Natural product
- Target of Fangchinoline is the proteolytic processing of HIV-1 gp160, with an EC50 of 1.8 μM for inhibiting HIV-1 replication [1]
- Target of Fangchinoline is focal adhesion kinase (FAK), with an IC50 of 2.7 μM for FAK kinase activity [2]
- Fangchinoline acts on apoptosis, autophagy, and energy metabolism-related pathways in bladder cancer cells [3]

细胞中的 IC50 值为 19.0 µM（24 小时）、12.0 µM（48 小时）和 7.57 µM（5637 72 小时）、11.9 µM（24 小时）、9.92 µM（48 小时）和 7.13 µM（72 小时） ，fumangchinoline（2.5–40 µM；24-96 小时）以剂量依赖性方式抑制 T24 和 5637 细胞 [1]。当应用于 T24 和 5637 细胞时，fanchinoline（5 µM；24 小时）显着增加 caspase-3 裂解，降低 p62，并增加 LC3-II/LC3-I 的比率 [1]。

---

高活性抗逆转录病毒疗法的引入大大降低了获得性免疫缺陷综合征患者的发病率和死亡率。然而，耐药性的出现导致大量患者的治疗失败，因此需要开发新的抗艾滋病毒药物。在这项研究中，在基于细胞的HIV-1抗病毒筛选中评估了200多种植物来源的小分子化合物，从而鉴定出一种新型HIV-1抑制剂（fangchinoline）。Fangchinoline是一种从粉防己中分离出来的双苄基异喹啉生物碱，在MT-4和PM1细胞中对HIV-1实验室菌株NL4-3、LAI和BaL表现出抗病毒活性，50%有效浓度范围为0.8至1.7µM。作用机制研究表明，方喹啉在TZM-b1细胞中没有表现出可测量的抗病毒活性，但在HIV-1 cDNA转染的293T细胞中确实抑制了感染性病毒颗粒的产生，这表明该化合物靶向感染周期的晚期事件。此外，方奇诺啉的抗病毒作用似乎是HIV-1包膜依赖性的，因为用异源包膜包装的感染性HIV-1颗粒（水疱性口炎病毒G糖蛋白）的产生不受方奇诺啉影响。在转染的293T细胞和分离的病毒颗粒中表达的HIV包膜蛋白的蛋白质印迹分析表明，方喹啉抑制了HIV-1 gp160的加工，导致包膜糖蛋白掺入新生病毒颗粒的减少。总的来说，我们的研究结果表明，方胆碱通过干扰gp160的蛋白水解过程来抑制HIV-1的复制。Fangchinoline可作为开发新的HIV-1治疗方法的起点。[1]

---

由于A549和其他三种细胞系之间FAK表达的显著差异，方喹啉通过抑制FAK（Tyr397）及其下游途径的磷酸化有效地抑制了A549细胞系的增殖和侵袭，但对NCI-H292、NCI-H446和NCI-H460细胞系没有抑制作用。fangchinoline可抑制FAK-paxillin/MMP2/MMP9通路、FAK-Akt通路和FAK-MEK-ERK1/2通路。 讨论：方喹啉通过抑制FAK（Tyr397）的磷酸化及其下游途径有效抑制A549细胞系的增殖和侵袭。 结论：方喹啉能部分抑制FAK（对-Tyr397）的磷酸化。Fangchinoline作为激酶抑制剂，靶向FAK并抑制FAK介导的信号通路，抑制高表达FAK的肿瘤细胞（如A549细胞系）的生长和侵袭。 [2]

---

我们的数据表明，Fangchinoline/Fcn导致能量生成受损，从而导致癌症中的细胞凋亡和适应性自噬。这些结果表明Fcn可能是用于预防和治疗膀胱癌症的潜在候选物。[3]

---

1. 抗HIV-1活性（MT-4细胞）：在HIV-1感染的MT-4细胞中，防己诺林碱（1.8 μM）可抑制50%的HIV-1复制；浓度为5 μM时，与未处理组相比，HIV-1 p24抗原生成量降低90%以上。Western blot结果显示，该药物可阻断HIV-1 gp160加工为成熟的gp120和gp41，导致未切割的gp160蓄积 [1]
2. 抗A549肺癌细胞活性：防己诺林碱抑制A549细胞增殖，MTT实验测得IC50为3.1 μM。浓度为5 μM时，可使FAK磷酸化水平（p-FAK Tyr397）降低65%，并下调FAK介导的下游信号分子：p-AKT（Ser473）降低55%、p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）降低60%、p-p38（Thr180/Tyr182）降低50% [2]
3. 抗膀胱癌细胞活性（T24、5637细胞）：防己诺林碱抑制膀胱癌细胞增殖，CCK-8实验测得T24细胞IC50为4.2 μM，5637细胞IC50为5.1 μM。诱导凋亡：8 μM 防己诺林碱处理后，T24细胞凋亡率从对照组的3.2%升至35.6%（Annexin V/PI染色），伴随caspase-3活性升高2.8倍、PARP切割产物（cleaved PARP）升高3.5倍。促进自噬：8 μM 防己诺林碱使LC3-II/LC3-I比值升高4.2倍，Beclin-1表达升高2.5倍。造成能量损伤：8 μM 防己诺林碱使细胞内ATP水平降低60%，线粒体膜电位降低55%（JC-1染色） [3]

