Ginkgolide A (BN-52020)   中文名称: 银杏内酯A

Endogenous Metabolite; gama-aminobutyric acid (GABA)

从银杏树的叶子中提取了一种极其有效的 PAF 拮抗剂笼分子，称为银杏内酯 A (BN-52020)。在广泛的免疫和炎症性疾病中显示出前景。银杏内酯 A (BN-52020) 不会减少用星形孢素处理或缺乏血清的神经元的细胞凋亡损伤[2]。

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GA/银杏内酯A对软骨细胞活力的影响 为了评估不同浓度的银杏内酯A/Ginkgolide A/GA和不同孵育时间对软骨细胞存活率的影响，我们采用了CCK-8测定法。孵育24小时后，GA浓度低于50μmol对软骨细胞的细胞毒性最小（图2B）。此外，在50μmol浓度下，GA对培养24小时的软骨细胞存活率的影响可以忽略不计（图2C）。为了模拟软骨细胞中的氧化应激，使用了30μmol的TBHP[25]，并在不同GA浓度下于12、24和48小时评估了软骨细胞的存活率（图2D）。结果表明，50μmol的GA在24小时内提供了最佳的保护效果。

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A抑制ERS、软骨细胞凋亡和ECM降解[4]
在GO功能富集结果的基础上，进一步评估了GA/银杏内酯A保护软骨细胞的机制。甲苯胺蓝染色用于评估ECM水平。TBHP治疗显著减少了软骨细胞中的甲苯胺蓝染色，这一作用被GA抵消，导致更强烈的紫色染色（图2E）。在II型胶原免疫荧光染色中也观察到类似的结果，其中GA逆转了TBHP诱导的II型胶原抑制（图2F，G）。免疫印迹显示，GA显著减轻了TBHP诱导的ECM降解，如MMP13和ADAMTS5表达降低和II型胶原表达增加所示（图3A-D）。这些发现表明，GA对ECM具有保护作用。随后，使用DCFH-DA荧光探针测量了ROS水平，表明GA显著降低了TBHP升高的ROS水平（图3E，F）。TUNEL染色证实，TBHP增加了软骨细胞凋亡，而GA预处理提供了实质性的保护（图3G，H）。蛋白质分析显示，TBHP处理提高了裂解半胱天冬酶3和BAX的表达，同时降低了BCL-2水平（图3I-L）。Western印迹表明，随着GA浓度的增加，ERS相关蛋白，包括p-PERK、GRP78、ATF4、p-eIF2α和CHOP，显著降低（图3M-R）。这些发现证实，GA抑制氧化应激诱导的ERS、软骨细胞凋亡和ECM降解。

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GA/银杏内酯A抑制ERS，减少软骨细胞凋亡和ECM降解[4]
基于早期发现银杏内酯A/GA保护软骨细胞，我们研究了这是否涉及ERS缓解。为了验证这一假设，使用thapsigargin（TG）特异性诱导ERS。流式细胞术用于评估TG治疗后的凋亡水平，显示与GA+TBHP组相比，晚期凋亡（Annexin V-FITC+/PI+）显著增加（图4A，B）。免疫印迹显示，与GA+TBHP组相比，TG治疗降低了II型胶原水平，同时增加了CHOP、GRP78和裂解型半胱氨酸蛋白酶-3水平（图4C-G）。同样，ERS相关蛋白GRP78的免疫荧光染色表明，TG增强了ERS活性（图4H，I）。这些结果表明，TG抵消了GA对软骨细胞的保护作用。我们的数据表明，GA抑制氧化应激诱导的ERS，从而减少软骨细胞凋亡和ECM降解。

