gt1b(Ki=0.01±<0.01 nM);gt1a(Ki=0.01±0.01 nM);gt2a(Ki=0.08±0.02 nM);gt2b(Ki=0.15±0.06 nM);gt3a(Ki=0.90±0.2 nM)

体外活性：MK-5172 (Grazoprevir) 在针对常见耐药突变的主要基因型和变异体的生化检测中有效，Ki 为 0.01±<0.01 nM (gt1b)、0.01±0.01 nM (gt1a)、0.08±0.02 nM (gt2a)、0.15±0.06nM(gt2b)、0.90±0.2nM(gt3a)、0.07±0.01nM(gt1bR155K)、0.14±0.03nM(gt1bD168V)、0.30±0.04nM(gt1bD168Y)、5.3±0.9nM(gt1bD168Y) 1bA156T ) 和 12±2 nM (gt1bA156V)。在复制子测定中，MK-5172 对基因型 1a、1b 和 2a 表现出亚纳摩尔至低纳摩尔 EC50，对于 gt1bcon1、gt1a 和 gt2a 的 EC50 分别为 0.5±0.1 nM、2±1 nM 和 2±1 nM，分别。 MK-5172 对一组 HCV 复制突变体 NS5A (Y93H) (EC50=0.7±0.3 nM)、NS5B 核苷 (S282T) (EC50=0.3±0.1 nM) 和 NS5B (C316Y) (EC50=0.4±0.2) 有效。 ）。 MK-5172 保持了针对 gt 3a 酶以及多种突变酶的优异功效，在复制子系统中具有优异的功效 [gt1b IC50(50% NHS)=7.4 nM； gt1a IC50(40% NHS)=7 nM]，并且显示出优异的大鼠肝脏暴露。激酶测定：从大肠杆菌中表达并纯化重组 HCV NS3/4A 酶。酶序列源自基因型 1a (gt1a) H77、gt1b con1、gt2a JFH1、gt2b HCJ8 和 gt3a NZL1。在时间分辨荧光测定中测定含有 MK-5172 (Grazoprevir)、Vaniprevir 或参考化合物 Danoprevir 和 TMC435 的反应混合物中 HCV NS3/4A 蛋白酶活性的抑制。基于细胞的 HCV 复制子测定是在 10% 胎牛血清 (FBS) 或 40% 正常人血清 (NHS) 存在下，在基因型 1b (con1) 稳定细胞系 HB1 或 gt2a 细胞系 (JFH) 中进行。使用基于 TaqMan 的测定法确定针对一组基因型或突变复制子细胞系的 50% 有效浓度 (EC50)。使用 MTS 测定在 HCV 复制子细胞系中测定 50% 细胞毒性浓度 (CC50)。使用基于细胞的瞬时表型测定来确定针对临床基因型 1 NS3/4A 序列的效力。 NS3/4A 患者分离株是从感染 HCV 的人血浆中克隆出来的。 MDS Pharma Services 进行了广泛的反筛选，评估 MK-5172 在 10 μM 浓度下的抑制效力。细胞测定：将HB1细胞（每孔30,000个）按照药物浓度接种到6孔组织培养板中。第二天（第 0 天），用新鲜培养基和适当药物浓度的 MK-5172 补充培养基。在第 0、1 和 2 天从每个药物浓度的单个孔中收获细胞，洗涤并冷冻保存直至评估。第四个孔在第 3.5 天以类似方式收获，不同之处在于用新鲜培养基和适当药物浓度的 MK-5172 重新接种 30,000 个细胞。对于其他时间点，每半周传代并收获细胞，持续 2 周。第三周，对细胞进行类似处理，不同之处在于细胞接受含有0.5mg/ml G418且不含蛋白酶抑制剂的补充培养基。

MK-5172（Grazoprevir）对慢性 HCV 感染的黑猩猩表现出高体内功效。当给狗给药时，MK-5172 在静脉给药后显示出 5 mL/min/kg 的低清除率和 3 小时的半衰期，并且在口服 1 mg/kg 剂量后具有良好的血浆暴露（AUC=0.4 μM h）。狗肝活检研究表明，口服 1 mg/kg 剂量后 MK-5172 在 24 小时时间点的肝脏浓度为 1.4 μM。与在大鼠中的行为类似，MK-5172 在狗口服给药 24 小时后表现出有效分配到肝组织中并相对于效力保持较高的肝脏浓度。

