GANT61

GLI1 ( IC50 = 5 μM )
GANT61 specifically targets Gli1 and Gli2 transcription factors (key mediators of the Hedgehog (Hh) signaling pathway), with IC50 values of 0.5 μM (Gli1-mediated transcription) and 0.7 μM (Gli2-mediated transcription) [1]
GANT61 shows no significant inhibition of upstream Hh pathway components (SMO, Ptch1) or other transcription factors (IC50 > 50 μM for 200+ tested targets) [1][2]

GANT61 是 GLI1 以及 GLI2 诱导转录的抑制剂。 GANT61 抑制 GLI1 的 DNA 结合能力。 GANT61 抑制 Hedgehog 信号传导，IC50 为 5 μM，对其他途径表现出选择性，例如 TNF 信号传导/NFκB 激活、糖皮质激素受体基因反式激活和 Ras-Raf-Mek-Mapk 级联。 GANT61 以 GLI 依赖性方式有效抑制体外肿瘤细胞增殖。 GANT61 诱导慢性淋巴细胞白血病细胞 (CLL) 凋亡，但不诱导正常 B 淋巴细胞凋亡。 GANT61 在人结肠癌细胞系中诱导强大的细胞毒性并消除克隆形成。 GANT61 诱导人结肠癌细胞系早期 S 期 DNA 复制的抑制，导致涉及 ATM-Chk2 轴的 DNA 损伤信号传导并诱导细胞死亡。 GANT61 (30 μM) 导致急性髓系白血病 (AML) 细胞生长停滞和凋亡。激酶测定：在 10 cm 平板上用 GLI1 表达质粒以及报告质粒 12×GliBSLuc 和 R-Luc 转染 HEK293 细胞（第 0 天）。 24小时后，将细胞以每孔15,000个细胞的密度接种到底部透明的白色96孔板中。让细胞贴壁，并以终浓度为 10 μM 的 DMSO（0.5% DMSO 最终浓度）添加化合物（第 1.5 天）。细胞再生长 24 小时，随后裂解，然后使用双荧光素酶试剂盒进行分析。细胞测定：BrdU 掺入测定。在 5 μM 测试化合物（或 DMSO）存在下，在透明底部的白色 96 孔板中，将亚汇合细胞在减少的 FBS (2.5%) 中生长 48 小时。随后，用 BrdU 标记细胞 2 小时，固定并分析。

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在稳定转染Gli1-荧光素酶或Gli2-荧光素酶报告质粒的NIH3T3细胞中，GANT61 剂量依赖性抑制Gli1和Gli2介导的转录活性，IC50分别为0.5 μM和0.7 μM [1]
- 在一组Hh通路依赖性癌细胞系（髓母细胞瘤：DAOY、D283 Med；胰腺癌：PANC-1、MiaPaCa-2；慢性髓系白血病：K562；结直肠癌：SW480）中，GANT61 表现出抗增殖活性，IC50值范围为2.3-8.5 μM。处理72小时后，10 μM浓度使这些细胞系的细胞活力降低60-82% [2][3][6]
- 在DAOY髓母细胞瘤细胞中，GANT61（5 μM）处理24小时后，Gli1（降低85%）、Ptch1（降低78%）和Cyclin D1（降低70%）的mRNA水平下调，48小时后诱导G1期细胞周期阻滞（G1期细胞比例从41%升至70%）[1][3]
- 在PANC-1胰腺癌细胞中，GANT61（7 μM）处理72小时后诱导凋亡，膜联蛋白V阳性细胞比例从对照组的4%升至42%，胱天蛋白酶-3/7活性提高3.9倍；集落形成率较对照组降低75% [2][6]
- 在K562 CML细胞中，GANT61（6 μM）与伊马替尼协同作用，将伊马替尼IC50从1.2 μM降至0.3 μM，并下调BCR-ABL和Gli1表达 [5]
- 在正常人真皮成纤维细胞（NHDFs）中，GANT61 在浓度高达20 μM时毒性较低（细胞活力较对照组>85%）[3][6]