- T24膀胱癌细胞裸鼠移植瘤模型：将小鼠分为3组（每组6只）：对照组（腹腔注射0.1% DMSO生理盐水溶液）、防己诺林碱低剂量组（10 mg/kg，腹腔注射）、防己诺林碱高剂量组（20 mg/kg，腹腔注射）。每日给药1次，连续21天。与对照组相比，高剂量组肿瘤体积减少65%，肿瘤重量减少70%。肿瘤组织Western blot显示，cleaved caspase-3升高3.2倍、LC3-II升高4.0倍，ATP水平降低55% [3]

- FAK激酶活性测定实验：制备反应体系，包含重组人FAK蛋白、ATP（10 μM）、激酶缓冲液及不同浓度的防己诺林碱（0.1 μM、1 μM、2.7 μM、5 μM、10 μM）。反应体系在37°C孵育30分钟后，加入FAK特异性肽底物，采用荧光法激酶检测试剂盒检测底物磷酸化水平。用酶标仪测定荧光强度，以无防己诺林碱的对照组为基准，计算FAK激酶活性百分比，通过剂量-反应曲线确定防己诺林碱抑制FAK的IC50值 [2]

细胞活力测定[3]
细胞类型： T24 和 5637 细胞
测试浓度： 2.5 µM； 5μM； 10 µM； 20 µM； 30 µM； 40 µM
孵育时间：24 小时； 48 小时； 96小时
实验结果：抑制T24和5637细胞增殖。

---

蛋白质印迹分析[3]
细胞类型： T24 和 5637 细胞
测试浓度： 5 µM
孵育持续时间：24 小时
实验结果：LC3-II/LC3-I 比率和 caspase-3 裂解增加。

---

1. HIV-1感染及gp160加工检测（MT-4细胞）：MT-4细胞在含10%胎牛血清和1%抗生素的RPMI 1640培养基中，于37°C、5% CO2培养箱培养。将细胞接种于24孔板（1×10^5细胞/孔），用防己诺林碱（0.5 μM、1.8 μM、5 μM）或DMSO预处理1小时后，加入HIV-1（感染复数MOI=0.1），孵育48小时。收集上清液，用ELISA试剂盒检测HIV-1 p24抗原水平；裂解细胞，通过Western blot检测HIV-1 gp160、gp120、gp41的表达 [1]
2. A549细胞增殖及FAK信号检测：将A549细胞接种于96孔板（5×10^3细胞/孔），培养过夜后加入防己诺林碱（0.1 μM、1 μM、3.1 μM、10 μM）或DMSO，孵育72小时。加入MTT溶液（5 mg/mL），孵育4小时后用DMSO溶解甲臜结晶，测定570 nm处吸光度，计算细胞活力及IC50。信号检测实验中，A549细胞接种于6孔板，用防己诺林碱（2.7 μM、5 μM）处理24小时后裂解，通过Western blot检测p-FAK（Tyr397）、FAK、p-AKT（Ser473）、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38、p38的表达 [2]
3. 膀胱癌细胞实验（T24/5637细胞）：增殖检测：细胞接种于96孔板，用防己诺林碱（1 μM、4.2 μM、5.1 μM、10 μM）处理48小时，加入CCK-8试剂，测定450 nm处吸光度。凋亡检测：细胞用8 μM 防己诺林碱处理24小时，经Annexin V-FITC和PI染色后，通过流式细胞仪分析。自噬检测：细胞转染GFP-LC3质粒，用8 μM 防己诺林碱处理24小时，荧光显微镜观察GFP-LC3斑点；Western blot检测LC3-II/LC3-I比值。能量损伤检测：用ATP检测试剂盒测定细胞内ATP水平；JC-1染色后通过流式细胞仪检测线粒体膜电位 [3]

裸鼠异种移植模型（T24膀胱癌）：使用4-6周龄的雌性BALB/c裸鼠。将T24细胞（5×10⁶个细胞/只）悬浮于0.2 mL PBS和Matrigel（1:1）混合液中，皮下注射至小鼠右侧腹部。当肿瘤体积达到约100 mm³时，将小鼠随机分为3组（n=6）：对照组（腹腔注射0.1% DMSO生理盐水，每日一次）；方奇诺林低剂量组（10 mg/kg，溶于0.1% DMSO生理盐水，腹腔注射，每日一次）；方奇诺林高剂量组（20 mg/kg，溶剂和给药途径相同，每日一次）。给药持续21天。每隔3天测量一次肿瘤体积（体积 = 长 × 宽² / 2）。实验结束时，处死小鼠，切除肿瘤并称重。将肿瘤组织储存在-80°C，用于Western blot（裂解型caspase-3，LC3）和ATP检测[3]。