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GA/银杏内酯A上调FoxO1表达[4]
为了进一步探索银杏内酯A/Ginkgolide A/GA调节ERS的上游途径，基于GA和OA之间的共同靶点进行了KEGG途径富集分析。结果表明，FoxO通路的激活可能是GA缓解氧化应激的关键因素（图5C）。分子对接用于分析GA和FoxO1之间的相互作用。半柔性对接显示出显著的结合活性，结合能分布主要低于-5千卡/摩尔（图5A）。PyMOL分析确定了GA与FoxO1的Leu239和Lys179残基形成氢键的最佳分子构象，表明这些残基是底物结合和催化活性的关键（图5B）。分子对接表明GA和FoxO1之间有很强的结合能。假设GA上调FoxO1表达。Western blot和免疫荧光分析证实，TBHP治疗抑制了软骨细胞中FoxO1的表达，而GA以剂量依赖的方式显著增强了FoxO1的表现（图5D-F）。免疫荧光进一步证实，GA增加了TBHP处理的软骨细胞中FoxO1的表达，降低了ERS蛋白CHOP（图5G，H）。根据我们的结果，发现GA上调FoxO1的表达。

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GA/银杏内酯A通过上调FoxO1抑制ERS，从而减少软骨细胞凋亡和ECM降解[4]
为了研究FoxO1沉默是否可以逆转银杏内酯A/Ginkgolide A/GA的抗凋亡和抗ECM降解作用，进行了Western印迹。沉默FoxO1可以逆转GA对FoxO1的上调（图6A-C）。免疫荧光证实，在TBHP处理的软骨细胞中，FoxO1沉默否定了GA介导的FoxO1上调和CHOP下调（图6D-F）。此外，在GA处理的软骨细胞中，FoxO1沉默显著增加了ERS相关蛋白，包括p-PERK、GRP78、ATF4、p-eIF2α和CHOP（图6G-L）。此外，沉默FoxO1消除了GA的抗凋亡和抗ECM降解作用。Western blot分析表明，GA处理降低了MMP13、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、ADAMTS5和BAX的表达，而FoxO1沉默增加了这些标记物（图6M，O，P，S）。GA诱导的TBHP处理的软骨细胞中II型胶原和BCL-2的上调被FoxO1沉默逆转（图6N，R）。这些发现证实，GA通过增强FoxO1表达和抑制ERS来调节软骨细胞凋亡和ECM降解。

在镇静小鼠中，银杏内酯 A 显着减少了它们的睡眠时间[1]。

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本研究旨在探讨银杏内酯A/Ginkgolide A（GA）是否可以改善小鼠的TBI，以及它是否可以通过减少氧化应激来缓解TBI小鼠脑中的细胞凋亡。小鼠接受TBI和GA给药7天。监测神经功能缺损，检查脑组织的分子病理标志物。与假手术组相比，TBI小鼠的神经行为缺陷更严重，可以通过服用GA来改善。GA的服用提高了TBI小鼠改良神经严重程度量表（mNSS）评分、网格行走试验和Rotarod试验。TBI小鼠的细胞凋亡增加，GA治疗后细胞凋亡减少。TBI小鼠脑内氧化应激的生物标志物8-OHdG和丙二醛（MDA）增加，而SOD降低。GA给药后，这些变化被逆转。这些结果表明，GA可以提高TBI小鼠的神经行为缺陷。GA治疗可以通过减少氧化应激来减轻TBI小鼠的细胞凋亡。[3]

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本研究旨在探讨银杏内酯A/Ginkgolide A（GA）在氧化应激下对软骨细胞的影响，并阐明其潜在的分子机制。我们使用小鼠内侧半月板（DMM）模型的失稳和软骨细胞中叔丁基过氧化氢（TBHP）诱导的体外骨关节炎（OA）模型，验证了GA的治疗效果和潜在机制。通过网络药理学、基因本体论（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，确定了GA的潜在OA靶点。使用蛋白质印迹、免疫荧光、TUNEL染色、流式细胞术、X射线、微计算机断层扫描（micro-CT）分析和组织学染色，对内质网应激（ERS）、细胞凋亡、细胞外基质（ECM）降解和叉头盒O1（FoxO1）相关途径的影响进行了进一步探索。结果表明，GA上调FoxO1表达并抑制ERS相关信号通路，从而减少细胞凋亡和ECM降解。总之，GA在体外和体内均显著缓解了OA症状，表明其作为OA治疗剂的潜力[4]。