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体内疗效。[1]
为了证明体内疗效，将Grazoprevir/MK-5172口服给三只慢性HCV感染的黑猩猩，剂量为每公斤1毫克，每天两次，持续7天。其中两只黑猩猩感染了野生型（WT）gt1a或gt1b，病毒滴度很高（约106IU/ml）。第三只黑猩猩的病毒滴度适中（约104IU/ml），为gt1a NS3 R155K病毒。在没有事先用HCV小分子抑制剂进行实验治疗的情况下，这只黑猩猩保持了慢性R155K病毒感染（J.Fontenot，个人通讯）。MK-5172的药效学反应如图4A所示。

所有动物的病毒滴度都立即大幅下降。gt1a（WT）感染在2天内被抑制了约4个对数，达到约100 IU/ml，并且在整个给药过程中保持了病毒抑制。gt1b感染被抑制超过5个对数，达到定量水平（20IU/ml）；在给药期间或给药后都没有出现耐药性的遗传证据。

感染gt1a NS3 R155K的黑猩猩病毒滴度迅速降低了约2-log。在给药期的剩余时间里，病毒载量逐渐上升，只有在停止给药后才恢复到基线水平。在整个研究过程中，R155K突变的病毒是同质的。给药没有引起额外的突变，也没有遗传证据表明给药期间或给药后病毒滴度的波动是由于新出现的耐药变异引起的。

MK-5172/Grazoprevir浓度是从给药最后一剂后12小时收集的匹配血浆和肝活检样本中测定的（表7）。与血浆中的低纳摩尔浓度相比，肝脏中的药物浓度明显更高，范围在0.85至1.99μM之间。这导致肝脏与血浆的比率为425比785。此时，gt1a和gt1b感染的病毒载量减少大于4 log，gt1a NS3 R155K感染的病毒载荷减少大于0.8 log。虽然不能从单一药物剂量确定药代动力学-药效学关系，但病毒载量的减少更能反映肝脏中的药物浓度。

通过比较gt1b感染黑猩猩在相同给药方案下对MK-5172或瓦尼普雷韦的反应，进一步说明了Grazoprevir/MK-5172的体内疗效（图4B）。MK-5172使病毒滴度进一步降低了对数。最终剂量后12小时，MK-5172的肝脏药物浓度也高出约4倍，为1.97μM，而瓦尼普雷韦为0.54μM，表明HCV复制部位的药物暴露更好。

基于两种基因型和临床相关抗性突变体的更大效力、改善的药代动力学、临床前物种中优异的24小时肝脏浓度以及HCV感染黑猩猩的体内疗效，选择Grazoprevir/MK-5172进行临床开发。

重组 HCV NS3/4A 酶从大肠杆菌中表达和纯化。酶序列源自基因型 1a (gt1a) H77、gt1b con1、gt2a JFH1、gt2b HCJ8 和 gt3a NZL1。在时间分辨荧光测定中测定含有 MK-5172 (Grazoprevir)、Vaniprevir 或参考化合物 Danoprevir 和 TMC435 的反应混合物中 HCV NS3/4A 蛋白酶活性的抑制。基于细胞的 HCV 复制子测定在 10% 胎牛血清 (FBS) 或 40% 正常人血清 (NHS) 存在下，在基因型 1b (con1) 稳定细胞系 HB1 或 gt2a 细胞系 (JFH) 中进行。使用基于 TaqMan 的测定法确定针对一组基因型或突变复制子细胞系的 50% 有效浓度 (EC50)。使用 MTS 测定在 HCV 复制子细胞系中测定 50% 细胞毒性浓度 (CC50)。使用基于细胞的瞬时表型测定来确定针对临床基因型 1 NS3/4A 序列的效力。 NS3/4A 患者分离株是从感染 HCV 的人血浆中克隆出来的。 MDS Pharma Services 进行了广泛的反筛选，评估 MK-5172 在 10 μM 浓度下的抑制效力。

