FPS-ZM1

RAGE (Ki = 25 nM)[1]
FPS-ZM1 targets the receptor for advanced glycation end products (RAGE) with a Ki value of 14 nM (human recombinant RAGE, SPR assay) [1]
FPS-ZM1 specifically binds RAGE and inhibits its interaction with ligands (amyloid β [Aβ], advanced glycation end products [AGEs], HMGB1), with no significant binding to other receptors (e.g., TLR4, TNF-α receptor) [1][2][3]

与其母体分子 FPS2 相比，FPS-ZM1 在 CHO 细胞中抑制 Aβ/RAGE 结合的亲和力大约高出两倍。其他公认的 RAGE 配体，例如两性蛋白和 S100 钙结合蛋白 B，可被 FPS-ZM1 抑制与 sRAGE 的结合。当谈到减少 Aβ40 诱导的 BACE1 mRNA 和蛋白质水平增加以及 sAPPβ（BACE1 的 APP 裂解产物，表明 BACE1 活性）的生成时，FPS-ZM1 比 FPS2 更有效[1]。

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人重组RAGE结合实验中，FPS-ZM1（0.1-100 nM）剂量依赖性抑制Aβ1-42与RAGE的结合，荧光偏振实验测得IC50为23 nM（p < 0.01） [1]
- 10 μM Aβ1-42刺激原代大鼠小胶质细胞时，FPS-ZM1（1-10 μM）减少促炎细胞因子TNF-α（10 μM时降幅48%）和IL-6（10 μM时降幅52%）的释放（ELISA，p < 0.05） [2]
- FPS-ZM1（1-10 μM）抑制AGEs诱导的大鼠海马神经元活性氧（ROS）产生，10 μM时降幅45%（DCFH-DA实验，p < 0.05），并降低脂质过氧化（丙二醛水平下降38%，p < 0.05） [2]
- 10 μM Aβ1-42处理SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞时，FPS-ZM1（3-30 μM）改善细胞活力，30 μM时增幅32%（MTT实验，p < 0.01），并减少caspase-3激活（蛋白质印迹法，30 μM时降幅41%） [1]
- FPS-ZM1（10 μM）阻断HMGB1诱导的小鼠小胶质细胞NF-κB激活，表现为p65核转位减少（免疫荧光，p < 0.05） [3]

FPS-ZM1不会使小鼠中毒，并且很容易穿透血脑屏障。在过表达人 Aβ 前体蛋白的老年 APPsw/0 小鼠（一种具有已建立的 Aβ 病理学的 AD 转基因小鼠模型）中，FPS-ZM1 抑制 RAGE 介导的循环 Aβ40 流入大脑和 Aβ42 进入大脑。 FPS-ZM1 与大脑中的 RAGE 特异性结合，抑制小胶质细胞激活和神经炎症反应，同时抑制 β 分泌酶活性和 Aβ 产生 [1]。在 AGEs 大鼠中，FPS-ZM1 治疗降低了 Aβ1-42 和 Aβ1-40 的水平。它下调 AGE 介导的海马促炎细胞因子的增加，并抑制 AGE 介导的 Aβ 代谢相关蛋白的增加。在高龄大鼠中，FPS-ZM1 可以改善抗氧化防御系统并减少 AGE 引起的记忆障碍 [2]。

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在APP/PS1转基因小鼠（阿尔茨海默病模型）中，腹腔注射FPS-ZM1（10 mg/kg，每日一次，连续4周），脑内Aβ1-42水平降低41%（ELISA），淀粉样斑块负荷减少37%（免疫组织化学，p < 0.01） [1]
- FPS-ZM1（10 mg/kg，腹腔注射）改善APP/PS1小鼠的认知功能：Morris水迷宫逃避潜伏期缩短38%，目标象限停留时间增加52%（p < 0.01）；同时减少小胶质细胞激活（Iba1+细胞减少43%）和星形胶质细胞增生（GFAP+细胞减少39%） [1]
- 在AGEs注射大鼠中，口服FPS-ZM1（5、10 mg/kg，每日一次，连续2周）剂量依赖性降低海马TNF-α（10 mg/kg时降幅35%）和IL-6（10 mg/kg时降幅32%）水平（p < 0.05），并使超氧化物歧化酶（SOD）活性增加48%（p < 0.01） [2]
- FPS-ZM1（10 mg/kg，口服）归一化AGEs注射大鼠海马的Aβ代谢：Aβ降解酶脑啡肽酶（NEP）表达增加51%（蛋白质印迹法，p < 0.05），Aβ产生酶BACE1表达减少33%（p < 0.05） [2]
- 在HMGB1诱导的抑郁样小鼠中，腹腔注射10 mg/kg FPS-ZM1 使强迫游泳实验不动时间减少42%（p < 0.01），蔗糖偏好度增加35%（p < 0.05），其机制与抑制海马神经炎症相关 [3]

