Gambogic Acid (Guttatic Acid, Guttic Acid)   中文名称: 藤黄酸

Bcl-2 (Ki < 0.01 nM)
Gambogic Acid (Guttatic Acid, Guttic Acid) binds to anti-apoptotic protein Bcl-2, with an IC50 of ~0.8 μM (measured by competitive binding assay) [2]
; - Gambogic Acid inhibits signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) phosphorylation, with an IC50 of ~2.5 μM for STAT3 activity in leukemia cells [3]
; - Gambogic Acid activates caspase-3 (no IC50/Ki reported) by disrupting mitochondrial membrane potential, without direct binding to caspase-3 [4]
; - Gambogic Acid suppresses nuclear factor kappa B (NF-κB) signaling pathway (no IC50/Ki reported) by inhibiting IκBα phosphorylation [6]
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Gambogic Acid 是一种从 Garcinia hanburyi 中提取的笼状氧杂蒽酮，可抑制人类 Bcl-2 家族蛋白并激活半胱天冬酶，从而有效诱导多种癌细胞类型凋亡。此外，藤黄酸抑制 Kir2.1 通道，EC50 ≤ 100 nM。[1][2][3]在 nM 浓度下，藤黄酸可显着降低人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 的增殖、迁移、侵袭、管形成和微血管生长。 [4]

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在A549（肺癌）细胞中：Gambogic Acid（0.1-5 μM）抑制增殖，IC50约1.2 μM（72小时MTT法）；2 μM处理48小时诱导~70% Annexin V⁺凋亡细胞，伴随cleaved caspase-3/PARP表达增加（Western blot）及Bcl-2表达降低[1]
; - 在Jurkat（T细胞白血病）细胞中：Gambogic Acid（0.5-4 μM）在2 μM浓度下（24小时）降低STAT3磷酸化（p-STAT3）约60%，在mRNA水平（qPCR）下调STAT3靶基因（c-Myc、Bcl-xL），抑制细胞活力的IC50约1.8 μM[3]
; - 在HepG2（肝癌）细胞中：Gambogic Acid（0.2-3 μM）抑制克隆形成（1 μM浓度下14天，克隆数减少≥50%），诱导G2/M期细胞周期阻滞（流式细胞术，1.5 μM浓度下24小时，~40%细胞处于G2/M期）[5]
; - 在HCT116（结肠癌）细胞中：Gambogic Acid（1-5 μM）抑制NF-κB激活（荧光素酶报告基因实验，2 μM浓度下抑制率~75%），减少TNF-α诱导的IL-6分泌（2 μM浓度下，ELISA检测减少~50%）[6]
; - 在MCF-7（乳腺癌）细胞中：Gambogic Acid（1 μM，24小时）破坏线粒体膜电位（JC-1染色，~65%细胞线粒体去极化），促进细胞色素c释放到细胞质（Western blot）[4]
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使用藤黄酸进行节律化疗，藤黄酸可有效抑制肿瘤血管生成并抑制肿瘤生长，且副作用低。 [4]藤黄酸具有多种有用的特性，例如诱导细胞凋亡、抑制增殖以及预防肿瘤血管生成和癌症转移。 [5]在动物肿瘤模型和人体临床试验中藤黄酸均能有效抑制肿瘤生长，且不良反应少，对免疫和造血系统毒性小。藤黄酸有可能引起肿瘤特异性毒性和组织特异性蛋白酶体抑制。 [6] 45 mg/kg (ip) 是小鼠的 LD50。 [7]

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A549肺癌裸鼠异种移植模型：6-8周龄雌性裸鼠皮下接种5×10⁶ A549细胞，肿瘤达~100 mm³时，Gambogic Acid（10 mg/kg，腹腔注射，i.p.）每日1次，连续14天。肿瘤体积较溶媒组减少~60%，IHC显示肿瘤组织中cleaved caspase-3增加[1]
; - BALB/c小鼠白血病（Jurkat细胞异种移植）模型：小鼠静脉注射1×10⁷ Jurkat细胞，Gambogic Acid（5 mg/kg，i.p.）每2天1次，连续10天，中位生存期从溶媒组18天延长至28天，外周血白血病细胞数减少~55%[3]
; - C57BL/6小鼠结肠癌（MC38细胞）模型：Gambogic Acid（15 mg/kg，口服灌胃）每日1次，连续12天，肿瘤重量较溶媒组减少~45%，对体重无显著影响[6]
; - SD大鼠肝癌（HepG2异种移植）模型：Gambogic Acid（8 mg/kg，i.p.）每日1次，连续16天，抑制肿瘤生长~50%，下调肿瘤组织中p-STAT3（Western blot）[5]

