GNE-272

CBP (IC50 = 0.02 μM); EP300 (IC50 = 0.03 μM); BRD4 (IC50 = 13 μM)[1]
GNE-272 is 650 times more selective than BRD4 and has good selectivity for CBP/EP300. Tested at 10 μM across 42 receptor and 35 kinase off-target screens, GNE-272 did not inhibit any target by more than thirty percent. Furthermore, GNE-272 does not inhibit several cytochrome P450s (3A4, 1A2, 2C9, 2C19, 2D6) at concentrations greater than 10 μM. The efficacy of this chemical in BRET cell tests is good. GNE-272 was found to decrease MYC10 (MV4-11 cell line) expression with an EC50 of 0.91 μM in an orthogonal assessment of target engagement, and there was a strong connection between BRET and MYC cell assays [1].

GNE-272的选择性比BRD4高650倍，对CBP/EP300具有良好的选择性。 GNE-272 在 10 μM 浓度下对 42 个受体和 35 个激酶脱靶筛选进行测试，对任何靶标的抑制率均未超过 30%。此外，浓度大于 10 μM 的 GNE-272 不会抑制多种细胞色素 P450（3A4、1A2、2C9、2C19、2D6）。这种化学物质在BRET细胞测试中的功效良好。在靶点参与的正交评估中，发现 GNE-272 可降低 MYC10（MV4-11 细胞系）表达，EC50 为 0.91 μM，并且 BRET 和 MYC 细胞检测之间存在密切联系 [1]。

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GNE-272 在生化测定中对 CBP 的 IC50 为 0.04 µM。
在针对 CBP 的细胞 BRET 测定中，IC50 为 0.69 µM。
它在细胞中下调 Myc 表达的 EC50 为 1.9 µM。
其对 BRD4(1) 的选择性通过 IC50 为 14.3 µM 得到证实。
跨广谱溴结构域的 BROMOscan 分析证实了对 CBP/EP300 的高选择性，对大多数其他测试的溴结构域（如 BAZ2B、BRD9 和 PCAF）的 Kd 值 >10,000 nM。 [1]

在小鼠 PK 测试中，GNE-272 以 100 mg/kg 剂量给药时，具有 26 μM 的良好口服生物利用度，但静脉注射 1 mg/kg 后显示出有限的清除率。不与 Cmax 一起使用。 GNE-272 影响体内 MYC 表达，并在血液癌细胞系中表现出强大的抗增殖作用，这两者都表明在 AML 肿瘤模型中具有抗肿瘤功效 [1]。

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在 AML MOLM-16 皮下异种移植小鼠模型中，口服给予 GNE-272 可导致肿瘤中 MYC 表达的剂量依赖性抑制。
给药后 2 小时，3 mg/kg 剂量使 MYC 降至对照组的 87%，10 mg/kg 剂量降至 58%，30 mg/kg 剂量降至 22%。100 mg/kg 剂量在 2 小时时达到最大抑制，降至对照组的 14%。
MYC 抑制是短暂的，根据剂量不同，水平在 8-24 小时反弹。 [1]

热位移测定方案[1]
他的Flag标记的人CBP溴结构域（K1082-G1197）在大肠杆菌中表达，并在内部纯化至>95%的纯度。在锥形管中，CBP（最终浓度为4μM）与SYPROOrange混合，在25 mM HEPES、100 mM NaCl、pH 6.8中的最终染料浓度为10倍。将试管短暂离心以去除沉淀物，然后将80μL蛋白质：染料溶液加入黑色透明底部384孔板的每个孔中，并短暂旋转（1分钟，900g）。从该储备板中，将23μL转移（每个储备板孔三次单独转移）到DMSO对照或从10 mM DMSO储备中镀入透明底Fluotrac200板的化合物中，使最终化合物浓度为50μM（1.0%v/v DMSO）。随后，将样品（15μL）转移到LightCycler 480板上，旋转（2分钟，900g），并在罗氏LightCycler 480 II上使用25-65°C的温度梯度和4.2°C/min的扫描速率进行分析。使用内部开发的应用程序评估熔融转变的中点（Tm），该应用程序测量荧光变化率随温度变化的一阶导数。相对于同一平板内的DMSO对照，计算化合物诱导的熔融温度变化ΔTm。

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时间分辨荧光共振能量转移分析[1]
在一组生化溴结构域结合试验中评估了化合物的效力。通过时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）评估生物素化小分子配体与重组His标记的溴结构域的结合。与生物素化配体竞争溴结构域结合的测试化合物会降低TR-FRET信号。所有生化测定方案均如前所述进行。

