者在脂质代谢中起重要作用。因此，FaDOH的抗癌和抗糖尿病特性的共同作用机制可能是由于对脂质代谢的可能影响。本研究采用白光显微镜和拉曼成像技术，研究了FaDOH亚毒性浓度（5 μM）对人间充质干细胞（hMSCs）的影响。我们的研究结果表明，FaDOH增加了hMSCs细胞中的脂质含量以及脂滴（ld）的数量，这可以通过人类结肠腺癌细胞中PPARγ2的表达增加来解释。激活PPARγ可导致ABCA1表达增加。我们证明，ABCA1在结直肠肿瘤大鼠组织中上调，这表明该转运体可能在脂质再分配和癌细胞中ld形成增加中起作用，从而导致内质网应激和癌细胞死亡。[2]

饲粮中添加<Falcarindiol/FaDOH和FaOH可增加大鼠肿瘤组织中ABCA1的表达[2]
先前的一项关于饮食Falcarindiol/FaDOH和FaOH在大鼠模型肿瘤组织中的作用的研究确实显示了PPARγ的下调，这与目前在HT-29细胞中的研究相反。下调是出乎意料的，但可能是由于组织样本的复杂性，因为组织样本中的肿瘤细胞可能受到微生物群和周围组织细胞的影响（Kobaek-Larsen等人，2019）。然而，PPARγ的激活可导致巨噬细胞中ABCA1基因转录增加（Chawla et al., 2001）， ABCA1在结肠癌细胞中具有抗癌活性（Smith and Land, 2012）。因此，我们在标准大鼠日粮（SRD）中分别添加7µg FaDOH g-1饲料和7µg FaOH g-1饲料，并与未添加SRD的大鼠进行比较，研究了FaDOH和FaOH对ABCA1基因调控的影响（图7）。RT-qPCR分析显示，与仅接受SRD的大鼠相比，接受FaOH和FaDOH作为食物补充剂的大鼠在健康组织中ABCA1的表达水平无显著差异。然而，当将接受SRD的大鼠的肿瘤组织活检组织与接受SRD的大鼠的肿瘤组织活检组织进行比较时，发现了显著的表达水平上调。

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当五周龄时引入 falcarindiol（7 μg/g；食物）时，肿瘤组织中 ABCA1 的表达上调 [2]。

活力测试[2]
细胞以5000个细胞/孔的浓度接种于96孔板中，接种于100µl培养基中。24 h后，将培养基替换为含有Falcarindiol/不同浓度FaDOH的新鲜培养基。72h后，使用10倍物镜的倒置显微镜（Motic AE31）观察细胞，然后拍照。然后根据制造商的说明，使用resazurin活力测定法评估井的活力。将Resazurin溶液与新鲜培养基按1:9比例混合，每孔加入100µl。孵育3小时后，将80µl转移到新的96孔板上，使用96孔板读取器读取600 nm和690 nm处的吸光度。从600 nm处的吸光度中减去690 nm处的背景吸光度，得到染料特定吸光度。有活力的细胞将染料转化为红色产物，100%的活力设定为未经处理的细胞和未反应的染料在没有细胞的井中孵育的吸光度差异。然后计算样品的活力百分比，作为与未处理细胞相比颜色变化的百分比。

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成像和显微镜用样品的制备[2]
硼硅玻璃盖（VWR）在98%乙醇中灭菌，在无菌条件下风干，放置于6孔板中。将50,000个细胞（hMSC Tert4, p44）接种于18mm方形或25mm圆形盖上的3ml完整MEM培养基中，其中含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素，并在37°C和5% CO2的湿室中生长。24 h后，取出培养基，替换为完全MEM培养基（对照）或5 μM Falcarindiol/FaDOH的完全MEM培养基。1小时、5小时和24小时后，用PBS冲洗两次孔，在室温下将细胞固定在4%甲醛中10分钟。然后将盖子保存在PBS中，在4°C的黑暗中直到使用。在每个时间点，分别为对照细胞和暴露于FaDOH的细胞制备和固定3个生物重复。