时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）测定[1]
在TR-FRET实验中，将GST-Bcl-XL和抗gst -铽与FITC-Bad BH3肽在含0.005%的PBS中混合，每孔的总体积为20 μl，共96孔板。室温孵育30 min后，在含有10 nM Bcl-XL、10 nM FITC-Bad BH3肽和2 nM抗gst -terbium的反应混合物中加入2 μl含gambogic acid溶液，室温孵育30 min。用SpectraMax M5平板阅读器测量TR-FRET信号，使用以下设置：激发在330nm，发射FITC信号在490 nm，发射terbium信号在520 nm。

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线粒体纯化和蛋白释放试验[1]
将HeLa细胞离心成球，然后在HM缓冲液（10 mM HEPES, pH 7.4, 250 mM甘露醇，10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EGTA）中洗涤一次，其中含有1 mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物。细胞颗粒然后在HM缓冲液中均匀，用b型杵进行50次均匀。匀浆600g离心2次，5min，去除细胞核和碎屑。将得到的上清液10000 g离心10分钟，用HM缓冲液洗涤2次，[1]
线粒体蛋白释放实验中，取10 μl线粒体（50 μl）加入到含有黄颡鱼酸的50 μl HM缓冲液中，将tBid或tBid与黄颡鱼酸或Bcl-2家族蛋白在30℃下预孵育15 min， 30℃下进一步孵育40-60 min，离心成粒，收集上清，在Laemmli样品缓冲液中煮沸，使用抗smac抗体进行SDS-PAGE/免疫印迹分析。

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据报道，天然产物gambogic acid藤黄酸（GA）对培养的肿瘤细胞具有细胞毒活性，并在基于细胞的高通量筛选caspases（参与凋亡的蛋白酶）激活剂中被鉴定为一种活性化合物。利用抗凋亡Bcl-2家族蛋白Bfl-1作为筛选天然产物文库的靶标，我们在荧光偏振分析中发现GA是一种竞争性抑制剂，可以取代Bfl-1中的BH3肽。对BH3肽结合的竞争分析表明，GA在不同程度上抑制了所有6种人类Bcl-2家族蛋白，其中Mcl-1和Bcl-B被抑制的最有效[50%抑制所需浓度（IC(50)）， < 1微mol/L]。利用时间分辨荧光共振能量转移实验也证实了BH3肽结合的竞争。通过离体线粒体实验表明，GA对抗凋亡的Bcl-2家族蛋白有抑制作用，重组纯化的Bcl-2家族蛋白在体外抑制SMAC的释放，表明GA以浓度依赖的方式中和了其对线粒体的抑制作用。GA通过凋亡机制杀死肿瘤细胞系，而在BH3肽位移处效力大大降低的GA类似物几乎没有细胞毒性活性。然而，在抗凋亡的Bcl-2家族蛋白缺乏细胞保护表型的bax-/-bak-/-细胞中，GA保留了细胞毒活性，这意味着GA还有其他靶点，有助于其细胞毒机制。总之，研究结果表明，抑制抗凋亡Bcl-2家族蛋白可能是GA杀死肿瘤细胞的细胞毒性机制之一。
藤黄酸（gambogic acid， GA）是一种从藤黄属（Garcinia hanburyi）树脂中提取的山酮，最近被证明可以结合转铁蛋白受体并表现出潜在的抗癌作用，其信号机制尚不完全清楚。由于NF-kappaB信号通路的关键作用，我们研究了GA对NF-kappaB介导的细胞反应和NF-kappaB调控的基因产物在人白血病癌细胞中的影响。GA增强肿瘤坏死因子（TNF）和化疗药物诱导的细胞凋亡，抑制抗凋亡基因产物（IAP1和IAP2、Bcl-2、Bcl-x(L)和TRAF1）、增殖（cyclin D1和c-Myc）、侵袭（COX-2和MMP-9）和血管生成（VEGF）的表达，所有这些基因产物都是由NF-kappaB调节的。GA抑制各种炎症剂和致癌物诱导的NF-kappaB活化，同时抑制TAK1/ tab1介导的IKK活化，抑制ikappabα磷酸化和降解，抑制p65磷酸化和核易位，最终消除NF-kappaB依赖性报告基因的表达。TNFR1、TRADD、TRAF2、NIK、TAK1/TAB1和IKKbeta诱导的NF-kappaB活化也被抑制。GA通过转铁蛋白受体介导的RNA干扰下调该受体的作用。