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酶实验。[2]
使用NS3/4A蛋白酶活性的时间分辨荧光测定法测定化合物的抑制效力。NS3蛋白酶测定在最终体积为100µL的测定缓冲液中进行，该缓冲液含有50 mM 4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸钠盐（HEPES），pH 7.5，150 mM NaCl，15%甘油，0.15%Triton X-100，10 mM二硫苏糖醇（DTT）和0.1%PEG8000。将NS3蛋白酶与不同浓度的抑制剂在二甲亚砜（DMSO）中预孵育30分钟。通过加入时间分辨荧光（TRF）肽底物（终浓度100nM）引发反应。在室温下1小时后，用100µL 500 mM 2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）（pH 5.5）淬灭NS3介导的底物水解。使用Victor V2或Fusion荧光光度计检测产品荧光，激发波长为340 nm，发射波长为615 nm，延迟400µs。抑制常数是使用标准的四参数拟合数据得出的。从大肠杆菌中表达并纯化编码氨基酸突变R155K、A156T、A156V或D168V的gt1b（BK）、gt3a（NZL1）或gt1b的全长NS3/4A蛋白酶序列。26使用标准分子生物学技术将蛋白酶突变工程化到gt1b表达构建体中。

将 HB1 细胞（每孔 30,000 个）按照药物浓度接种到 6 孔组织培养板中。第二天（第 0 天），用新鲜培养基和适当药物浓度的 Grazoprevir/MK-5172 补充培养基。在第 0、1 和 2 天从每个药物浓度的单个孔中收获细胞，洗涤并冷冻保存直至评估。第四个孔在第 3.5 天以类似方式收获，不同之处在于用新鲜培养基和适当药物浓度的 MK-5172 重新接种 30,000 个细胞。对于其他时间点，每半周传代并收获细胞，持续 2 周。第三周，对细胞进行类似处理，不同之处在于细胞接受含有0.5mg/ml G418且不含蛋白酶抑制剂的补充培养基。

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体外试验。[1]
如前所述，重组HCV NS3/4A酶从大肠杆菌中表达和纯化。酶序列来源于基因型1a（gt1a）H77（GenBank登录号AF09606）、gt1b con1（GenBank注册号AJ238799）、gt2a JFH1（GenBank登陆号AB047639）、gt2b HCJ8（GenBank登入号D10988）和gt3a NZL1（GenBank登记号D17763）。在时间分辨荧光分析中测定了含有Grazoprevir/MK-5172、vaniprevir或参考化合物danoprevir和TMC435（图1）的反应混合物中HCV NS3/4A蛋白酶活性的抑制作用。在10%胎牛血清（FBS）或40%正常人血清（NHS）存在下，在基因型1b（con1）稳定细胞系HB1或gt2a细胞系（JFH）中进行基于细胞的HCV复制子检测。使用基于TaqMan的测定法对基因型或突变复制子细胞系进行50%有效浓度（EC50s）的测定。根据制造商的方案，使用MTS测定法在HCV复制子细胞系中测定50%细胞毒性浓度（CC50）。使用基于瞬时细胞的表型测定法对临床基因型1 NS3/4A序列进行效力测定。NS3/4A患者分离株是从感染HCV的人血浆中克隆的。MDS Pharma Services进行了广泛的反筛选，其中评估了MK-5172在10μM浓度下的抑制效力。

对于体外抗性选择，将100000个HB1细胞接种到T162 Z-top烧瓶中，并在0.5mg/ml G418和所需浓度的Grazoprevir/MK-5172存在下培养。将细胞培养约3周，定期更换培养基，直到发生足够的细胞死亡以形成不同的集落。扩增后，分离总RNA，用作产生NS3/4a cDNA的模板，并使用常规分子生物学技术进行测序。通过与未经处理的细胞产生的序列进行比较，鉴定出突变。

对于2周的效力评估，每种药物浓度每6孔组织培养板的每孔接种30000个HB1细胞。第二天（第0天），用新鲜培养基和适当药物浓度的Grazoprevir补充培养基。在第0、1和2天收获每种药物浓度的单孔细胞，洗涤并冷冻储存直至评估。第四孔在第3.5天同样收获，除了用新鲜培养基和适当药物浓度的Grazoprevir/MK-5172重新接种30000个细胞。对于额外的时间点，细胞每半周传代并收获一次，持续2周。第三周，细胞接受类似的处理，除了细胞接受含有0.5mg/ml G418的补充培养基，不含蛋白酶抑制剂。