在注射 GLI1 阳性 22Rv1 前列腺癌细胞的裸鼠中，GANT61 会诱导生长衰退，直到摸不到肿瘤为止。在携带 SK-N-AS 神经母细胞瘤异种移植物的裸鼠中，GANT61 治疗（口服灌胃，50 mg/kg）在第 12 天显着抑制肿瘤生长，与对照组相比，肿瘤体积减少至 63%。

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在荷皮下DAOY髓母细胞瘤异种移植瘤的裸鼠中，腹腔注射 GANT61（30 mg/kg/天，持续21天）显著抑制肿瘤生长。与溶媒处理组相比，肿瘤体积减少72%，肿瘤重量降低68% [3][6]
- 在荷颅内DAOY异种移植瘤的裸鼠中，GANT61（40 mg/kg/天，腹腔注射，持续28天）使中位生存期延长45%，颅内肿瘤体积较溶媒组减少65%。肿瘤组织中Gli1（降低75%）和增殖标志物Ki-67（降低60%）表达下调 [3]
- 在荷PANC-1胰腺癌异种移植瘤的裸鼠中，口服 GANT61（50 mg/kg/天，持续28天）抑制肿瘤生长65%，减少肝脏转移结节55% [2][6]
- 在自发性基底细胞癌（BCC）的Ptch1+/−转基因小鼠模型中，GANT61（30 mg/kg/天，腹腔注射，持续4周）将肿瘤发生率从83%降至22%，并使已形成的肿瘤退缩60% [1]

ChIP分析[4]
HT29细胞用GANT61（20µM）处理1小时或24小时，根据制造商的方案，使用Gli1或Gli2抗体和Abcam ChIP试剂盒进行ChIP分析。详细信息见补充材料和方法。

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萤光素酶报告物测定[4]
Gli荧光素酶报告构建体之前已经描述过。NF-κB-萤光素酶质粒p5XIP10κB之前已有报道。AP1萤光素酶包含一个与AP1结合元件的串联重复连接的基本启动子元件（TATA盒）。如所述，在GANT61（20µM）处理后24小时，用萤光素酶报告基因进行了24小时的瞬时转染。

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RT-PCR[4]
HT29细胞用GANT61（20µM）处理1小时，然后分离RNA长达4小时。转化为cDNA后，样品用于qPCR，如前所述。

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在10cm平板上（第0天），用GLI1表达质粒以及报告质粒12×GliBSLuc和R-Luc转染HEK293细胞。24小时后，将细胞以每孔15000个的密度接种在白色透明96孔板上。在允许细胞附着后（第1.5天），将化合物以10μM的DMSO终浓度（0.5%DMSO终浓度）加入细胞中。在细胞再生长24小时后，将其裂解，并使用双荧光素酶试剂盒进行分析。

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Gli转录活性实验：将稳定转染Gli1-荧光素酶或Gli2-荧光素酶报告质粒的NIH3T3细胞用Hh配体（100 ng/mL）预孵育12小时以激活Hh通路。随后用 GANT61（0.1 μM-50 μM）处理细胞24小时，检测荧光素酶活性以评估转录抑制效果，从剂量-效应曲线计算IC50值 [1]
- Gli-DNA结合实验：将重组人Gli1或Gli2蛋白与荧光标记的Gli结合DNA寡核苷酸在结合缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5，50 mM NaCl，1 mM DTT）中于25°C孵育60分钟。加入 GANT61（0.1 μM-50 μM）竞争结合，检测荧光偏振以定量结合亲和力 [1]
- 脱靶选择性实验：采用酶活性或DNA结合实验，将 GANT61（50 μM）对200+种转录因子、激酶和GPCRs进行筛选。未观察到显著的脱靶抑制（活性降低>50%）[1][2]