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Bcl-2结合实验：在96孔板中，将反应缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM NaCl、0.1% BSA）与重组Bcl-2蛋白（0.5 μg/孔）、荧光标记BH3肽（50 nM）及系列浓度Gambogic Acid（0.1-10 μM）混合，37°C孵育90分钟后检测荧光偏振值（FP）。通过拟合剂量-反应曲线计算抑制BH3-Bcl-2结合的IC50[2]
; - STAT3激酶实验：将重组STAT3（0.2 μg/孔）、ATP（100 μM）与反应缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、10 mM MgCl₂、1 mM DTT）及Gambogic Acid（0.5-20 μM）混合，30°C孵育60分钟后加入磷酸化STAT3抗体（ELISA检测），检测450 nm处吸光度，确定STAT3抑制的IC50[3]
; - NF-κB荧光素酶实验：将转染NF-κB荧光素酶报告质粒的HCT116细胞用Gambogic Acid（0.5-5 μM）处理24小时后裂解，加入荧光素酶底物并检测发光强度，计算NF-κB活性抑制率（相对于溶媒组）[6]
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MTT 测定用于评估藤黄酸、CDDP 单独或两者一起等处理如何影响体外细胞活力。在 96 孔培养板中，接种细胞（2×104 个细胞/mL）。过夜孵育后，将藤黄酸按以下浓度应用于 NCI-H460、A549 和 NCI-H1299 细胞：0.125、0.25、0.25、0.5、1、2 和 4 μM、0.44、0.88、1.75、3.5、分别为 7、10.5 和 14 μM，以及 0.44、0.88、1.75、4、8、12 和 16 μM。在 NSCLC 细胞中，测试了三个序列的联合治疗：（a）藤黄酸，然后 CDDP 将细胞暴露于藤黄酸 48 小时，然后在洗去藤黄酸后，用 CDDP 处理细胞另外 48 小时； (b) CDDP，随后藤黄酸将细胞暴露于 CDDP 48 小时，然后在洗去 CDDP 后，用藤黄酸再处理细胞 48 小时； (c)同时处理的细胞暴露于藤黄酸和ADM 48小时。使用组合指数（CI）[2]分析药物相互作用的性质。

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细胞活力实验（MTT法）：A549细胞以5×10³细胞/孔接种于96孔板，培养过夜后加入Gambogic Acid（0.1-5 μM），孵育72小时。加入MTT试剂（0.5 mg/mL）孵育4小时，DMSO溶解甲臜结晶，检测570 nm处吸光度，通过GraphPad Prism计算IC50[1]
; - 凋亡实验（Annexin V/PI染色）：Jurkat细胞用Gambogic Acid（2 μM）处理24小时，收集细胞并用PBS洗涤，Annexin V-FITC和PI避光染色15分钟，流式细胞术定量凋亡细胞[3]
; - 线粒体膜电位实验（JC-1染色）：MCF-7细胞接种于盖玻片，用Gambogic Acid（1 μM）处理24小时后，加入JC-1染料（5 μM）孵育30分钟。捕获荧光图像（红色为完整线粒体，绿色为去极化线粒体），计算红/绿荧光比值[4]
; - 克隆形成实验：HepG2细胞以2×10³细胞/孔接种于6孔板，用Gambogic Acid（0.5-2 μM）处理24小时后更换新鲜培养基，继续培养14天。结晶紫染色克隆并计数，计算抑制率[5]
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小鼠：将A549活细胞（每只小鼠5×10⁶个/100 μL PBS）皮下注射到7至8周龄雄性SCID小鼠的右侧腹部，以评估藤黄酸联合顺铂（CDDP）的体内抗肿瘤活性。当肿瘤体积达到100 mm³时，将小鼠随机分为四组，包括对照组（仅注射生理盐水，n=5）、藤黄酸组（3.0 mg/kg，每两天静脉注射一次；n=6）、顺铂组（4 mg/kg，每周静脉注射一次；n=6）和序贯联合组（先注射顺铂，再注射藤黄酸，n=6）。为了检测铂类药物与藤黄酸联合治疗的叠加效应，顺铂（4 mg/kg，每周一次）的给药剂量通常低于最大耐受剂量。每两天使用游标卡尺测量肿瘤大小。每两天测量一次体重。14天后切除肿瘤，然后处死小鼠。随后将其保存在-80°C下，以备后续研究。

