| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 5mg |
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| 10mg |
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| 25mg |
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| 50mg |
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| 100mg |
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| 250mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
USP7 (IC50 = 1.4 μM)
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| 体外研究 (In Vitro) |
在15μM时，GNE-6776显著抑制USP7。GNE-6776[1]是一种对内源性细胞去泛素酶和重组酶具有高度选择性的USP7抑制剂[1].
GNE-6776诱导肿瘤细胞死亡，并增强化疗药物和靶向化合物（包括PIM激酶抑制剂）的细胞毒性。结构研究表明，GNE-6640和GNE-6776非共价靶向距离催化半胱氨酸12Å的USP7。这些化合物减弱泛素结合，从而抑制USP7去泛素酶活性。GNE-6640和GNE-6776与酸性残基相互作用，酸性残基介导与泛素Lys48侧链的氢键相互作用，表明USP7优先与具有游离Lys48侧面链的泛素部分相互作用并切割泛素部分。 GNE-6776 促进人类异种移植物中的靶向途径调节。尽管仅短暂地达到有效暴露，但 GNE-6776 会导致适度但显着的 EOL-1 异种移植物生长延迟。 鉴于这些抑制剂的有利特性，我们在动物模型中研究了它们的疗效。药效学和药代动力学研究表明，GNE-6776具有口服生物可利用性，并促进人类异种移植物的靶向通路调节（扩展数据图4e-i）。尽管有效的暴露只是暂时的，但GNE-6776引起了EOL-1异种移植物生长的适度但显著的延迟（扩展数据图4j）。开发具有改善药物样性质的USP7抑制剂对于全面评估USP7在体内的抑制作用是必要的。 |
| 体内研究 (In Vivo) |
GNE-6776 促进人类异种移植物中的靶向途径调节。尽管仅短暂地达到有效暴露，但 GNE-6776 会导致适度但显着的 EOL-1 异种移植物生长延迟。
鉴于这些抑制剂的有利特性，我们在动物模型中研究了它们的疗效。药效学和药代动力学研究表明，GNE-6776具有口服生物可利用性，并促进人类异种移植物的靶向通路调节（扩展数据图4e-i）。尽管有效的暴露只是暂时的，但GNE-6776引起了EOL-1异种移植物生长的适度但显著的延迟（扩展数据图4j）。开发具有改善药物样性质的USP7抑制剂对于全面评估USP7在体内的抑制作用是必要的。 |
| 酶活实验 |
USP7 enzymatic analysis/USP7酶活分析[1]
使用1 nM USP7和一系列泛素-AMC底物滴定法对全长USP7进行Michaelis-Menten动力学测量。在Tecan Safire2平板读数器上使用Magellan软件确定底物水解的初始速率，并使用GraphPad Prism软件进行非线性回归分析建模动力学参数。标准误差由三个技术重复计算得出。对于使用USP7 D305/E308突变体的研究，样品在由50 mM HEPES（pH 7.5）、100 mM NaCl、2.5 mM二硫苏糖醇和0.1%（w/v）牛丙种球蛋白组成的缓冲液中反应。用于Michaelis-Menten分析的泛素-Rho110的起始底物浓度为100μM，连续稀释至781 nM。反应在室温下进行1小时，最终酶浓度为100 nM（三个独立的实验，见图表中的符号），在黑色100-μl体积96孔半面积板上进行。通过使用初始速度将数据与线性V0值拟合来计算酶活性，该线性V0值是通过使用485nm的激发和535nm的发射分析切割的Rho-110的荧光信号而测量的 Deubiquitinase selectivity analysis/去泛素酶选择性分析[1] 重组去泛素酶双泛素质谱裂解试验。如前所述，使用指定浓度的重组去泛素酶、二泛素底物和USP7抑制剂化合物进行MALDI-TOF DUB测定。在泛素的替代底物Ub-Ube2W（Ub-E2）上监测GNE-6640和GNE-6776对UCH1家族成员的抑制效率。 |
| 细胞实验 |
Tumour cell-line panel viability/肿瘤细胞系存活率。[1]
如前所述，在441个细胞系中对GNE-6640和GNE-6641进行了3天的分析，并在185个细胞系的亚群中对GNE-6776、GNE-6640和GNE-641进行了5天的分析26。简而言之，使用三倍稀释法在九点剂量反应中筛选化合物。在加入化合物前24小时将细胞接种到384孔板中。然后将细胞与化合物一起孵育72小时或120小时，然后测定存活率。检测采用生物法，一式三份。在整个试验过程中，细胞在RPMI-1640、2.5%FBS（72小时试验）或5%FBS（120小时试验）和2 mM谷氨酰胺中孵育（37°C，5%CO2）。报告的IC50和平均存活率指标如下：IC50是相对于未处理孔的估计抑制率为50%的剂量（即绝对IC50） Primary combination screen。[1] 在不存在或存在固定剂量的GNE-6776（0 nm、125 nm、250 nm、500 nm、1000 nm和2000 nm）或GNE-6640（400 nm）的情况下，筛选了一个包含589种按九点剂量反应排列的化合物库。简而言之，将5000个EOL-1细胞接种到384孔板中，24小时后加入化合物。在化合物加入后120小时测定细胞存活率（CellTiter Glo）。拟合曲线，计算IC50和平均存活率指标。IC50是相对于未处理的孔抑制50%的剂量。平均存活率是每个测试剂量下拟合存活率的平均值。平均存活率等于对数剂量/存活率曲线下的面积除以测试剂量的总数。平均存活率值用于扩展数据图6g中描述的分析。所有数据均使用Genedata Screener软件进行拟合 Primary combination screen analysis。[1] 在EOL-1细胞系中，在DMSO或浓度增加的GNE-6776（100 nM、250 nM、500 nM、1000 nM或2000 nM）或400 nM的GNE-6640存在下，测定了574种具有已知蛋白质或机制靶标的化合物的标准化平均存活率。对于每种化合物，我们评估了USP7抑制剂治疗和DMSO治疗之间的平均存活率差异。对于三种或多种化合物靶向的靶标，我们使用Wilcoxon秩和检验计算了每种浓度USP7抑制剂的高平均存活率差异的富集程度。为了可视化，我们通过取每个目标的−log10（转换后的P值）的平均值来组合所有浓度的结果。 |