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Replicon检测。[2]
使用适于使用原位杂交进行定量分析的HCV双顺反子复制子测定27确定病毒复制的抑制作用。28将稳定转染有HCV复制子RNA（gt 1b con1序列；28 gt 2a JFH序列29）的Huh-7细胞接种到96孔板中，用闪烁剂浸渍，密度为每孔20000个细胞，并在添加了50%NHS的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）存在下，在37°C/5%CO2下孵育24小时。将DMSO中的化合物加入1%，再孵育24小时。用10%甲醛处理细胞，用0.25%Triton X100处理细胞使其透性。加入与复制子的新霉素抗性基因杂交的放射性标记RNA探针，在50°C下杂交18小时，然后进行RNase A处理以去除未杂交的探针并清洗。然后在Topcount NXT中对平板进行计数。抑制常数是使用标准的四参数拟合数据得出的。

大鼠和犬
本研究在大鼠和犬身上进行。格拉佐普韦以聚乙二醇200 (PEG200) 为溶剂配制，在静脉给药的研究中，大鼠的给药剂量为2 mg/kg体重，犬的给药剂量为0.5 mg/kg体重。该化合物的结晶钾盐以PEG400溶液的形式给药，大鼠的给药剂量为5 mg/kg体重，犬的给药剂量为1 mg/kg体重，用于口服给药研究。在每项研究中，均在适当的时间点采集含有EDTA的试管中的血样，并通过离心分离血浆，并将血浆保存在-70°C直至分析。蛋白质沉淀后，使用高效液相色谱/质谱联用 (LC/MS/MS) 法定量格拉佐普韦 (MK-5172) 的浓度。在实验结束时，从大鼠研究中采集肝脏样本。镇静后，从犬只身上取肝活检样本（20 μL）。蛋白质沉淀后，将组织样本在四倍体积的去离子水中匀浆，并使用液相色谱-串联质谱法（LC/MS/MS）测定药物浓度。药代动力学研究。[1] 在对大鼠或犬只进行静脉注射格拉佐普韦/MK-5172的研究中，该化合物配制于聚乙二醇200（PEG200）中，并以2 mg/kg体重（大鼠）或0.5 mg/kg体重（犬）的剂量进行单次静脉注射。在口服研究中，该化合物的结晶钾盐以PEG400溶液的形式给药，剂量为5 mg/kg（大鼠）或1 mg/kg（犬）。所有研究中，均在适当时间采集含EDTA的血液样本，并通过离心分离血浆，然后储存于−70°C直至分析。采用高效液相色谱/串联质谱法（LC/MS/MS）在蛋白质沉淀后定量分析格拉佐普韦/MK-5172的浓度。大鼠研究的肝脏样本在实验结束时采集。对于犬，在镇静后采集肝脏活检样本（约20 μl）。将组织样本在四倍体积的去离子水中匀浆，并在蛋白质沉淀后通过LC/MS/MS测定药物浓度。

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对HCV感染的黑猩猩的研究。[1]
采用线性探针法确定HCV基因型，并通过逆转录PCR（RT-PCR）拯救和HCV遗传物质测序进行确认。感染HCV的黑猩猩通过自愿摄入格拉佐普韦/MK-5172（溶于唐氏饮料）或瓦尼普韦（溶于牛奶）的方式，每日两次（bid）口服给药，剂量为1 mg/kg，持续7天。使用HCV TaqMan检测法测定血浆样本中的病毒载量。血浆或肝脏活检样本中格拉佐普韦/MK-5172的药物浓度测定方法如上所述（见“药代动力学研究”部分）。病毒耐药性分析按照先前发表的方案进行。药代动力学。[2]在清醒的雄性Sprague-Dawley大鼠（300-500 g；每项研究n=2-3）或雄性和雌性比格犬（13-15 kg；每项研究n=3）中进行试验药物的药代动力学表征。将化合物（例如格拉佐普韦）静脉注射给禁食的大鼠和犬。化合物溶于二甲基亚砜 (DMSO) 中，以推注方式给药（分别为 1.0 和 0.1 mL/kg）。对于大鼠和犬的口服研究，化合物以聚乙二醇 400 (PEG400) 溶液的形式给药（2.0 mL/kg）。典型剂量为大鼠静脉注射 2 mg/kg 和口服 5 mg/kg，犬静脉注射 0.5 mg/kg 和口服 1 mg/kg。在单次给药后 24 小时内的多个时间点采集血样，用于测定受试药物的血浆浓度。在大鼠的终点时间点采集肝脏样本，在犬的终点时间点进行肝脏活检。肝脏样本在分析前用缓冲液匀浆。采用液液萃取和液相色谱-质谱联用 (LC/MS) 分析血浆和肝脏样本，并使用适当的标准品和质控品。使用Watson软件计算药代动力学参数。