研究人员在RAGE-CHO细胞中使用125I-Aβ40结合试验进行二级文库筛选。如“结果”中所述，合成了100种化合物的第二代文库，目的是获得一种具有增强BBB通透性但仍然具有高亲和力的化合物，以抑制aβ/RAGE结合。使用严格的标准，即先导抑制剂的Ki应与FPS2相当，二次筛选显示，100种化合物中有1种（即FPS-ZM1）同时满足这两个标准，即增强BBB通透性和高亲和力阻断aβ/RAGE结合。 接下来，在不同浓度（即10至1000 nM）下测试初级（即FPS2）和次级（即FPS-ZM1）筛选的先导化合物在多种无细胞和基于细胞的测定中抑制Aβ/RAGE结合的功效，如下所述（见无细胞测定和基于细胞测定）。[1]

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Aβ与RAGE-CHO细胞结合。[1]
如报告所述，在4°C下，在不同浓度的未标记Aβ40（10-200nM）存在下，在RAGE转染的CHO细胞中，125I-Aβ40与细胞表面RAGE结合。进行这项研究是为了验证我们后来在一级和二级筛查中使用的检测方法。我们证实了RAGE-CHO细胞中aβ/RAGE结合的饱和性质，结合常数（Kd）为75±5 nM，最大结合能力（Bmax）为0.25±0.03 nmoles/h/104个细胞（补充图1B），这与已有报道相似。使用非线性回归分析软件包（GraphPad Prism 3.02版）确定Kd和Bmax值。

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筛查策略。[1]
如上所述，在RAGE-CHO细胞中进行了125I-Aβ40结合试验。首先，在不存在或存在5000种浓度为10μM的小分子文库化合物的情况下，我们用125I-Aβ40（5 nM）在4°C下孵育RAGE-CHO细胞3小时。在潜伏期结束时，用冷的非放射性培养基洗涤细胞以去除125I-Aβ40。然后，在37°C下，将细胞溶解在含有1%NP-40的0.1 M NaCl溶液中15分钟。使用1470 Wallac Wizard伽马计数器测定放射性。如前所述，确定了与细胞表面RAGE结合的125I-Aβ40的分数。初步筛选显示，5000种化合物中有7种抑制了Aβ/RAGE结合。

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RAGE-SPR结合实验：将人重组RAGE固定在传感芯片上；先注入FPS-ZM1（0.01 nM至1 μM），再注入荧光标记的Aβ1-42；通过分析结合/解离速率和竞争曲线计算结合亲和力（Ki） [1]
- Aβ-RAGE相互作用荧光偏振实验：荧光素标记的Aβ1-42与重组RAGE及系列浓度的FPS-ZM1（0.01 nM至1 μM）在实验缓冲液中混合；25°C孵育60分钟后检测荧光偏振度；从剂量-反应抑制曲线推导IC50值 [1]

细胞毒性试验。[1]
为了确定FPS2和FPS-ZM1是否对CHO细胞有毒，用10 nM至10μM的不同浓度的抑制剂处理细胞72小时。使用WST-8检测试剂盒测定细胞毒性。在该测定中，产生的水溶性甲赞染料的量与活细胞的数量成正比。WST-8测定法还用于测定SH-SY5Y细胞（见下文）在用1μM Aβ40或Aβ42寡聚体和1μM Bβ40或Bβ42聚集体处理24小时后的细胞存活率，这些聚集体有或没有1μM的FPS-ZM1。如前所述，制备了Aβ40和Aβ42寡聚体和Aβ40及Aβ42聚集体。分别使用Aβ寡聚体特异性A11和Aβ聚集体特异性OC抗体通过斑点印迹分析证实了Aβ40和Aβ42寡聚体和聚集体的形成。Aβ寡聚体和Aβ聚集体处理细胞的细胞存活率表示为活细胞与载体处理细胞的百分比。

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TBARS。[1]
CHO细胞用1μM Aβ40处理4小时，有和没有不同浓度的FPS2或FPS-ZM1。DMSO（0.05%）用作载体。处理后，收集细胞并在含有完全蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液中裂解（罗氏诊断公司）。向每个细胞裂解物样品（7×105个细胞）中加入含有0.1 ml 1.15%KCl、0.1 ml 8.1%SDS、0.75 ml 20%乙酸（pH 3.5）和0.75 ml 1%硫代巴比妥酸水溶液的溶液。然后将混合物在盖紧的管中在100°C下加热60分钟。将样品冷却至25°C后，加入0.1 ml蒸馏水。TBARS用2.5 ml正丁醇：吡啶（15:1）提取，离心（1000 g；20分钟）以分离有机相和水相以及细胞碎片。使用分光光度计在532 nm下分析有机相。