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GA/银杏内酯A在体内激活FoxO1，改善DMM手术后的OA进展[4]
体内研究调查了GA/银杏内酯A对OA的治疗作用，对DMM小鼠模型进行了不同浓度的腹腔注射。通过各组关键器官的HE染色证实GA的药物安全性（图S1A）。X射线分析、显微CT分析、HE、SO和甲苯胺蓝染色评估了关节软骨的组织病理学变化。X射线显示，与假手术对照组相比，DMM组的软骨硬化和关节间隙狭窄明显，而GA治疗显示OA进展的部分改善（图7A）。使用Micro-CT的进一步分析显示，DMM组软骨下骨的骨体积与组织体积（BV/TV）比值显著增加。然而，GA治疗导致BV/TV比值显著降低，呈浓度依赖性（图7B，D）。HE、SO和甲苯胺蓝染色的软骨切片显示，DMM组存在明显的软骨损伤和广泛的蛋白多糖损失，GA治疗缓解了这一现象（图7C）。使用OARSI和滑膜评分系统评估每个实验组OA的严重程度，这两个系统都是由两名研究人员在盲法条件下独立评估的，DMM组得分最高，GA治疗组OA症状呈剂量依赖性逆转（图7E，F）。所有小鼠组织样本的免疫组织化学分析表明，OA组中FoxO1和胶原蛋白II的表达降低，CHOP和切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达增加（图7G-K）。值得注意的是，GA应用程序有效地逆转了这些变化。总的来说，GA在DMM小鼠模型中显示出缓解OA进展的显著疗效。

细胞活力测定[4]
我们利用CCK-8试验来评估小鼠软骨细胞的存活率。按照既定方案，在96孔板中每孔接种约8000个细胞。孵育24小时后，应用药物处理（如银杏内酯A/Ginkgolide A）以确定最佳浓度和孵育时间。最终使用微孔板读数器通过450nm的光密度测量细胞存活率。

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GA/银杏内酯A靶标和假设OA相关蛋白的鉴定[4]
在我们的研究中，我们使用了PharmMapper数据库(https://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)鉴定银杏内酯A/Ginkgolide A/GA的潜在蛋白质靶点，特别关注人类蛋白质靶点。同时，我们从GeneCards数据库中收集了与OA相关的靶基因信息(https://www.genecards.org/).交叉靶标的蛋白质相互作用（PPI）网络是使用Cytoscape（3.10.0版）构建的。

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分子对接[4]
在这项研究中，为了探索GA/银杏内酯A与FoxO1蛋白之间的分子相互作用，我们从RCSB PDB数据库中获得了FoxO1（PDB ID:5DUI）的晶体结构(https://www.rcsb.org/).我们使用AutoDock软件（4.2版）进行了200次半柔性对接实验，以获得最佳分子结合位点的结合能分布和示意图。在最佳构象下，银杏内酯a/Ginkgolide A/GA与FoxO1的Leu239和Lys179残基形成氢键。

TBI小鼠模型及GA/银杏内酯A治疗[3]
采用可控皮层冲击装置诱导TBI。用异氟烷（1.5–2.5%）麻醉小鼠。牵开头皮和筋膜暴露硬脑膜后，在右侧大脑半球（距前囟后2.0 mm，距矢状缝外侧2.0 mm）钻一个直径5 mm的孔。使用3 mm扁平冲击头冲击暴露的硬脑膜（冲击参数：速度：3.0 m/s，深度：2 mm，停留时间：100 ms）。术后缝合头皮切口，并将小鼠置于加热垫上直至麻醉恢复。假手术组小鼠接受所有相同操作，但不进行任何冲击。同时，腹腔注射银杏内酯A/GA，每日一次，连续7天（5 mg/kg），以生理盐水为载体。病灶体积的评估参照既往报道。

