GLX351322

NADPH oxidase 4 (Nox4); The target of GLX351322 is NADPH oxidase 4 (NOX4) [1]

NADPH 氧化酶 4 抑制剂 GLX351322 的 IC50 为 5 μM，可防止 NOX4 过表达细胞产生过氧化氢。 GLX351322 对 hPBMC 细胞中的 NOX2 表现出很小的功效（IC50，40 μM）。

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在遭受缺氧的离体跳动大鼠心房中，用GLX351322（10 μM）处理可显著阻断缺氧诱导的沉默信息调节因子2相关酶1（Sirt1）蛋白表达上调。这种抑制作用与缺氧刺激的心钠素（ANP）分泌减少相关。蛋白质印迹分析显示，GLX351322减弱了缺氧诱导的NOX4下游信号分子（包括Src、ERK1/2、Akt和GATA4）的激活。具体而言，它降低了Src、ERK1/2和Akt的磷酸化水平，以及GATA4（ANP基因表达的关键转录因子）的核转位 [2]

GLX351322（3.8 mg/kg/天，口服）可以改善HF饮食引起的大鼠高血糖[1]。
在2型糖尿病中，有人提出，NADPH氧化酶（NOX）过度活性引起的氧化应激会促进胰腺β细胞功能障碍。已经鉴定了五种不同的NOX酶（NOX1-5），其中NOX1和NOX2被认为对β细胞有负面影响，但NOX4在2型糖尿病相关β细胞功能障碍和葡萄糖不耐受中的推定作用在很大程度上尚不清楚。因此，我们目前使用新的NOX4抑制剂GLX351322，使用雄性C57BL/6小鼠研究了NOX4对高脂饮食或HFD诱导的葡萄糖不耐受的重要性，该抑制剂对NOX4的选择性相对高于NOX2。在HFD治疗的雄性C57BL/6小鼠中，用GLX351322治疗两周可以抵消非空腹高血糖和糖耐量受损。这种效应发生时，外周胰岛素敏感性没有任何变化。为了确定NOX4也对人β细胞的功能起作用，我们观察到葡萄糖和棕榈酸钠诱导的人胰岛胰岛素释放在体外对NOX4抑制剂的反应增加。在长期实验（1-3天）中，GLX351322可以预防高糖诱导的人胰岛细胞活性氧（ROS）的产生和死亡。我们提出，虽然短期NOX4产生的ROS是β细胞功能的生理要求，但持续的NOX4活性，例如在高脂肪喂养条件下，会促进ROS介导的β细胞功能障碍。因此，选择性NOX抑制可能是2型糖尿病的一种治疗策略[1]。

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在高脂饮食（HFD）处理的C57BL/6小鼠中，口服给予GLX351322（30 mg/kg/天，持续12周）可对抗葡萄糖不耐受。与未使用该药物的HFD喂养小鼠相比，接受GLX351322处理的小鼠葡萄糖耐量得到改善，口服葡萄糖耐量试验（OGTT）中血糖水平更低。此外，GLX351322减少了HFD诱导的内脏脂肪量增加和血浆胰岛素水平升高。它还能使HFD诱导的白色脂肪组织（WAT）和骨骼肌中NOX4 mRNA表达上调恢复正常，并降低WAT中脂质过氧化产物（如4-羟基壬烯醛）的水平，表明氧化应激减轻 [1]

酶联免疫吸附试验[3]
根据供应商的方案，用大鼠IL-1β酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒和大鼠IL-18 ELISA试剂盒测量细胞培养基或大鼠滑液中IL-1β和IL-18的浓度。使用PowerWave XS在450nm波长下测量吸光度。

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体外共免疫沉淀和泛素检测[3]
共免疫沉淀（Co-IP）用于测量USP7和NOX4的相互作用。用RIPA缓冲液提取的细胞裂解物与抗USP7、抗NOX4或正常IgG抗体在4°C下孵育过夜，然后与蛋白A/G珠在4°℃下孵育2小时。免疫复合物在磁性架上用裂解缓冲液洗涤三次，然后用抗USP7抗体、抗NOX4抗体和抗泛素抗体进行免疫印迹检测。

增殖试验[3]
按照制造商的方案，使用细胞计数试剂盒8评估软骨细胞的增殖。简而言之，将细胞接种到96孔板中，并在处理前孵育24小时。在0、24、48或72小时将对照或处理过的细胞（90μL）与CCK-8试剂（10μL）混合。孵育1小时后，使用读数器测量450 nm处的光密度（OD 450）。