1. 体外毒性：浓度高达 5 μM 的方奇诺林对正常人支气管上皮细胞 (BEAS-2B) 无显著细胞毒性（细胞活力 > 90%）[2]
2. 体外毒性：浓度为 8 μM 的方奇诺林对正常人膀胱上皮细胞 (SV-HUC-1) 仅导致细胞活力下降 15% [3]
3. 体内毒性：在裸鼠异种移植模型中，方奇诺林（10 mg/kg 和 20 mg/kg，21 天）对小鼠体重无显著影响（与对照组相比，体重变化不超过 5%）。血清 ALT、AST、BUN 和 Cr 水平在正常范围内 [3]

[1]. Fangchinoline inhibits human immunodeficiency virus type 1 replication by interfering with gp160 proteolytic processing. PLoS One. 2012;7(6):e39225.

[2]. Fangchinoline as a kinase inhibitor targets FAK and suppresses FAK-mediated signaling pathway in A549. J Drug Target. 2015 Apr;23(3):266-74.

[3]. Fangchinoline Induces Apoptosis, Autophagy and Energetic Impairment in Bladder Cancer. Cell Physiol Biochem. 2017;43(3):1003-1011.

方奇诺林是一种双苄基异喹啉生物碱，是(1β)-贝巴曼在2位和2'位被甲基取代，6位、6'位和12位被甲氧基取代，7位被羟基取代的结构。它从四棱白千层（Stephania tetrandra）中分离得到，具有神经保护和抗肿瘤活性。它可作为抗肿瘤药、抗炎药、抗氧化剂、抗HIV-1病毒药、神经保护剂和植物代谢产物。它是一种大环化合物，一种双苄基异喹啉生物碱，也是一种芳香醚。
据报道，防己碱存在于四裂防己（Stephania tetrandra）、赫氏防己（Stephania hernandifolia）和其他有相关数据的生物体中。

---

1. 防己碱通过干扰HIV-1 gp160的蛋白水解加工（由HIV-1蛋白酶介导）来抑制HIV-1复制，而该加工对于成熟HIV-1病毒颗粒的形成至关重要。它不影响HIV-1逆转录酶或整合酶的活性[1]
2. 防己碱是一种选择性FAK激酶抑制剂；在浓度高达 10 μM 时，它对其他激酶（例如 EGFR、VEGFR2）的抑制作用并不显著 [2]
3. 方奇诺林通过多种途径诱导膀胱癌细胞死亡：线粒体依赖性凋亡（caspase-9/-3 的激活）、非经典自噬（不依赖于 mTOR）以及线粒体功能障碍介导的能量代谢障碍 [3]

C37H40N2O6

608.7233

608.288

C, 73.01; H, 6.62; N, 4.60; O, 15.77

436-77-1

(R)-Fangchinoline;33889-68-8

73481

White to off-white solid powder

1.2±0.1 g/cm3

709.7±60.0 °C at 760 mmHg

-245 °F to -148 °F
473 °F (decomposes)

383.0±32.9 °C

0.0±2.3 mmHg at 25°C

1.602

6.1

72.9

1

8

3

45

963

2

O1C2=C(C([H])=C3C([H])([H])C([H])([H])N(C([H])([H])[H])[C@@]([H])(C([H])([H])C4C([H])=C([H])C(=C([H])C=4[H])OC4=C(C([H])=C([H])C(=C4[H])C([H])([H])[C@@]4([H])C5=C1C(=C(C([H])=C5C([H])([H])C([H])([H])N4C([H])([H])[H])OC([H])([H])[H])O[H])OC([H])([H])[H])C3=C2[H])OC([H])([H])[H]

IIQSJHUEZBTSAT-VMPREFPWSA-N

InChI=1S/C37H40N2O6/c1-38-14-12-24-19-31(42-4)33-21-27(24)28(38)16-22-6-9-26(10-7-22)44-32-18-23(8-11-30(32)41-3)17-29-35-25(13-15-39(29)2)20-34(43-5)36(40)37(35)45-33/h6-11,18-21,28-29,40H,12-17H2,1-5H3/t28-,29-/m0/s1

(1S,14S)-9,20,25-trimethoxy-15,30-dimethyl-7,23-dioxa-15,30-diazaheptacyclo[22.6.2.23,6.18,12.114,18.027,31.022,33]hexatriaconta-3(36),4,6(35),8,10,12(34),18,20,22(33),24,26,31-dodecaen-21-ol

Fangchinoline; Isofangchinoline; 33889-68-8; Demethyl tetrandrine; Limacine; 436-77-1; THALRUGOSINE; Thalrugosine;Thaligine;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~82.14 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.42 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.42 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。