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超氧化物歧化酶（SOD）活性水平[3]
GA/银杏内酯A给药7天后，在深度麻醉下处死小鼠。迅速将脑组织从冰盘中取出，选取受损脑组织。使用酶标仪，按照制造商说明书测定超氧化物歧化酶（SOD）活性。

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免疫荧光[3]
用4%多聚甲醛固定脑组织样本，石蜡包埋，切成5 μm厚的切片。然后，将样本与针对Bax、CC3和8-羟基-2'-脱氧鸟苷（8-OHdG）的一抗于4℃孵育过夜。然后，在室温下与相应的二抗孵育2小时。之后，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行细胞核复染。用荧光显微镜采集图像。从每只大鼠连续3至5个脑切片中随机选取5个视野。本研究使用了24只8周龄的雄性C57BL/6小鼠。采用DMM手术建立OA小鼠模型。经过两周的适应期后，将小鼠分为四组：假手术对照组、DMM模型组、DMM联合低剂量银杏内酯A（20 mg/kg）组和DMM联合高剂量银杏内酯A（40 mg/kg）组。术后8周，处死小鼠，并收集膝关节组织进行组织学检查。[4]

[1]. Isolation of bilobalide and ginkgolide A from Ginkgo biloba L. shorten the sleeping time induced in mice by anesthetics. Biol Pharm Bull, 1993. 16(2): p. 210-2.

[2]. Pharmacological studies supporting the therapeutic use of Ginkgo biloba extract for Alzheimer's disease. Pharmacopsychiatry, 2003. 36(S 1): p. 8-14.

[3]. Ginkgolide A attenuated apoptosis via inhibition of oxidative stress in mice with traumatic brain injury. Heliyon. 2024 Jan 14;10(2):e24759.

[4]. Ginkgolide A enhances FoxO1 expression and reduces endoplasmic reticulum stress to mitigate osteoarthritis in mice. Int Immunopharmacol. 2024 Dec 5;142(Pt B):113116.

银杏内酯A是一种高活性血小板活化因子（PAF）拮抗剂笼状分子，分离自银杏树的叶片。它在多种炎症和免疫性疾病中显示出潜在的治疗价值。
已有报道称，银杏内酯A存在于黄花木和银杏中，并有相关数据可供参考。
另见：银杏（部分）。

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银杏叶及其水提取物可缩短麻醉剂（己巴比妥、α-氯醛糖和氨基甲酸乙酯，腹腔注射）诱导的小鼠睡眠时间。银杏中的两种特征萜类化合物——银杏内酯和银杏内酯A——显著缩短了麻醉剂诱导的睡眠时间。从银杏种子中分离出的导致“银杏食物中毒”的毒性物质4-O-甲基吡哆醇（MPN）并未在银杏叶提取物中检测到。因此，银杏叶提取物对MPN无毒性。[1]