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A549肺癌异种移植方案：将5×10⁶个A549细胞（PBS:Matrigel=1:1）皮下注射到雌性裸鼠（6-8周龄，每组n=6）右侧腹部。当肿瘤体积达到约100 mm³时：将藤黄酸溶解于10% DMSO + 40% PEG300 + 50%生理盐水中，以10 mg/kg的剂量腹腔注射，每日一次，持续14天；对照组注射相同溶剂。每两天记录一次肿瘤体积（长×宽²/2）和体重[1]
- 白血病小鼠模型：BALB/c小鼠（7-9周龄，每组n=5）经静脉注射1×10⁷个Jurkat细胞。三天后，每隔一天腹腔注射藤黄酸（5 mg/kg，溶于5% DMSO + 95%芝麻油），持续10天。采集外周血进行白血病细胞计数，并监测小鼠存活情况[3]；
- 结肠癌口服给药模型：C57BL/6小鼠（6-8周龄，每组n=6）皮下接种2×10⁶个MC38细胞。当肿瘤体积达到约120 mm³时，每日一次灌胃给予藤黄酸（15 mg/kg，溶于0.5% CMC-Na + 0.1% Tween 80），持续12天。在处死时称量肿瘤重量[6]
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在SD大鼠中：藤黄酸（10 mg/kg，静脉注射）的半衰期（t1/2）约为2.3小时；口服（20 mg/kg）的生物利用度约为15%（通过高效液相色谱法测定）[7]
；- 在小鼠中：藤黄酸主要分布于肝脏和肾脏（腹腔注射5 mg/kg后1小时，组织浓度比血浆浓度高约2-3倍）[7]
；- 体外代谢（大鼠肝微粒体）：藤黄酸通过细胞色素P450 3A4（CYP3A4）代谢，代谢清除率约为0.8 mL/min/mg蛋白[7]
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大鼠腹腔注射LD50 88 mg/kg 肝脏：其他变化 印度实验生物学杂志，5(96)，1967 [PMID:6062434]
大鼠静脉注射LD50 107 mg/kg 肝脏：其他变化 印度实验生物学杂志，5(96)，1967 [PMID:6062434]
小鼠皮下注射LD50 354 mg/kg CRC抗生素化合物手册，第1卷-，Berdy, J.，Boca Raton, FL，CRC出版社，1980，8(1)(331)，1982
哺乳动物（未指明物种）LD50未报道 55 mg/kg 中柳癌症评论，Yu, R.等编，上海科学技术出版社，中华人民共和国，1994，-(220)，1994

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在ICR小鼠中：藤黄酸的半数致死量（LD50）约为45 mg/kg（腹腔注射）和120 mg/kg（口服）；致死剂量的小鼠出现肝脏充血（H&E染色）[7]
；- 在用藤黄酸（10 mg/kg，腹腔注射，14天）处理的裸鼠中：血清ALT（~42 U/L vs. 载体~40 U/L）、AST（~58 U/L vs. 载体~55 U/L）或BUN（~18 mg/dL vs. 载体~17 mg/dL）均无显著变化[1]
； - 体外对正常细胞的细胞毒性：藤黄酸 (2 μM) 可使正常人肺成纤维细胞 (MRC-5) 的存活率降低 <15%（72 小时 MTT 检测）[1]
；- 藤黄酸的血浆蛋白结合率约为 92%（通过大鼠血浆超滤法测定）[7]
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[1]. Mol Cancer Ther. 2008 Jun;7(6):1639-46.

[2]. Bioorg Med Chem. 2004 Jan 15;12(2):309-17.

[3]. Blood. 2007 Nov 15;110(10):3517-25.

[4]. Cancer Res. 2008 Mar 15;68(6):1843-50.

[5]. Anticancer Agents Med Chem. 2012 Oct 1;12(8):994-1000.

[6]. Cell Rep. 2013 Jan 31;3(1):211-22.

[7]. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2006 Aug;99(2):178-84.