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制备离体大鼠心房并在含氧生理溶液中维持。稳定后，将心房分为几组：常氧组、缺氧组和缺氧 + GLX351322（10 μM）组。通过将心房暴露于低氧气体混合物特定时间来诱导缺氧。在缺氧开始前30分钟，将GLX351322加入孵育培养基中。处理结束后，收集培养基，采用放射免疫分析法测量ANP分泌。将心房组织匀浆，通过蛋白质印迹法分析蛋白提取物，检测Sirt1的表达水平以及Src、ERK1/2、Akt的磷酸化状态和GATA4的核转位情况 [2]

所有大鼠随机分为以下几组：对照组、仅缺氧组、BQ123/BQ788/BQ123 + BQ788 + 缺氧/ET-1组、GLX351322 + 缺氧组、仅ET-1组、varespladib + 缺氧/ET-1组、CAY10650 + 缺氧/ET-1组、NAC + 缺氧组、Src抑制剂1 + 缺氧组、PD98059 + 缺氧组和LY294002 + 缺氧组（每组n = 6）。每只大鼠的心房灌注60分钟，以稳定ANP分泌和心房动力学参数。经过两个对照周期（12分钟实验周期）后，将氧气替换为氮气，并灌注缺氧缓冲液四个周期，以观察心房动力学和灌注液中ANP水平的变化。在4℃的恒温条件下，每2分钟收集一次灌注液，以测定ANP水平。灌注后立即将心房组织冷冻并储存于-80°C，用于Western blotting分析。随后，进行了一系列实验以研究缺氧诱导ANP分泌的机制。在一个对照期后，进行一个治疗周期，随后进行四个周期的治疗药物联合缺氧灌注。治疗药物如下：BQ123 (0.3 µM)、BQ788 (0.3 µM)、ET-1 (3.0 nM)、GLX351322 (35.0 µM)、varespladib (5.0 µM)、CAY10650 (120.0 nM)、NAC (15.0 mM)、Src抑制剂1 (1.0 µM)、PD98059 (30.0 µM)和LY294002 (30.0 µM)。[2]

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C57BL/6 小鼠随机分为三组：对照组喂食正常饮食，HFD 组喂食高脂饮食，HFD + GLX351322 组喂食高脂饮食并给予 GLX351322。GLX351322 溶解于饮用水中，浓度为每日摄入量 30 mg/kg 体重，连续给药 12 周。研究期间每周测量小鼠体重。11 周后进行口服葡萄糖耐量试验 (OGTT)：小鼠禁食过夜，通过灌胃给予葡萄糖 (2 g/kg)，并在 0、15、30、60 和 120 分钟时测量血糖水平。经过 12 周的治疗后，对小鼠实施安乐死，并采集组织（包括白色脂肪组织、骨骼肌、肝脏）和血液样本进行进一步分析[1]

[1]. The novel NADPH oxidase 4 inhibitor GLX351322 counteracts glucose intolerance in high-fat diet-treated C57BL/6 mice. Free Radic Res. 2015;49(11):1308-18.

[2]. NOX4/Src regulates ANP secretion through activating ERK1/2 and Akt/GATA4 signaling in beating rat hypoxic atria. Korean J Physiol Pharmacol. 2021 Mar 1;25(2):159–166.

[3]. USP7 Inhibition Alleviates H2O2-Induced Injury in Chondrocytes via Inhibiting NOX4/NLRP3 Pathway. Front Pharmacol . 2021 Jan 29:11:617270.