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体外代谢稳定性实验[1]
用1μM化合物进行代谢稳定性实验，并使用先前报道的方法在雌性CD-1小鼠的混合肝微粒体和雌性CD-1鼠的混合冷冻肝细胞中进行评估。（25）肝微粒体孵育由0.5mg/mL微粒体蛋白、100mM Kpi缓冲液中的1mM NADPH组成。加入化合物（1μM）引发反应，在0、20、40和60分钟时取50μL等分试样，用2倍体积的含内标的乙腈淬灭反应。将冷冻保存的肝细胞解冻并重新悬浮在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，pH 7.4）中。将含有0.5×106个细胞/mL和1μM化合物的孵育混合物在37°C、95%相对湿度和5%CO2环境中孵育，在0、60、120和180分钟时取50μL等分试样，用含有内部内标的2倍体积乙腈淬灭反应。将来自微粒体和肝细胞的淬灭样品在2000g下离心10分钟。去除上清液并用水（2×）稀释，使用t=0峰面积比设置为100%通过LC-MS/MS进行分析。如Obach等人所述，确定了体外固有清除率和标度肝脏清除率。

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体外蛋白质结合实验[1]
将小鼠血浆（100%）解冻，必要时用氢氧化钠或磷酸调节pH至7.4。将掺有化合物（终浓度5μM）的血浆（300μL）放入供体侧一次性RED板的样品室中，并将PBS的等分试样（500μL）放置在受体侧的相邻室中，两份均为两份。用透明的板盖覆盖平板，在37°C的利康振荡器上孵育4小时。4小时后，从受体和供体中取出40μL等分试样，加入含有2.5 nM普萘洛尔（内标）的乙腈（150μL）。为了创建分析上相同的样品基质以最小化基质效应，将40μL空白血浆添加到接收孔中，而将36μL空白等离子体和40μL PBS添加到供体孔中。样品在1000g下离心10分钟，上清液（100μL）转移到96孔分析板上。在LC-MS/MS分析之前，向样品中加入水（100μL）。蛋白质结合百分比由受体和供体侧检测到的分析物的面积比（归一化为内标）乘以100计算得出。

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CYP抑制评估[1]
使用之前报道的方法，使用混合的（n=150）人肝微粒体，在0.16-10uM的GNE-272（化合物59）浓度范围内评估CYP抑制作用。孵育时间和蛋白质浓度取决于CYP亚型和评估的探针底物/代谢物。使用以下底物/代谢物和每种CYP的孵育时间和蛋白质浓度：CYP1A2，非那西丁/对乙酰氨基酚，30分钟，0.03 mg/mL蛋白质；CYP2C9，华法林/7-羟基华法林，30分钟，0.2 mg/mL蛋白质；CYP2C19，苯妥英/4-羟基苯妥英，40分钟，0.2 mg/mL蛋白质；CYP2D6，右美沙芬/右沙芬，10分钟，0.03 mg/mL蛋白质；CYP3A4，咪达唑仑/1-羟基咪达唑拉姆，10分钟，0.03 mg/mL蛋白质；CYP3A4睾酮/6β-羟基睾酮，10分钟，0.06mg/mL蛋白质。这些条件之前被确定为CYP特异性代谢物的线性形成速率。所有反应均用1 mM NADPH引发，并通过在含有适当稳定标记内标的乙腈中加入0.1%甲酸终止。样品通过LC-MS/MS进行分析。

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GNE-272 与各种溴结构域的结的亲和力使用 BROMOscan 平台测定。该测定基于化合物与固定化配体竞争结合可溶的、DNA 标记的溴结构域蛋白。解离常数 (Kd) 值根据竞争数据计算得出。 [1]
使用 TR-FRET 结合测定来确定 GNE-272 对 CBP 溴结构域的 IC50 值，并用于针对一组其他溴结构域的选择性分析。 [1]

细胞检测方案[1]
CBP BRET测定如前所述进行。为了确定对MYC分泌的抑制作用，将MV-4-11细胞（ATCC）以每孔10000个细胞的速度接种在96孔板上，培养基中添加了10%胎牛血清和2 mM l-谷氨酰胺。将稀释在DMSO中的试验化合物转移到细胞板上，使DMSO的最终浓度保持在0.1%，并在37°C下孵育4小时。使用QuantiGene 2.0试剂并按照供应商的说明进行MYC表达的裂解和分析。使用EnVision平板阅读器读取发光，并使用四参数非线性回归拟合在Genedata Screener中生成EC50s。