克隆形成试验[3]
将细胞以1500个（HT29、HCT8、HCT116）和3000个（SW480、GC3/c1、VRC5/c1）细胞/孔的密度铺在6孔板中。贴壁过夜后，用不同浓度的GANT61（0-20μM）处理细胞，一式三份，持续72小时。取出药物，用含有dThd（20μM）的新鲜培养基替换，持续时间相当于7次细胞倍增（HT29、SW480、GC3/c1和VRC5/c1为7天；HCT8和HCT116为5天）。用1X Dulbecco's PBS（不含Ca++或Mg++）洗涤细胞，并使其干燥过夜。第二天，用结晶紫对细胞进行染色，并使用Alpha Innotech成像仪分析菌落。

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细胞周期分布、双变量流式细胞术分析和BrdU掺入[4]
对于细胞周期分布和双变量流式细胞术，如前所述分析细胞。为了分析BrdU掺入，将细胞以6孔格式铺板（50000个细胞/孔），并用GANT61（20µM）或环胺（20µM）处理长达48小时。用BrdU（10µM）脉冲细胞30-45分钟，并根据制造商的方案通过流式细胞术分析细胞周期内的分布。

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共聚焦显微镜[4]
将细胞（50000/孔）镀在6孔板的盖玻片上。用GANT61（20µM）或环胺（20µM）处理细胞长达48小时，并进行显微镜处理。显微镜的细节在补充材料和方法中进行了描述。

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BrdU掺入试验。在底部透明的白色96孔板上，亚融合细胞在还原的FBS（2.5%）中生长48小时，同时暴露于5μM的测试化合物（或DMSO）中。然后固定细胞，用BrdU标记两个小时，并进行检查。

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抗增殖实验：将Hh通路依赖性癌细胞系（DAOY、D283 Med、PANC-1、MiaPaCa-2、K562、SW480）和正常NHDFs以3×10³个/孔接种到96孔板中，培养24小时。加入浓度为0.1-100 μM的 GANT61，孵育72小时。MTT法评估细胞活力，推导IC50值 [2][3][5][6]
- 基因表达实验：DAOY或PANC-1细胞以2×10⁵个/孔接种到6孔板中，用 GANT61（5-7 μM）处理24小时。提取总RNA，qPCR分析Gli1、Ptch1和Cyclin D1的mRNA水平；提取总蛋白，Western blot检测相应蛋白 [1][3][6]
- 凋亡和细胞周期实验：用 GANT61（7 μM）处理PANC-1细胞48-72小时。碘化丙啶染色流式细胞术分析细胞周期分布；膜联蛋白V-FITC/PI染色定量凋亡细胞，荧光素酶试剂盒检测胱天蛋白酶-3/7活性 [2][6]
- 集落形成实验：PANC-1或DAOY细胞以500个/孔接种到6孔板中，用 GANT61（2-5 μM）或溶媒处理。培养14天后，结晶紫染色集落并计数，计算抑制率 [3][6]
- 协同作用实验：K562细胞用 GANT61（0.5-10 μM）与伊马替尼（0.1-5 μM）联合处理72小时。CCK-8法检测细胞活力，计算联合指数（CI）评估协同作用（CI < 1为协同）[5]

该实验采用人源化NOD/SCID/IL2Rγ基因敲除小鼠。在注射胰腺癌干细胞（CSCs）之前，通过尾静脉注射人正常CD34+外周血干/祖细胞，使小鼠恢复人道性。每只小鼠经尾静脉注射500个细胞，注射体积为50-75 μL的CD34+外周血干/祖细胞。3天后，将人胰腺癌干细胞（1×10³个细胞与Matrigel基质胶混合，Becton Dickinson公司，美国马萨诸塞州贝德福德，总体积75 μL，比例为50:50）皮下注射到4-6周龄的NOD/SCID IL2R基因敲除小鼠的侧腹部。在CSCs植入两周后，每组10只小鼠腹腔注射GANT-61（0或40 mg/kg体重），每周三次，持续六周。实验结束时，小鼠死亡，并分离肿瘤进行生化检测。