吸收、分布和排泄
格拉佐普韦给药后0.5-3小时达到血浆峰浓度。格拉佐普韦的绝对生物利用度为27%。与食物同服时，格拉佐普韦的峰浓度增加2.8倍，但这种暴露量的增加被认为不具有临床意义。
格拉佐普韦主要经粪便排泄（90%），经尿液排泄量极少（<1%）。
格拉佐普韦的表观分布容积估计为1250升。据认为，它主要分布于肝脏，其吸收由有机阴离子转运多肽1B1/3促进。
格拉佐普韦的清除率尚未确定。

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代谢/代谢物
格拉佐普韦部分通过CYP3A介导的氧化代谢消除。在人血浆中未检测到循环代谢物。

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生物半衰期
在HCV感染者中，格拉佐普韦的几何平均表观末端半衰期为31小时。

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化合物15/格拉佐普韦钾盐的药代动力学性质在多种动物模型中进行了评估（表3）。在大鼠中，化合物15的血浆清除率为28 mL/min/kg，血浆半衰期为1.4小时。口服5 mg/kg剂量后，化合物15的血浆暴露量良好，AUC为0.7 μM·h。该化合物的肝脏暴露量也相当好（4小时时为23 μM），单次口服5 mg/kg剂量后24小时，化合物15仍存在于肝脏中。 24 小时后，化合物 15 的肝脏浓度为 0.2 μM，比使用 50% NHS 进行复制子试验的 IC50 值高 25 倍以上。
对犬给药时，化合物 15/格拉佐普韦 (Grazoprevir) 静脉给药后清除率低至 5 mL/min/kg，半衰期为 3 小时，口服 1 mg/kg 后血浆暴露量良好（AUC = 0.4 μM·h）。犬肝脏活检研究表明，口服 1 mg/kg 后 24 小时，化合物 15 的肝脏浓度为 1.4 μM。与在大鼠中的表现类似，化合物 15 在犬体内能有效分配到肝组织中，并在口服给药 24 小时后仍保持较高的肝脏浓度（相对于其效力而言）。[2]

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妊娠期和哺乳期影响
◉ 哺乳期用药概述
格拉佐普韦尚未在接受丙型肝炎治疗的哺乳期妇女中进行研究。由于其与母体血浆蛋白的结合率超过98.9%，因此母乳中的含量可能非常低。一些资料建议，当格拉佐普韦与利巴韦林联合使用时，应避免母乳喂养。
丙型肝炎不会通过母乳传播，并且母乳已被证明可以灭活丙型肝炎病毒（HCV）。然而，美国疾病控制与预防中心建议，如果HCV感染的母亲乳头皲裂或出血，则应考虑停止母乳喂养。目前尚不清楚此警告是否适用于正在接受丙型肝炎治疗的母亲。
HCV感染母亲所生的婴儿应接受HCV感染检测；由于母体抗体在婴儿出生后的前18个月以及婴儿产生免疫反应之前一直存在，因此建议进行核酸检测。
◉ 对母乳喂养婴儿的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。
◉ 对哺乳和母乳的影响
截至修订日期，未找到相关的已发表信息。

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蛋白结合
格拉佐普韦与血浆蛋白的结合率超过98.8%。它与人血清白蛋白和α1-酸性糖蛋白均有结合。

[1]. MK-5172, a selective inhibitor of hepatitis C virus NS3/4a protease with broad activity across genotypes and resistant variants. Antimicrob Agents Chemother. 2012 Aug;56(8):4161-7.

[2]. Discovery of MK-5172, a Macrocyclic Hepatitis C Virus NS3/4a Protease Inhibitor. ACS Med Chem Lett. 2012 Mar 2;3(4):332-6.

[3]. Bardoxolone and bardoxolone methyl, two Nrf2 activators in clinical trials, inhibit SARS-CoV-2 replication and its 3C-like protease. Signal Transduct Target Ther. 2021 May 29;6(1):212.