| 动物实验 |
免疫缺陷型 CB-17 SCID 小鼠，移植 EOL1 AML 异种肿瘤，12-16 周龄[1]
100 或 200 mg/kg DMPK 分析。[1] 体外 DMPK 研究采用标准方案进行。GNE-6776 配制成 0.5% 甲基纤维素/0.2% Tween-80 混悬液，以 200 mg/kg（体重）的剂量通过灌胃法给予 12-16 周龄的雌性 CB-17 SCID 小鼠（每个时间点 n = 3）。DMPK 研究未采用随机分组。给药后 0.5、1、2、4、8 和 24 小时，通过心脏末端穿刺采集血液样本至抗凝管（EDTA）中。澄清的血浆随后转移至新的试管中并速冻。采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定GNE-6776血浆浓度。 体内药效学反应。[1] 在EOL-1 AML异种移植研究中，将500万个细胞悬浮于50:50的HBSS:Matrigel（100 μl）悬液中，皮下接种于12-16周龄的免疫缺陷型CB-17 SCID小鼠右侧腹部。当肿瘤体积达到约285-500 mm³时，将小鼠按体积匹配分组（n = 4）。在MCF7乳腺癌异种移植研究中，将0.36 mg雌激素缓释片通过套管植入6-8周龄的免疫缺陷型nu/nu小鼠体内，植入时间为肿瘤细胞接种前1-3天。将1000万个MCF7-Ser细胞（一种体内优化的MCF7变体）以50:50的HBSS:Matrigel悬浮液（总体积100 μl）原位注射到每只小鼠的2/3乳腺脂肪垫中。当肿瘤体积达到约285至450 mm³时，将小鼠按体积匹配分为若干组（n = 4）。将GNE-6776配制成0.5%甲基纤维素/0.2% Tween-80悬浮液，并在0小时和4小时通过灌胃给予200 mg/kg（体重）的剂量。在首次给药后8小时收集0.5%甲基纤维素/0.2% Tween-80对照组或GNE-6776处理组的样本，并将切除的肿瘤组织用干冰速冻。使用 Qiagen TissueLyser 组织裂解仪，在含有蛋白酶抑制剂和 300 mM NaCl 的 RIPA 缓冲液中裂解肿瘤组织。样品在冰上孵育 15 分钟，然后在 4 °C 下以 20,000 g 离心 10 分钟。使用 Pierce BCA 蛋白定量试剂盒对澄清裂解液中的蛋白水平进行定量，并用样品缓冲液进行浓度标准化。样品进行凝胶电泳，并将蛋白转移至膜上，然后按照上述方法进行蛋白质印迹分析。 体内疗效研究。[1] 对于 EOL1 AML 异种移植研究，将 12-16 周龄的免疫缺陷型 CB-17 SCID 小鼠（查尔斯河实验室）右侧腹部皮下接种 500 万个细胞，细胞悬液为 50:50 的 HBSS:Matrigel (100 μl)。当肿瘤体积达到一定程度（150–300 mm³）后，将小鼠按肿瘤体积匹配分为若干组（n = 7，平均肿瘤体积约250 mm³）。将GNE-6776配制成0.5%甲基纤维素/0.2% Tween-80的悬浮液，并以100或200 mg kg⁻¹（体重）的剂量，每日灌胃给药一次或两次。每周采集两到三次肿瘤体积、体重和体况数据。所有动物的肿瘤体积均未达到2000 mm³的最大限制。 |
| 参考文献 | |
| 其他信息 |
泛素系统调控真核生物中重要的细胞过程。泛素以单体或链的形式与底物蛋白连接，泛素修饰的拓扑结构调控底物与特定蛋白的相互作用。因此，泛素化决定了多种底物命运，包括蛋白酶体降解。去泛素化酶从底物上切割泛素，并与多种疾病相关；例如，泛素特异性蛋白酶-7 (USP7) 调控p53肿瘤抑制蛋白和其他对肿瘤细胞存活至关重要的蛋白的稳定性。然而，开发选择性去泛素化酶抑制剂一直极具挑战性，目前尚未解析出小分子抑制剂与去泛素化酶的共晶体结构。本文中，我们利用基于核磁共振的筛选和基于结构的药物设计，描述了选择性USP7抑制剂GNE-6640和GNE-6776的开发。这些化合物可诱导肿瘤细胞死亡，并增强化疗药物和靶向化合物（包括PIM激酶抑制剂）的细胞毒性。结构研究表明，GNE-6640和GNE-6776以非共价方式靶向USP7，其作用位点距离催化半胱氨酸残基12 Å。这些化合物可减弱泛素结合，从而抑制USP7的去泛素化酶活性。GNE-6640和GNE-6776与介导与泛素Lys48侧链氢键相互作用的酸性残基相互作用，提示USP7优先与具有游离Lys48侧链的泛素分子相互作用并切割这些分子。我们通过构建含有不同近端和远端同位素标记的双泛素链，并利用核磁共振技术测量USP7的结合情况，验证了这一假设。这种优先结合延长了Lys48连接的泛素链相对于Lys63连接的泛素链的解聚动力学。总之，通过减弱泛素结合来抑制USP7活性的化合物设计，为开发其他去泛素化酶抑制剂提供了契机，并且可能是一种更广泛适用于抑制需要泛素结合才能发挥完整功能活性的蛋白质的策略。[1] 本文描述了GNE-6640和GNE-6776，它们是具有结构明确的抑制机制的选择性USP7抑制剂。建立严格的筛选流程对于选择和优化靶向抑制剂至关重要。联合研究揭示了USP7去泛素化酶活性与PIM激酶在调节细胞活力方面此前未被描述的相互作用。 GNE-6640 或 GNE-6776 的共晶结构表明 USP7-D305/E308 与泛素-K48 侧链之间互补的带电相互作用至关重要，我们通过突变分析证实了这一点。值得注意的是，D305G 已被鉴定为急性淋巴细胞白血病患者的体细胞功能缺失突变体21。对 USP7 与天然单泛素和差异标记的双泛素结合的 NMR 分析表明，USP7 优先与具有游离 K48 侧链的泛素部分相互作用。有研究提出，某些去泛素化酶无法有效解聚较长的底物结合的 K48 连接链，从而为蛋白酶体靶向多聚泛素化设定了阈值22；我们的研究证实了这一观点，并提供了一种生物物理机制。许多蛋白质，包括其他去泛素化酶、泛素连接酶、DNA修复和内吞机制以及表观遗传调控因子，其功能依赖于泛素结合23。开发能够减弱泛素结合的选择性抑制剂是抑制USP7的有效策略。我们的研究证明了该方法的可行性，并且可能在抑制其他类型的泛素结合蛋白方面具有更广泛的应用前景。[1]
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| 分子式 |
C21H21N3O2
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|---|---|---|
| 分子量 |
347.41
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| 精确质量 |
348.16