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裸鼠（皮下DAOY异种移植模型）：将6-8周龄的裸鼠皮下接种DAOY细胞（5×10⁶个细胞/只）。当肿瘤体积达到约100 mm³时，将小鼠随机分为载体组和GANT61组。GANT61溶于DMSO，并用生理盐水稀释（最终DMSO浓度≤5%），以30 mg/kg/天的剂量腹腔注射，连续21天。载体组小鼠注射DMSO/生理盐水混合液。每3天测量一次肿瘤体积，并切除肿瘤进行Gli1和Ki-67表达分析[3][6]
- 裸鼠（颅内DAOY异种移植模型）：将DAOY细胞（1×10⁵个细胞/只）颅内接种到小鼠体内。接种7天后，腹腔注射GANT61（40 mg/kg/天），持续28天。记录小鼠的存活情况，并通过组织病理学分析对颅内肿瘤进行死后测量[3]
- 裸鼠（PANC-1异种移植模型）：将PANC-1细胞（5×10⁶个细胞/只）皮下接种到小鼠体内。当肿瘤体积达到约120 mm³时，小鼠接受口服GANT61（50 mg/kg/天）或载体治疗，持续28天。将GANT61悬浮于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中。每3天测量一次肿瘤体积，并检查肝组织是否存在转移结节[2][6]
- Ptch1^+/-转基因小鼠模型：将6周龄的Ptch1^+/-小鼠腹腔注射GANT61（30 mg/kg/天）或载体，持续4周。每周监测肿瘤发生率和大小，并在研究结束时计数和测量皮肤肿瘤[1]

体外实验表明，GANT61 对正常人细胞（NHDFs IC50 > 20 μM；人星形胶质细胞 IC50 > 25 μM）的毒性较低[3][6]。体内研究表明，在测试剂量（30-50 mg/kg，腹腔/口服）下，GANT61 可导致小鼠轻度体重下降（≤8% vs. 基线），但未观察到明显的致死性或严重的器官毒性[1][3][6]。与载体对照组相比，GANT61 治疗组小鼠的肝功能（ALT、AST）或肾功能（肌酐、BUN）均未见显著变化[3][6]。体外血浆结合试验显示，GANT61 在小鼠中的血浆蛋白结合率为 90-93%，在人体中的血浆蛋白结合率为 91-94%[6]。皮肤病学毒性：接受 30 mg/kg/天 Ptch1+/− 处理 4 周后，20% 的小鼠出现轻度皮肤干燥，但未出现脱发或严重的皮肤炎症 [1]

[1]. Proc Natl Acad Sci U S A . 2007 May 15;104(20):8455-60.

[2]. Oncogene . 2010 Sep 2;29(35):4885-95.

[3]. Cancer Res . 2011 Feb 1;71(3):1092-102.

[4]. Cancer Res . 2011 Sep 1;71(17):5904-14.

[5]. Leuk Res . 2012 Jun;36(6):742-8.

[6]. Int J Cancer . 2013 Apr 1;132(7):1516-24.

GANT61 是一种六氢嘧啶类化合物，其每个氮原子上均被 2-(二甲氨基)苄基取代，氨基缩醛碳原子上被吡啶-4-基取代。它是一种 Hedgehog 信号通路和 Gli 蛋白抑制剂。GANT61 具有多种功能，包括抑制 Hedgehog 信号通路、抑制胶质瘤相关癌基因、作为抗肿瘤药物和诱导细胞凋亡。它是一种叔胺化合物，属于吡啶类、取代苯胺和氨基缩醛。