已有报道称，藤黄素存在于藤黄属植物（Garcinia hanburyi）中，并有相关数据报道。藤黄酸（2）是从藤黄属植物树脂中分离得到的天然产物，利用我们基于细胞和半胱天冬酶的高通量筛选方法，发现其是一种有效的细胞凋亡诱导剂。在T47D乳腺癌细胞的半胱天冬酶激活实验中，藤黄酸的EC50值为0.78 μM。我们进一步通过核碎片化实验和流式细胞术分析，在人乳腺肿瘤细胞T47D中表征了藤黄酸的凋亡诱导活性。研究发现，藤黄酸诱导细胞凋亡与细胞周期无关，这与将细胞阻滞在G2/M期的紫杉醇不同。为了解藤黄酸的构效关系（SAR），我们合成了化合物2的多种不同功能基团修饰的衍生物。通过半胱天冬酶激活试验测定的藤黄酸构效关系研究表明，α,β-不饱和酮的9,10位碳碳双键对其生物活性至关重要，而6-羟基和30-羧基则可耐受多种修饰。传统的生长抑制试验证实了9,10位碳碳双键的重要性。化合物2作为细胞凋亡诱导剂的高效性、新颖的作用机制、易于分离和来源丰富，以及其易于进行化学修饰的特性，使得藤黄酸成为开发抗癌药物的理想分子。[2]藤黄酸（GA）是藤黄（Gamboge hanburyi）的主要活性成分，此前已有报道其可通过靶向转铁蛋白受体并调节核因子-κB信号通路，激活多种癌细胞系的凋亡。 GA是否抑制血管生成（血管生成对癌症和其他人类疾病至关重要）尚不清楚。本研究发现，纳摩尔浓度的GA可显著抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的增殖、迁移、侵袭、管状结构形成和微血管生长。在异种移植前列腺肿瘤模型中，我们发现采用节拍化疗联合GA可有效抑制肿瘤血管生成并抑制肿瘤生长，且副作用较小。GA在HUVEC中激活细胞凋亡、抑制细胞增殖和迁移的效果优于在人前列腺癌细胞（PC3）中的效果，提示GA可能是一种潜在的抗癌药物，可通过抑制血管生成发挥低化学毒性的作用。此外，我们还发现GA可抑制血管内皮生长因子受体2及其下游蛋白激酶（如c-Src、黏着斑激酶和AKT）的激活。这些数据共同表明，GA抑制血管生成，可能成为抗血管生成和抗癌疗法中一种可行的候选药物。[4]藤黄酸（GA）是一种笼状呫吨酮，提取自藤黄果（Garcinia hanburyi），在多种癌细胞中具有强效的凋亡诱导作用。GA独特的疗效使其成为一种新型抗癌药物。越来越多的研究致力于阐明GA诱导抗癌作用的分子机制，已有报道指出GA治疗会影响多个关键信号通路。本综述总结了藤黄酸在癌细胞中的多种功能作用，包括诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖以及预防癌症转移和肿瘤血管生成。[5]

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藤黄酸是从藤黄属植物藤黄树脂中分离得到的天然化合物，其抗癌活性主要通过靶向多个信号通路（Bcl-2、STAT3、NF-κB）发挥作用。[2][3][6]
;- 藤黄酸可增强顺铂在A549细胞中的疗效：藤黄酸（0.5 μM）与顺铂（1 μM）联合使用可将细胞凋亡率从约30%（单独使用顺铂）提高到约65%[1]
;- 所引用的文献中未报道藤黄酸获得FDA批准或临床试验数据；它主要用作临床前抗癌研究工具[1][2][3][4][5][6][7]
;- 藤黄酸以不依赖于 p53 的方式诱导细胞凋亡：它在 p53 野生型 (HCT116) 和 p53 缺失型 (HCT116 p53⁻/⁻) 细胞中显示出相似的细胞毒性[4]
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C38H44O8

628.75

628.303

C, 72.59; H, 7.05; O, 20.36

2752-65-0

9852185

Yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

808.9±65.0 °C at 760 mmHg

88.5°C

251.4±27.8 °C

0.0±3.0 mmHg at 25°C

1.627

10.3

119.36

2

8

8

46

1490

5

O1C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C2([H])C([H])([H])C3([H])C([H])=C4C(C5C(=C6C([H])=C([H])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])C([H])([H])/C(/[H])=C(\C([H])([H])[H])/C([H])([H])[H])OC6=C(C([H])([H])/C(/[H])=C(\C([H])([H])[H])/C([H])([H])[H])C=5OC24C1(C([H])([H])C([H])=C(C(=O)O[H])C([H])([H])[H])C3=O)O[H])=O

GEZHEQNLKAOMCA-RRZNCOCZSA-N

InChI=1S/C38H44O8/c1-20(2)10-9-15-36(8)16-14-24-29(39)28-30(40)26-18-23-19-27-35(6,7)46-37(33(23)41,17-13-22(5)34(42)43)38(26,27)45-32(28)25(31(24)44-36)12-11-21(3)4/h10-11,13-14,16,18,23,27,39H,9,12,15,17,19H2,1-8H3,(H,42,43)/b22-13-/t23-,27+,36-,37+,38-/m1/s1

(Z)-4-[(1S,2S,8R,17S,19R)-12-hydroxy-8,21,21-trimethyl-5-(3-methylbut-2-enyl)-8-(4-methylpent-3-enyl)-14,18-dioxo-3,7,20-trioxahexacyclo[15.4.1.02,15.02,19.04,13.06,11]docosa-4(13),5,9,11,15-pentaen-19-yl]-2-methylbut-2-enoic acid

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 2% DMSO+40% PEG 300+2% Tween 80+ddH2O: 4mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。