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拉曼成像[2]
内部构建的拉曼成像装置用于细胞成像。拉曼激发源包括一个532 nm的激光，通过自由空间光学耦合到奥林巴斯BX60显微镜上，通过一个100倍的NA=1的水浸物镜将激光聚焦到样品上，产生大约650 nm的有效光斑直径。后向散射拉曼信号由显微镜采集，并通过105 μm光纤定向到Acton SpectraPro 2500i f/6.5, 600 l/mm狭缝为100 μm的光谱仪和普林斯顿仪器PIXIS 400F 1340×400像素CCD相机，工作温度为- 75°C，光谱分辨率为3 - 6 cm-1。利用1 μm步长（步长最佳空间分辨率）的电动台阶绘制细胞图谱，以100 mW的激励功率（使用水浸样品）收集光谱，每个光谱积累1次，采集时间为1 s。使用此功率密度时，未注意到样品降解。对于每个对照和Falcarindiol/FaDOH，每个时间点至少成像3个细胞，生物复制导致每个时间点至少9个细胞图。

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白光显微镜[2]
采用Olympus IX81显微镜，150× （NA 1.45）油物镜和DIC（差分干涉对比度）通道采集图像。对固定未处理的对照细胞和Falcarindiol/FaDOH处理24 h的细胞进行成像。对两组样本的50幅图像进行了分析；在每个细胞中使用ImageJ对ld进行计数。执行非参数Wilcoxon秩和检验来比较两组不服从正态分布的样本。p值< 0.05为显著性。

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PPARγ基因在HT-29细胞中的表达[2]
采用实时荧光定量PCR （RT-qPCR）技术检测PPARγ2基因在HT-29细胞中的表达水平。在Falcarindiol/FaDOH处理前一天，30万个HT-29细胞/孔接种于6孔板中。然后去除培养基，在3 ml培养基中加入5µM FaDOH，细胞再孵育一段时间。在6孔板中，每孔有不同的Falcarindiol/FaDOH处理时间。0 min（对照）、10 min、1 h、24 h。对照（0 min）实验在不添加FaDOH的培养基中进行。24 h处理为0 min处理前24 h开始处理，依此类推。因此，同一钢板中的所有处理在同一时间停止。用500µl QIAzol Lysis Reagent收获细胞，900 rpm振荡2 min，停止处理。使用EconoSpin柱纯化提取RNA，随后将0.3µg RNA转化为互补DNA （cDNA）。然后使用GoTaq®Probe qPCR主混合物和MyGo Mini仪器对合成的cDNA进行RT-qPCR分析。管家基因为核糖体蛋白大P0 （RPLP0）。

肿瘤大鼠组织中的基因表达[2]
动物实验已获得丹麦中央动物实验监察局的批准（许可证号：2015-15-0201-00708）。实验采用5周龄雄性大鼠（F344品系），并附有健康证明。大鼠适应环境一周后，随机分为两组。第1组饲喂标准大鼠饲料（SRD），第2组饲喂添加了FaOH和Falcarindiol/FaDOH的SRD，具体方法如前所述（Kobaek-Larsen等，2019）。大鼠的饲养方式与之前的研究相同（Kobaek-Larsen等，2017）。采用RT-qPCR分析大鼠结肠活检组织中ABCA1基因的表达。活检样本包括来自第1组（接受SRD饲料）的肿瘤组织和来自第2组（接受添加7 µg FaOH g-1饲料和7 µg Falcarindiol/FaDOH g-1饲料）的相应大小的肿瘤组织。使用QIAzol提取组织RNA，经EconoSpin柱纯化，反转录为cDNA，最后使用RT-qPCR进行评估。采用管家基因β-葡糖醛酸酶（GUSB）作为内参进行多重RT-qPCR。ABCA1的表达水平进行四次重复测定，每次测定均进行两两比较。ABCA1的上调或下调采用比较CT法进行定量，具体方法见HT-29细胞基因表达部分。引物（MERK）和探针见表1。

[1]. Autophagy contributes to falcarindiol-induced cell death in breast cancer cells with enhanced endoplasmic reticulum stress. PLoS One. 2017 Apr 25;12(4):e0176348.

[2]. Falcarindiol Purified From Carrots Leads to Elevated Levels of Lipid Droplets and Upregulation of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-γ Gene Expression in Cellular Models. Front Pharmacol. 2020 Aug 28;11:565524.