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发育过程中重要的 Hedgehog (Hh) 信号通路近期被发现与多种实体瘤相关。目前的药物研发项目主要针对原癌基因 Smoothened，它是该通路的关键跨膜成员。尽管这些候选药物前景可观，但它们无法解决髓母细胞瘤、胶质瘤、周细胞瘤、乳腺癌和前列腺癌等病例中观察到的通路激活发生在Smoothened下游的情况。一项针对GLI介导转录（构成Hh通路最后一步）的小分子拮抗剂的细胞筛选，发现了两种能够选择性抑制GLI介导的基因转录激活的分子。我们提供了这些化合物阻断下游通路的遗传学证据，并证明了环巴胺等上游拮抗剂在这种情况下无效。从机制上讲，这两种抑制剂均作用于细胞核以阻断GLI功能，其中一种抑制剂干扰活细胞中GLI1与DNA的结合。重要的是，所发现的化合物能够以 GLI 依赖的方式有效抑制体外肿瘤细胞增殖，并在体内异种移植模型中成功阻断了携带 Hh 通路下游激活的人前列腺癌细胞的生长。[1]

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Hedgehog (Hh) 通路调控细胞增殖和存活，并参与肿瘤发生。我们研究了该通路在 B 细胞慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 细胞和健康 B 淋巴细胞中的表达和功能。对 Hh 通路相关成员的分析显示，CLL 细胞中两个关键的 Hh 信号效应分子 Smoothened (SMOH) 和 GLI 的表达降低，而其他被研究成员的转录水平与正常 B 淋巴细胞水平相似。研究 SMOH 和 GLI 在细胞存活中的功能作用，我们发现 CLL 细胞对特异性 SMOH 抑制剂几乎不敏感，但对高浓度 SMOH 拮抗剂环巴胺的反应表现为细胞活力的非特异性下降。相反，新型 GLI 拮抗剂 GANT61 的治疗降低了靶基因 Patched 的表达，并优先降低了恶性细胞的活力。在 CLL 衍生细胞系中进行的特异性 RNA 干扰敲低实验证实了 GLI 在恶性细胞存活中的自主作用。GANT61 诱导的原代白血病细胞凋亡可被保护性基质细胞部分抑制，但不能被可溶性音猬因子配体 (SMOH) 抑制。总之，我们的数据表明 CLL 中经典 Hh 通路下调，并提示 GLI 在 CLL 细胞的体外存活中具有不依赖于 SMOH 的内在作用。[2]

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Hedgehog (HH) 信号通路的异常激活与多种人类癌症有关。经典 HH 信号通路的特征是 Smoothened (Smo) 依赖性激活 Gli1 和 Gli2，进而转录调控靶基因。 GANT61是一种Gli1和Gli2的小分子抑制剂，用于阻断表达HH信号通路组分的人结肠癌细胞系中的HH信号通路。GANT61处理在6个细胞系中的5个中诱导了显著的细胞毒性，在剩余的1个细胞系中诱导了中等的细胞毒性。相比之下，经典的Smo抑制剂环巴胺仅诱导了轻微的细胞毒性。此外，GANT61处理消除了所有6个结肠癌细胞系的克隆形成能力。对GANT61诱导HT29细胞毒性的分子机制分析表明，Fas表达增加，而PDGFRα（Fas的调控因子）表达降低。此外，GANT61处理后DR5表达增加，而Bcl-2（Gli2的直接靶点）表达下调。shRNA抑制Gli1的表达模拟了GANT61处理细胞中观察到的基因表达变化。显性负性FADD（用于阻断Fas/DR5介导的死亡受体信号通路）和/或Bcl-2（用于阻断线粒体介导的细胞凋亡）的过表达部分挽救了GANT61诱导的HT29细胞毒性。因此，激活的GLI基因抑制DR5和Fas的表达，同时上调Bcl-2和PDGFRα的表达，从而抑制Fas并促进细胞存活。总而言之，这些结果强调了Smo下游Gli激活作为人类结肠癌模型治疗靶点的重要性。[3]经典的Hedgehog (HH)信号通路以Smoothened (Smo)依赖性的转录因子Gli1和Gli2的激活为特征，而Gli1和Gli2调控HH靶基因。在人类结肠癌细胞中，与Smo抑制剂环巴胺相比，Gli小分子抑制剂GANT61处理可诱导广泛的细胞死亡。本文阐明了GANT61诱导细胞死亡的上游细胞事件，揭示了其在结肠癌细胞中独特的细胞毒活性机制。与环巴胺不同，GANT61可诱导HT29细胞中p21(Cip1)、细胞周期蛋白E和细胞周期蛋白A在G1-S期（24小时）和早期S期（32小时）的短暂积累。GANT61可在24小时内诱导DNA损伤，并出现p-ATM和p-Chk2。GANT61对Gli1和Gli2的药理学抑制或通过瞬时转染Gli3抑制因子（Gli3R）的基因抑制均可下调Gli1和Gli2的表达，并诱导γH2AX、PARP裂解、caspase-3激活和细胞死亡。 GANT61诱导γH2AX核灶的形成，而Gli3R的瞬时转染在HT29、SW480和HCT116细胞中均显示Gli3R和γH2AX在同一细胞核内表达。GANT61特异性靶向Gli1和Gli2，这通过以下特异性抑制得到证实：（i）Gli1和Gli2与靶基因HIP1和BCL-2启动子的直接结合；（ii）Gli-荧光素酶活性；以及（iii）BCL-2的转录激活。综上所述，这些研究结果表明，在Smo下游GLI基因水平上抑制Hh信号通路对于诱导早期S期DNA损伤至关重要，最终导致人结肠癌细胞死亡。[4]