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本研究存在两个局限性。首先，我们发现给予银杏内酯A（GA/Ginkgolide A）可显著减轻TBI小鼠脑内的细胞凋亡。然而，其凋亡通路尚不明确。既往综述总结了银杏内酯类化合物可减轻多种相关凋亡通路，例如在多种疾病中降低p-JNK、p-PERK、p-IRE1α、ATF6、C/EBP同源蛋白、Toll样受体4/核因子κB以及PI3K/Akt通路的水平。未来，我们将探索银杏内酯（GA）调控TBI小鼠脑细胞凋亡的通路。其次，内质网应激调节剂如二十二碳六烯酸（DHA）或其他氧化应激调节剂如硫辛酸，可能对预防慢性创伤性脑病具有治疗作用。我们将进一步研究GA与DHA或硫辛酸的联合应用。
结论：我们发现GA/银杏内酯A治疗可以改善TBI小鼠的神经功能。GA的给药通过减少TBI小鼠的细胞凋亡和氧化应激来缓解其神经功能障碍。银杏内酯A (GA) 未来可能成为创伤性脑损伤 (TBI) 治疗的药物。[3] 综上所述，GA/银杏内酯A可增强软骨细胞中FoxO1的表达，保护软骨细胞免受PERK-ATF4-eIF2α-CHOP通路激活的影响，同时减轻细胞凋亡和细胞外基质 (ECM) 降解。本研究主要探讨了GA处理的软骨细胞中FoxO1与PERK-ATF4-eIF2α-CHOP网络之间的相互作用。作为一种关键的转录因子，FoxO1的活性受多种机制调控，包括乙酰化、磷酸化、泛素化以及与其他转录因子形成复合物。虽然本研究并未阐明GA调控FoxO1表达的具体机制，但结果表明GA可减少小鼠软骨细胞的凋亡和TBHP诱导的内质网应激 (ERS) 介导的ECM降解，从而保护关节免受骨关节炎 (OA) 相关损伤。这些效应是通过FoxO1上调和PERK-ATF4-eIF2α-CHOP通路抑制实现的。同样，FoxO1与内质网应激之间的关系复杂且多方面。既往研究表明，FoxO1的激活可以诱导自噬，从而促进错误折叠蛋白和受损细胞器的降解，进而减轻内质网应激的影响。然而，本研究尚不清楚FoxO1是否仅通过调控PERK来影响应激反应通路，还是同时影响多个蛋白靶点。此外，FoxO1是通过结合PERK蛋白结构域直接调控PERK，还是通过泛素化或磷酸化等翻译后修饰间接调控PERK，这些问题仍未解决。这些问题需要在未来的研究中进一步探讨。考虑到临床应用的挑战，我们在动物模型中采用了腹腔注射，并取得了良好的结果。不同的GA给药途径，例如口服、皮下注射和关节内注射，值得进一步探索。未来的研究应着重于其他潜在的信号通路和临床适用的GA给药方法。本研究的另一个局限性在于缺乏体内和体外阳性对照，无法比较GA的效果。我们的研究结果示意图如图8所示。尽管存在一些局限性，但我们的初步结果为有效管理和治疗骨关节炎提供了新的方向。[4]

C20H24O9

408.4

408.142

C, 58.82; H, 5.92; O, 35.26

15291-75-5

9909368

White to off-white solid powder

1.6±0.1 g/cm3

710.1±60.0 °C at 760 mmHg

280°C (dec.)

256.5±26.4 °C

0.0±5.1 mmHg at 25°C

1.631

-0.13

128.59

2

9

1

29

893

10

C[C@@H]1C(=O)O[C@@H]2[C@]1([C@@]34C(=O)O[C@H]5[C@]3(C2)[C@@]6([C@@H](C5)C(C)(C)C)[C@H](C(=O)O[C@H]6O4)O)O

FPUXKXIZEIDQKW-VKMVSBOZSA-N

InChI=1S/C20H24O9/c1-7-12(22)26-10-6-17-9-5-8(16(2,3)4)18(17)11(21)13(23)28-15(18)29-20(17,14(24)27-9)19(7,10)25/h7-11,15,21,25H,5-6H2,1-4H3/t7-,8+,9-,10+,11+,15+,17-,18+,19-,20-/m1/s1

9H-1,7a-(Epoxymethano)-1H,6aH-cyclopenta(c)furo(2,3-b)furo(3,2:3,4)cyclopenta(1,2-d)furan-5,9,12(4H)-trione, 3-(1,1-dimethylethyl)hexahydro-4,7b-dihydroxy-8-methyl-, (1R,3S,3aS,4R,6aR,7aR,7bR,8S,10aS,11aS)-

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。