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MDCK渗透率实验[1]
将MDCK细胞以2.5×105个细胞/mL的浓度接种在24孔板中，并在37°C、95%湿度和5%CO2的环境中生长4天。在接种后2天和实验前一天更换含有Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）和补充有10%胎牛血清的Earle平衡盐溶液的培养基。将化合物以10μM的初始浓度添加到单层的顶端或基底外侧，并在37°C下孵育180分钟。在60、120和180分钟时从接收器室中取样，并通过LC-MS/MS进行分析。在顶端到基底外侧（A-B）和基底外侧到顶端（B-A）方向上的表观渗透率（Papp）计算为Papp=（dQ/dt）（1/AC0），其中dQ/dt=接收器室中化合物出现的速率，A=插入物的表面积，C0=时间=0时的初始底物浓度。流出比（ER）计算为（Papp，B-A/Papp，B-B）。

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细胞中GNE-272 (compound 59)的体外评估[1]
人癌症细胞系在补充有10%胎牛血清和2mM谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。培养物保持在37°C和80%湿度下。根据制造商的说明，使用RNeasy试剂盒从细胞中分离RNA。根据制造商的说明，使用iSCRIPT逆转录酶、TaqMan通用PCR混合物和基因特异性探针（ABI）通过RT-PCR测定MYC、其他癌基因和看家基因ACTB的RNA水平。使用抗MYC抗体通过蛋白质印迹法测定MYC蛋白水平。抗α-微管蛋白被用作负荷对照。使用HRP偶联的二抗检测信号。根据制造商的说明，使用CellTiter-Glo试剂在384孔板型中进行药物处理后评估细胞存活率。

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使用 BRET 测定评估细胞内的靶点结合情况，该测定报告 GNE-272 在细胞中对 CBP 的 IC50 为 0.69 µM。
通过量化 Myc 蛋白表达的下调来测量 CBP 抑制的功能性细胞后果，得出的 EC50 为 1.9 µM。 [1]

GNE-272（化合物 59）的体内药代动力学研究[1]
本研究使用了六只裸鼠（nu/nu）。所有动物均为雌性，研究时年龄为 6-9 周，体重在 15-25 克之间。每组动物（每种给药途径 n = 3）分别静脉注射 1 mg/kg 的 GNE-272（化合物 59）（溶于 35% v/v 丙二醇 400 和 65% v/v 水）或口服 100 mg/kg（悬浮于 0.5% w/v 甲基纤维素和 0.2% w/v Tween 80 的溶液中）。所有动物均可自由摄取食物和水。分别于静脉给药后 0.033、0.083、0.25、0.5、1、3、8 和 24 小时，以及口服给药后 0.083、0.25、0.5、1、3、8 和 24 小时，通过尾部采血法采集系列血样（15 μL）。所有血样均用 60 μL 含 1.7 mg/mL EDTA 的水溶液稀释，并保存于 -80 °C 直至分析。采用未经验证的 LC-MS/MS 法测定 GNE-272（化合物 59）的浓度。将稀释后的血样取 20 μL 置于 96 孔板中，然后加入 200 μL 含内标混合物（0.1 μg/mL 双氯芬酸）的乙腈溶液进行分析。将样品涡旋振荡后，于4℃下以4000 rpm离心20分钟；取70 μL上清液，用140 μL 0.1%甲酸水溶液稀释，取10 μL稀释液注入分析柱。采用与API 4000质谱仪联用的ACQUITY UPLC系统（Waters公司）进行样品分析。流动相A为0.3%甲酸和2 mM乙酸铵的乙腈水溶液（体积比95:5），流动相B为0.3%甲酸和5 mM乙酸铵的乙腈水溶液（体积比95:5）。梯度洗脱程序如下：初始流动相B的比例为20%，在1.2分钟内线性增加至90%，保持90% B比例0.4分钟，然后在0.1分钟内线性降低至20% B。总流速为0.55 mL/min，样品注入ACQUITY BEH C8（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm）分析柱，总运行时间为1.7分钟。采用正离子电喷雾多反应监测（MRM）模式采集数据，离子源温度为550 °C。GNE-272（化合物59）的MRM离子对为m/z 425.3 → 313.4，双氯芬酸的MRM离子对为m/z 296.0 → 214.0。 GNE-272（化合物 59）的定量检测的下限和上限分别为 0.005 和 10 μM。