GLX351322是一种新型NADPH氧化酶4抑制剂。它通过抑制NOX4来降低氧化应激，从而改善高脂饮食诱导的肥胖小鼠的葡萄糖耐受不良。这表明其在治疗与胰岛素抵抗和肥胖相关的代谢紊乱方面具有潜在作用[1]。
骨关节炎（OA）是最常见的关节炎类型，是一种非常常见的关节疾病，常影响中老年人群。然而，目前OA的治疗方案主要以缓解症状为主。因此，了解其病理过程并探索其潜在的治疗方法至关重要。本研究分离大鼠软骨细胞，并用过氧化氢（H2O2）处理以模拟OA。检测了H2O2对泛素特异性蛋白酶7（USP7）表达、活性氧（ROS）水平、细胞增殖、炎症细胞因子释放和细胞焦亡的影响。为了研究USP7在骨关节炎（OA）中的作用，我们敲低（KD）或过表达了USP7基因。采用共免疫沉淀（Co-IP）技术研究了USP7与NAD(P)H氧化酶（NOX）4的相互作用以及NOX4的泛素化情况。应用NOX4抑制剂研究了NOX4在USP7介导的OA发展中的作用。此外，我们还给OA动物模型注射了USP7抑制剂，以进一步研究USP7在体内OA中的作用。结果表明，H₂O₂处理显著上调了大鼠软骨细胞中USP7的表达，提高了活性氧（ROS）水平，并抑制了软骨细胞的增殖。 USP7 过表达增强了细胞焦亡、活性氧 (ROS) 生成、白细胞介素 (IL)-1β 和 IL-18 水平，以及 NLRP3、GSDMD-N、活性 caspase-1、pro-caspase-1、基质金属蛋白酶 (MMP) 1 和 MMP13 的表达水平，而 ROS 抑制剂可消除这些作用。USP7 敲低可保护大鼠软骨细胞免受 H2O2 诱导的损伤。免疫共沉淀 (Co-IP) 结果显示 USP7 与 NOX4 相互作用，且 USP7 敲低增强了 NOX4 的泛素化。抑制 NOX4 可阻断 USP7 的促骨关节炎 (OA) 作用。此外，给予 OA 动物 USP7 抑制剂可抑制体内 OA。USP7 抑制 NOX4 的泛素化降解，从而导致 ROS 生成增加。 ROS随后激活NLPR3炎症小体，导致IL-1β和IL-18的产生增加、GSDMD-N依赖性细胞焦亡以及细胞外基质重塑。因此，UPS7通过NOX4/ROS/NLPR3轴促进OA的进展。[3]骨关节炎（OA）是最常见的关节炎类型，是一种非常常见的关节疾病，常影响中老年人群。然而，目前OA的治疗方案主要以姑息治疗为主。因此，了解其病理过程并探索其潜在的治疗方法至关重要。本研究分离大鼠软骨细胞，并用过氧化氢（H2O2）处理以模拟OA。检测了H2O2对泛素特异性蛋白酶7（USP7）表达、活性氧（ROS）水平、细胞增殖、炎症细胞因子释放和细胞焦亡的影响。为了研究USP7在骨关节炎（OA）中的作用，我们敲低（KD）或过表达了USP7基因。采用共免疫沉淀（Co-IP）技术研究了USP7与NAD(P)H氧化酶（NOX）4的相互作用以及NOX4的泛素化情况。应用NOX4抑制剂研究了NOX4在USP7介导的OA发展中的作用。此外，我们还给OA动物模型注射了USP7抑制剂，以进一步研究USP7在体内OA中的作用。结果表明，H₂O₂处理显著上调了大鼠软骨细胞中USP7的表达，提高了活性氧（ROS）水平，并抑制了软骨细胞的增殖。 USP7 过表达增强了细胞焦亡、活性氧 (ROS) 生成、白细胞介素 (IL)-1β 和 IL-18 水平，以及 NLRP3、GSDMD-N、活性 caspase-1、pro-caspase-1、基质金属蛋白酶 (MMP) 1 和 MMP13 的表达水平，而 ROS 抑制剂可消除这些作用。USP7 敲低可保护大鼠软骨细胞免受 H2O2 诱导的损伤。免疫共沉淀 (Co-IP) 结果显示 USP7 与 NOX4 相互作用，且 USP7 敲低增强了 NOX4 的泛素化。抑制 NOX4 可阻断 USP7 的促骨关节炎 (OA) 作用。此外，给予 OA 动物 USP7 抑制剂可抑制体内 OA。USP7 抑制 NOX4 的泛素化降解，从而导致 ROS 生成增加。 ROS随后激活NLPR3炎症小体，导致IL-1β和IL-18的产生增加、GSDMD-N依赖性细胞焦亡以及细胞外基质重塑。因此，UPS7通过NOX4/ROS/NLPR3轴促进OA的进展。[2]

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在缺氧大鼠心房模型中，GLX351322作为NOX4抑制剂，抑制NOX4/Src介导的信号通路，从而减少缺氧刺激的ANP分泌。这表明GLX351322可以在缺氧条件下调节心房组织中NOX4依赖的细胞反应。[2]

C21H25N3O5S

431.15

431.151

C, 58.45; H, 5.84; N, 9.74; O, 18.54; S, 7.43

835598-94-2

2697686

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

665.5±55.0 °C at 760 mmHg

356.3±31.5 °C

0.0±2.0 mmHg at 25°C

1.625

4.1

120

1

7

7

30

655

0

KEVHLTCEMHIJTQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C21H25N3O5S/c1-2-28-21(27)18-14-5-3-7-16(14)30-19(18)22-17(25)13-23-8-10-24(11-9-23)20(26)15-6-4-12-29-15/h4,6,12H,2-3,5,7-11,13H2,1H3,(H,22,25)

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.08 mg/mL (4.82 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.82 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。