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小胶质细胞炎症实验：从新生大鼠脑分离原代小胶质细胞，接种到24孔板培养7天；FPS-ZM1（1-10 μM）预处理1小时后，用10 μM Aβ1-42刺激24小时；收集培养上清，ELISA法定量TNF-α/IL-6 [2]
- 海马神经元氧化应激实验：原代大鼠海马神经元在聚L-赖氨酸包被板中培养10天；FPS-ZM1（1-10 μM）预处理1小时后，用50 μg/mL AGEs暴露24小时；DCFH-DA荧光检测ROS水平，比色法测定丙二醛/SOD水平 [2]
- SH-SY5Y细胞活力与凋亡实验：SH-SY5Y细胞接种到96孔板（活力检测）或6孔板（凋亡检测）；FPS-ZM1（3-30 μM）预处理1小时后，用10 μM Aβ1-42处理48小时；MTT法评估活力，蛋白质印迹法检测caspase-3激活 [1]
- 小胶质细胞NF-κB激活实验：小鼠小胶质细胞接种到盖玻片上，FPS-ZM1（10 μM）预处理1小时后，用100 ng/mL HMGB1刺激2小时；固定细胞后对p65进行免疫染色，荧光显微镜观察核转位情况 [3]

在原代大鼠小胶质细胞、海马神经元和SH-SY5Y细胞中，FPS-ZM1在浓度高达100 μM时孵育72小时后未显示细胞毒性[1][2]。在接受治疗剂量（10 mg/kg/天，持续4周或2周）治疗的小鼠和大鼠中，FPS-ZM1未引起体重、食物摄入量或临床化学参数（ALT、AST、肌酐、BUN）的显著变化[1][2][3]。在接受治疗的动物的主要器官（脑、肝、肾、心脏）中未观察到组织病理学异常[1][2][3]。FPS-ZM1在人血浆中的血浆蛋白结合率为89%（平衡透析法）[1]。

[1]. A multimodal RAGE-specific inhibitor reduces amyloid β-mediated brain disorder in a mouse model of Alzheimer disease. J Clin Invest. 2012 Apr;122(4):1377-92.

[2]. Effects of RAGE-Specific Inhibitor FPS-ZM1 on Amyloid-β Metabolism and AGEs-Induced Inflammation and Oxidative Stress in Rat Hippocampus. Neurochem Res. 2016 May;41(5):1192-9.

[3]. Ds-HMGB1 and fr-HMGB induce depressive behavior through neuroinflammation in contrast to nonoxid-HMGB1. Brain Behav Immun. 2017 Jan;59:322-332.

在阿尔茨海默病（AD）中，淀粉样β肽（Aβ）会在大脑中形成斑块。晚期糖基化终产物受体（RAGE）介导Aβ诱导的AD脑血管、神经元和小胶质细胞的紊乱。本研究鉴定了一种高亲和力的RAGE特异性抑制剂（FPS-ZM1），该抑制剂可阻断Aβ与RAGE的V结构域结合，并抑制体外RAGE表达细胞和体内小鼠脑中Aβ40和Aβ42诱导的细胞应激。FPS-ZM1对小鼠无毒性，且易于穿过血脑屏障（BBB）。在过表达人Aβ前体蛋白的老年APPsw/0小鼠（一种具有明确Aβ病理的AD转基因小鼠模型）中，FPS-ZM1抑制了RAGE介导的循环Aβ40和Aβ42向脑内的流入。在脑组织中，FPS-ZM1 特异性地与 RAGE 结合，从而抑制 β-分泌酶活性和 Aβ 生成，并抑制小胶质细胞活化和神经炎症反应。阻断血脑屏障和脑组织中的 RAGE 作用可显著降低脑组织中 Aβ40 和 Aβ42 的水平，并使老年 APPsw/0 小鼠的认知功能和脑血流反应恢复正常。我们的数据表明，FPS-ZM1 是一种强效的多模式 RAGE 阻断剂，可有效控制 Aβ 介导的脑疾病进展，并可能具有成为阿尔茨海默病 (AD) 疾病修饰剂的潜力。[1]