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| 元素分析 |
C, 68.95; H, 5.79; N, 16.08; O, 9.18
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| CAS号 |
2009273-60-1
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| 相关CAS号 |
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| PubChem CID |
122531799
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| 外观&性状 |
Off-white to light yellow solid powder
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| LogP |
3.5
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| tPSA |
88.2Ų
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| 氢键供体(HBD)数目 |
3
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| 氢键受体(HBA)数目 |
4
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| 可旋转键数目(RBC) |
4
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| 重原子数目 |
26
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| 分子复杂度/Complexity |
456
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| 定义原子立体中心数目 |
0
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| InChi Key |
UCYSSYGGXOFJKK-UHFFFAOYSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C20H20N4O2/c1-3-15-16(13-6-9-17(23-10-13)20(26)22-2)11-24-19(21)18(15)12-4-7-14(25)8-5-12/h4-11,25H,3H2,1-2H3,(H2,21,24)(H,22,26)
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| 化学名 |
6'-Amino-4'-ethyl-5'-(4-hydroxyphenyl)-N-methyl-[3,3'-bipyridine]-6-carboxamide
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| 别名 |
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| HS Tariff Code |
2934.99.03.00
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
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| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
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|---|---|---|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.99 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。 *生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。 配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.99 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。 例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。 *20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。 View More
配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.99 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 2.8784 mL | 14.3922 mL | 28.7844 mL | |
| 5 mM | 0.5757 mL | 2.8784 mL | 5.7569 mL | |
| 10 mM | 0.2878 mL | 1.4392 mL | 2.8784 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
 Identification and characterization of USP7 inhibitors.Nature.2017 Oct 26;550(7677):534-538. |
|---|
 Selectivity of USP7 inhibitors and synergy with PIM kinase inhibition.
USP7 inhibitors compete with ubiquitin binding to USP7.Nature.2017 Oct 26;550(7677):534-538. |
 USP7 preferentially binds and cleaves ubiquitin moieties with free K48 side chains.Nature.2017 Oct 26;550(7677):534-538. |
USP7-IN-16
T20-M
(E/Z)-NSC-687852
KSQ-4279 (gentisate)
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