据报道，在Anthriscus nitida、Eleutherococcus koreanus和其他一些有相关数据的生物体中均发现了法卡二醇。

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我们的数据表明，法卡二醇/FAD与化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）和蛋白酶体抑制剂硼替佐米具有显著的协同作用。这种协同作用可能是由于联合用药引起的应激敏感化或应激过载所致。癌细胞通常表现出更高的细胞应激水平，并且更需要应激支持通路才能存活。这使得癌细胞比正常细胞更容易受到应激敏感化或应激过载的影响。先前的研究表明，应激敏感化或应激过载可能是化疗药物的作用机制。我们的数据表明，FAD通过诱导内质网应激杀死乳腺癌细胞。靶向细胞应激反应不同或相同分支的药物可能协同诱导癌细胞的应激过载。与此一致，FAD 和 5-FU 分别诱导内质网应激和 DNA 损伤应激，二者在杀伤癌细胞方面表现出协同作用。多项研究表明，硼替佐米通过干扰内质网相关降解 (ERAD) 诱导内质网应激，从而增强其对癌细胞的细胞毒活性。FAD 和硼替佐米均能诱导内质网应激，二者在杀伤癌细胞方面也表现出协同作用。
结论：我们的研究证实了法卡二醇/FAD 对乳腺癌细胞的特异性抗癌作用。我们发现，FAD 诱导的自噬在增强的内质网应激引起的细胞死亡中发挥着重要作用。我们发现，FAD 与已获批准的抗癌药物 5-FU 和硼替佐米具有显著的协同作用。FAD 可能是一种治疗人类乳腺癌的潜在新型治疗药物。 [1]

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先前的研究表明，法卡二醇/FaDOH 可增加胆固醇外流，部分原因是其通过促进 ABCA1 的表达来实现的（Wang 等，2017），而 ABCA1 的表达是由 PPARγ 诱导的（Chawla 等，2001；Mogilenko 等，2010；Wang 等，2017）。ABCA1 对高密度脂蛋白 (HDL) 的形成以及胆固醇的清除至关重要（Wang 和 Tall Alan，2003）。由于胆固醇合成增加（Pihlajamäki等，2004）和ABCA1下调（Patel等，2011）与2型糖尿病相关，FaDOH作为PPARγ激动剂，可能具有抗糖尿病特性，其作用机制包括刺激葡萄糖摄取（El-Houri等，2015a）以及通过上调ABCA1促进胆固醇清除。胆固醇酯天然存在于脂滴（LDs）中（Fujimoto和Parton，2011），而拉曼光谱的端元光谱表明，FaDOH处理后存在油酸胆固醇酯和亚油酸胆固醇酯，这可能对FaDOH的功能具有重要意义，因为亚油酸已被证实具有抗糖尿病作用（Wu等，2017）。需要进一步的研究来探究和证实这种联系。
总之，通过无标记拉曼光谱成像和白光显微镜观察发现，在亚毒性剂量的FaDOH作用下，法卡二醇/FaDOH可诱导hMSCs脂质含量发生改变。与对照组细胞相比，FaDOH处理组细胞的脂滴（LDs）显著上调，拉曼光谱分析表明胆固醇亚油酸酯的生成。RT-qPCR结果显示，癌细胞中PPARγ2表达增加，肿瘤组织中ABCA1表达增加，这可能表明癌细胞和正常细胞中脂滴的生成均增加，从而有助于理解FaDOH的抗癌和抗糖尿病特性。根据我们的研究结果，不能排除 PPARγ 参与 FaDOH 上调 ABCA1 和 LD 的形成，因此需要对正常细胞和癌细胞进行进一步研究，包括使用 PPARγ 拮抗剂进行治疗，以探索 FaDOH 的潜在抗癌和抗糖尿病特性。[2]

C17H24O2

260.37126

260.177

55297-87-5

(+)-(3R,8S)-Falcarindiol;225110-25-8

5281148

Light yellow to brown liquid

1.0±0.1 g/cm3

408.2±45.0 °C at 760 mmHg

184.7±23.3 °C

0.0±2.2 mmHg at 25°C

1.524

6.32

40.46

2

2

9

19

394

2

CCCCCCC/C=C\[C@@H](C#CC#C[C@H](C=C)O)O

QWCNQXNAFCBLLV-YWALDVPYSA-N

InChI=1S/C17H24O2/c1-3-5-6-7-8-9-10-14-17(19)15-12-11-13-16(18)4-2/h4,10,14,16-19H,2-3,5-9H2,1H3/b14-10-/t16-,17+/m1/s1

(3R,8S,9Z)-heptadeca-1,9-dien-4,6-diyne-3,8-diol

Falcarindiol; (3S,8S)-Falcarindiol; (3R,8S,9Z)-heptadeca-1,9-dien-4,6-diyne-3,8-diol; AC1NQY3Z; Falcalindiol; 55297-87-5; Heptadeca-1,9-diene-4,6-diyne-3,8-diol; (8S,9Z)-heptadeca-1,9-dien-4,6-diyne-3,8-diol;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 33.33 mg/mL (~128.01 mM)

配方 1 中的溶解度: 1.11 mg/mL (4.26 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 11.1 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80 +，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。