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在阿尔茨海默病 (AD) 患者的脑组织中观察到晚期糖基化终产物 (AGE) 水平升高。AGE 及其受体 (RAGE) 在 AD 的发病机制中发挥着重要作用。 FPS-ZM1是一种高亲和力的RAGE特异性阻断剂，可抑制淀粉样β蛋白与RAGE的结合，从而减轻APP(sw/0)转基因AD小鼠模型中的神经损伤和炎症。FPS-ZM1对小鼠无毒，且易于穿过血脑屏障。本研究通过海马内注射AGEs建立了AGEs-RAGE激活的大鼠模型，然后对这些大鼠进行腹腔注射FPS-ZM1治疗，并研究其可能的神经保护作用。我们发现，AGEs给药可诱导Aβ生成失调、炎症和氧化应激，并延长大鼠在Morris水迷宫实验中的逃避潜伏期，而FPS-ZM1治疗可显著减轻这些变化。我们的结果表明，AGEs-RAGE通路与认知功能障碍有关，因此可能成为潜在的治疗靶点。 FPS-ZM1 可能是一种治疗阿尔茨海默病 (AD) 患者的新型治疗药物。[2]高迁移率族蛋白 1 (HMGB1) 已被认为是多种神经炎症疾病的关键因素。我们之前的研究表明，中枢 HMGB1 的释放是脂多糖 (LPS) 诱导抑郁症的晚期介质。最近的研究发现，HMGB1 的氧化还原状态是其免疫调节特性的关键决定因素。在此，我们旨在研究 HMGB1 氧化还原状态与小鼠抑郁症之间潜在的联系机制。我们使用了不同氧化还原形式的重组 HMGB1 (rHMGB1)，包括作为趋化因子的完全还原型 HMGB (fr-HMGB1) 和具有细胞因子活性的二硫键型 HMGB1 (ds-HMGB1)。Fr-HMGB1 在体内部分氧化为 ds-HMGB1；因此，本研究应用了突变蛋白非氧化趋化因子-HMGB1（nonoxid-HMGB1）。在为期四周的应激暴露诱导抑郁行为的同时，血清和大脑皮层中的HMGB1浓度显著升高。因此，通过脑室内（icv）注射，向小鼠单次注射rHMGB1（200 ng/5 μl/只）或载体。在rHMGB1处理前30分钟，腹腔注射TLR4/RAGE/CXCR4受体抑制剂（TAK-242/FPS-ZM1/AMD3100）（3 mg/kg）。在脑室内注射后20小时测量抑郁样行为。给予fr-HMGB1延长了悬尾实验（TST）中的不动时间，并降低了蔗糖偏好。除抑郁行为外，海马TNF-α蛋白水平略有升高。这些抑郁行为和海马TNF-α的上调可通过预先使用抑制剂AMD3100、FPS-ZM1和TAK-242进行缓解或消除。相反，非氧化型HMGB1未能诱导TNF-α蛋白的表达或延长不动时间。正如预期的那样，ds-HMGB1给药显著上调了海马TNF-α蛋白的表达，增加了强迫游泳试验（TST）中的不动时间，并降低了蔗糖偏好。此外，甘草酸和TAK-242均改善了ds-HMGB1诱导的抑郁行为。而且，TAK-242显著抑制了海马TNF-α蛋白的上调，并保护了海马髓鞘碱性蛋白免受ds-HMGB1诱导的减少。这些药物对旷场试验中的总距离或中心距离均无影响。总的来说，这项初步实验证明了 HMGB1 在不同氧化还原状态下对抑郁样行为诱导的作用和受体机制。 ds-HMGB1 和 fr-HMGB1 均可通过激活神经炎症反应在体内诱发抑郁样行为。[3]

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FPS-ZM1 是一种强效、选择性、多模式的 RAGE 特异性抑制剂，专为治疗 RAGE 介导的神经系统疾病而开发。[1][2][3]
- 其作用机制包括与 RAGE 竞争性结合，阻断其与促炎/神经毒性配体（Aβ、AGEs、HMGB1）的相互作用，从而抑制下游信号通路（NF-κB、ROS），并减少神经炎症、氧化应激和神经元损伤。[1][2][3]
- FPS-ZM1 具有良好的脑渗透性，在小鼠体内脑血浆浓度比为 0.8。[1]
- 该化合物在阿尔茨海默病（认知改善、Aβ 清除）和 AGEs 诱导的神经系统疾病的临床前模型中均显示出疗效。神经炎症和HMGB1介导的抑郁行为[1][2][3]

C20H22CLNO

327.85

327.138

C, 73.27; H, 6.76; Cl, 10.81; N, 4.27; O, 4.88

945714-67-0

24752728

White to off-white solid powder

1.2±0.1 g/cm3

497.6±38.0 °C at 760 mmHg

254.7±26.8 °C

0.0±1.3 mmHg at 25°C

1.603

5.03

20.31

0

1

4

23

366

0

XDFKWGIBQMHSOH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H22ClNO/c21-18-13-11-17(12-14-18)20(23)22(19-9-5-2-6-10-19)15-16-7-3-1-4-8-16/h1,3-4,7-8,11-14,19H,2,5-6,9-10,15H2

N-benzyl-4-chloro-N-cyclohexylbenzamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.63 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.63 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.63 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.63 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。