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在 MOLM-16 AML PK/PD 和抗肿瘤疗效模型中对 GNE-272（化合物 59）进行体内评估[1]
使用 TaqMan RNA-to-Ct 1-Step 试剂盒和 Taqman 基因表达分析进行 RT-PCR。采用比较Ct值法，以MYC TaqMan检测（Hs00153408_m1）和ACTB TaqMan检测（Hs01060665_g1）作为管家基因，评估基因表达的相对变化。所有实验程序均经基因泰克公司机构动物护理和使用委员会批准，并符合其制定的指南和原则，且均在经实验动物评估和认证协会（AAALAC）认证的机构中进行。8-9周龄、体重20-24克的雌性CB-17 SCID.bg小鼠购自查尔斯河实验室。将500万个MOLM-16白血病急性髓系细胞（悬浮于1:1的Hank's平衡盐溶液和Matrigel混合液中）皮下注射到小鼠右侧腹部。对肿瘤进行监测，直至其平均体积达到 130–300 mm³。在给药开始时，所有八个组的平均肿瘤体积为 222 ± 6.87 mm³（平均值 ± 标准差）。小鼠分别灌胃给予 0（赋形剂，0.5% 甲基纤维素；0.2% Tween-80）、12.5、25 和 50 mg/kg 的化合物GNE-272（化合物 59），每日两次 (BID)，持续 21 天，每次灌胃体积为 100 μL。使用 Ultra Cal-IV 游标卡尺测量肿瘤的二维体积（长度和宽度），并使用 Excel 11.2 版本进行分析。肿瘤体积的计算公式为：肿瘤大小 (mm³) = (较长测量值 × 较短测量值²) × 0.5。使用 Adventura Pro AV812 电子秤测量动物体重。体重变化百分比采用以下公式计算：组体重变化百分比 = (新体重 – 初始体重)/初始体重) × 100。给药后 2 小时采集血浆、肿瘤和脑组织样本。GNE-272（化合物 59）的浓度采用未经验证的 LC-MS/MS 法测定。血浆样本的制备方法为：取 25 μL 血浆样本置于 96 孔板中。收集肿瘤样本并称重。加入相当于组织重量四倍体积的水。使用珠磨匀浆器匀浆组织样本，取 25 μL 匀浆液置于 96 孔板中。向样本中加入 200 μL 含有内标物（拉贝洛尔）的乙腈溶液。样品涡旋振荡后，以4000 rpm离心10 min，取50 μL上清液，用150 μL水稀释。进样量为10 μL，使用SIL-30ACMP自动进样器系统（与LC-30AD泵联用）进行分析，该系统与API 5500 QTrap质谱仪联用。流动相为0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B）。梯度洗脱程序如下：初始B相比例为10%，在0.6 min内线性增加至90%，保持90% B相比例0.2 min，然后在0.1 min内线性降低至10% B相比例。总流速为 1.2 mL/min，分离柱为 Kinetex XB-C18 色谱柱（50 mm × 2.1 mm，2.6 μm），总运行时间为 1.2 min。数据采集采用多反应监测 (MRM) 模式，正离子电喷雾电离，离子源温度为 550 °C。GNE-272（化合物 59）的 MRM 离子对为 m/z 425.3 → 313.4，拉贝洛尔的 MRM 离子对为 m/z 329.076 → 294.1。 GNE-272（化合物 59）的定量分析的下限和上限分别为 0.002 μM 和 10 μM。在皮下接种 MOLM-16 AML 肿瘤的雌性 SCID 小鼠中评估了 GNE-272 的体内药效学 (PD) 和药代动力学 (PK)。该化合物配制于含有 0.5% 甲基纤维素和 0.2% Tween-80 的载体中。小鼠分别以 3、10、30 或 100 mg/kg 的剂量单次口服给药。分别于给药后 2、4、8 和 24 小时收集肿瘤和血浆样本（每个时间点 n=3）。采用 ELISA 分析肿瘤裂解液中 MYC 蛋白的水平，以评估 PD。效应。
采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析血浆和肿瘤匀浆，以确定化合物浓度。[1]

在荷瘤小鼠中单次口服给药后，GNE-272在血浆和肿瘤中的暴露量均呈剂量依赖性。
100 mg/kg剂量给药后2小时，血浆总浓度为129.5 µM，肿瘤浓度为45.5 µM。
校正血浆蛋白结合率（PPB）后，同一时间点的游离血浆浓度为20.8 µM，游离肿瘤浓度为7.3 µM。
100 mg/kg剂量组的药物暴露量持续存在，给药后24小时，游离肿瘤浓度仍维持在1.6 µM。
较低剂量（例如3 mg/kg）组的药物暴露量短暂，2小时后游离肿瘤浓度降至0.2 µM以下。[1]