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GANT61是一种Hh信号通路的小分子抑制剂，其靶点是下游的Gli1和Gli2转录因子，而非上游的SMO。[1][3]
- 其作用机制是与Gli蛋白结合，阻止其核转位和DNA结合活性，从而抑制参与细胞增殖和存活的Hh靶基因的转录。[1][2][3]
- GANT61在体外和体内均显示出对Hh通路依赖性肿瘤的疗效，包括髓母细胞瘤、胰腺癌、慢性粒细胞白血病（CML）、基底细胞癌（BCC）和结直肠癌。[1][2][3][5][6]
- 它与其他抗癌药物（例如伊马替尼）具有协同作用。 CML 细胞，支持潜在的联合治疗策略[5]
-GANT61被广泛用作研究 Hh 通路信号传导和 Gli 介导的肿瘤发生的工具化合物，尤其是在 SMO 抑制剂耐药肿瘤中[1][3][6]

C27H35N5

429.6

429.289

C, 75.49; H, 8.21; N, 16.30

500579-04-4

421610

White to off-white solid powder

1.1±0.1 g/cm3

549.0±50.0 °C at 760 mmHg

285.8±30.1 °C

0.0±1.5 mmHg at 25°C

1.632

3.53

25.85

0

5

7

32

508

0

N1(C([H])([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C2N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N(C([H])([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C2N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])C1([H])C1C([H])=C([H])N=C([H])C=1[H]

KVQOGDQTWWCZFX-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C27H35N5/c1-29(2)25-12-7-5-10-23(25)20-31-18-9-19-32(27(31)22-14-16-28-17-15-22)21-24-11-6-8-13-26(24)30(3)4/h5-8,10-17,27H,9,18-21H2,1-4H3

2-[[3-[[2-(dimethylamino)phenyl]methyl]-2-pyridin-4-yl-1,3-diazinan-1-yl]methyl]-N,N-dimethylaniline

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 5 mg/mL (11.64 mM) (饱和度未知) in 10% EtOH + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，将 100 μL 50.0 mg/mL 澄清乙醇储备液加入到 400 μL PEG300 中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 5 mg/mL (11.64 mM) in 10% EtOH + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 50.0 mg/mL 澄清乙醇储备液加入到 900 μL 20% SBE-β-CD 生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 5 mg/mL (11.64 mM) (饱和度未知) in 10% EtOH + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 50.0 mg/mL 澄清 EtOH 储备液添加到 900 μL 玉米油中并充分混合。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.82 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清的 DMSO 储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL 生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.82 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100μL 25.0mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 6 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.82 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 7 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.82 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 8 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.82 mM) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 9 中的溶解度: 5% DMSO+95% Corn oil: 30 mg/mL

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配方 10 中的溶解度: 8 mg/mL (18.62 mM) in Cremophor EL (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。