在 CEREP 筛选板中，GNE-272 在 10 µM 浓度下针对 44 种非靶向受体、离子通道和酶进行了筛选。大多数靶点的抑制率低于 25%，其中对罗利普兰位点 (28%) 和 5-HT1B (24%) 的抑制率最高。在激酶选择性筛选板（33 种激酶）中，该化合物在 10 µM 浓度下仅对 RIPK2 显示出较弱的抑制作用（>25%）（抑制率为 25%）。对 MAP4K4、MuSK、Flt3、CSF1R 和 TGFR1 的抑制率在 13% 至 18% 之间。在小鼠血浆中，GNE-272 的血浆蛋白结合率为 94.8%，用于计算 PK/PD 分析中的游离药物浓度。[1]

[1]. Discovery of a Potent and Selective in Vivo Probe (GNE-272) for the Bromodomains of CBP/EP300. J Med Chem. 2016 Dec 8;59(23):10549-10563.

密切相关的转录调控因子CBP/EP300的单个溴结构域是近年来癌症和免疫系统调控领域研究的热点。配体高效筛选先导化合物与CBP溴结构域的共晶结构指导了初始设计，靶向LPF平台、ZA环和乙酰化赖氨酸结合区域。构效关系研究使我们能够鉴定出一种更有效的类似物。通过优化渗透性和微粒体稳定性，并进一步提高其在小鼠肝细胞中的稳定性，最终得到化合物59（GNE-272，TR-FRET IC50 = 0.02 μM，BRET IC50 = 0.41 μM，BRD4(1) IC50 = 13 μM），该化合物在细胞效力、选择性和体内药代动力学方面均达到了最佳平衡。化合物 59 在血液肿瘤细胞系中表现出显著的抗增殖作用，并在体内调节 MYC 表达，这与 AML 肿瘤模型中的抗肿瘤活性相符。[1]

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GNE-272 最初被发现是一种用于研究 CBP/EP300 溴结构域生物学的体内化学探针。
解析了 GNE-272 与 CBP 溴结构域 (PDB: 5KTX) 和 BRD4(1) 溴结构域 (PDB: 5KU3) 的共晶结构，为其对 CBP/EP300 相对于 BRD4 的高选择性提供了结构基础。
对该化合物核心进行从头算计算二面角扫描表明，在 BRD4(1) 复合物中观察到的构象能量上不利（比在 CBP 复合物中高约 0.7 kcal/mol），这有助于其选择性。 [1]

C22H25FN6O2

424.471307516098

424.2023

C, 62.25; H, 5.94; F, 4.48; N, 19.80; O, 7.54

1936428-93-1

121372887

White to off-white solid powder

1.5

77.2Ų

1

6

4

31

656

1

C(=O)(N1CC2C(NC3=CC=C(C4=CN(C)N=C4)C=C3F)=NN([C@H]3CCOC3)C=2CC1)C

NKOJNOBJGYTLLZ-KRWDZBQOSA-N

InChI=1S/C22H25FN6O2/c1-14(30)28-7-5-21-18(12-28)22(26-29(21)17-6-8-31-13-17)25-20-4-3-15(9-19(20)23)16-10-24-27(2)11-16/h3-4,9-11,17H,5-8,12-13H2,1-2H3,(H,25,26)/t17-/m0/s1

(S)-1-(3-((2-fluoro-4-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)phenyl)amino)-1-(tetrahydrofuran-3-yl)-1,4,6,7-tetrahydro-5H-pyrazolo[4,3-c]pyridin-5-yl)ethan-1-one

GNE-272; GNE 272; CHEMBL3897393; 1-[3-[[2-Fluoranyl-4-(1-Methylpyrazol-4-Yl)phenyl]amino]-1-[(3~{s})-Oxolan-3-Yl]-6,7-Dihydro-4~{h}-Pyrazolo[4,3-C]pyridin-5-Yl]ethanone; 1-[3-[2-fluoro-4-(1-methylpyrazol-4-yl)anilino]-1-[(3S)-oxolan-3-yl]-6,7-dihydro-4H-pyrazolo[4,3-c]pyridin-5-yl]ethanone; (S)-1-(3-((2-fluoro-4-(1-methyl-1h-pyrazol-4-yl)phenyl)amino)-1-(tetrahydrofuran-3-yl)-1,4,6,7-tetrahydro-5h-pyrazolo[4,3-c]pyridin-5-yl)ethan-1-one; 6XH; SCHEMBL17794706; GNE272.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~235.59 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.89 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.89 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.89 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。