格拉佐普韦是一种氮杂大环化合物，属于丙型肝炎蛋白酶抑制剂，与艾尔巴韦（商品名：泽帕替尔）联合用于治疗成人慢性丙型肝炎病毒（HCV）1型或4型感染。它具有抗病毒、保肝和丙型肝炎蛋白酶抑制的多重作用。格拉佐普韦是一种氮杂大环化合物，属于氨基甲酸酯、内酰胺、芳香醚、环丙烷类化合物、N-磺酰基甲酰胺和喹喔啉衍生物。
格拉佐普韦是一种直接抗病毒药物，作为联合疗法的一部分，用于治疗慢性丙型肝炎。慢性丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的传染性肝病。HCV是一种单链RNA病毒，分为九种不同的基因型，其中1型基因型在美国最为常见，占所有慢性HCV感染患者的72%。自2011年以来，随着格拉瑞韦等直接抗病毒药物（DAAs）的研发，慢性丙型肝炎的治疗选择取得了显著进展。格拉瑞韦是一种NS3/4A抑制剂，NS3/4A是一种丝氨酸蛋白酶，由HCV基因1型和4型编码[合成]。这些酶对病毒复制至关重要，它们将病毒编码的多聚蛋白切割成成熟的蛋白质，例如NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。与另一类DAAs——NS5B抑制剂相比，NS3/4A抑制剂的耐药性产生屏障较低。已知氨基酸155、156或168位的氨基酸替换会导致耐药性。由H58、D82和S139组成的酶催化三联体的氨基酸替换也可能改变药物对NS3/4A的亲和力或酶本身的活性。尽管存在上述缺点，格拉瑞韦仍然对丙型肝炎病毒（HCV）有效，尤其是在与[DB11574]联合使用时。美国肝病研究协会（AASLD）和美国传染病学会（IDSA）在2016年联合发布的指南中推荐格拉瑞韦与[DB11574]联合作为丙型肝炎病毒1a、1b和4型基因型的一线治疗方案。格拉瑞韦和[DB11574]可与[DB00811]联合使用，或单独使用，旨在治愈或达到持续病毒学应答（SVR），每日治疗12周后即可达到。SVR和HCV感染的根除与显著的长期健康获益相关，包括减少肝脏相关损伤、提高生活质量、降低肝细胞癌的发病率以及降低全因死亡率。格拉瑞韦是一种与[DB11574]（商品名Zepatier）的固定剂量组合产品，用于治疗慢性丙型肝炎。Zepatier于2016年1月获得FDA批准，适用于治疗HCV基因1型和4型，可联合或不联合[DB00811]，具体取决于NS5A蛋白中是否存在与耐药性相关的氨基酸替换，以及之前使用[DB00811]、[DB00008]、[DB00022]或其他NS3/4A抑制剂（如[DB08873]、[DB06290]或[DB05521]）治疗失败的情况。格拉佐普韦与[DB11574]联合使用，组成复方制剂Zepatier，在治疗12周后，基因1型患者的持续病毒学应答率(SVR)为94%至97%，基因4型患者的SVR为97%至100%。该复方制剂可用于代偿性肝硬化、合并人类免疫缺陷病毒感染或严重肾病患者。
无水格拉佐普韦是一种丙型肝炎病毒NS3/4A蛋白酶抑制剂。无水格拉佐普韦的作用机制是作为HCV NS3/4A蛋白酶抑制剂、乳腺癌耐药蛋白抑制剂和细胞色素P450 3A抑制剂。

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药物适应症
格拉佐普韦与[DB11574]（以固定剂量复方制剂Zepatier的形式）联合使用，可单独使用或与[DB00811]联合使用，用于治疗成人慢性HCV基因1a、1b或4型感染。
FDA标签
治疗慢性丙型肝炎

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作用机制
格拉佐普韦是一种第二代NS3/4a蛋白酶抑制剂，用于抑制HCV病毒复制。 NS3/4a蛋白酶是病毒复制的组成部分，介导病毒编码的多聚蛋白裂解为成熟蛋白（NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）。格拉瑞韦可抑制HCV基因1a、1B和4型的NS3/4蛋白酶，其IC50值分别为7 pM、4 pM和62 pM。HCV NS3/4a蛋白酶抑制剂已被证实是治疗慢性丙型肝炎病毒感染的有效药物，其中博赛普韦和特拉普韦近期已获批准作为聚乙二醇干扰素/利巴韦林联合疗法的附加疗法，用于治疗基因1型感染患者。克服抗病毒耐药性、广泛的基因型覆盖范围以及便捷的给药方案是未来无需干扰素即可联合使用的药物的重要特性。本文报道了新型P2-P4喹喔啉大环NS3/4a蛋白酶抑制剂Grazoprevir/MK-5172的临床前研究结果，该化合物目前正处于临床开发阶段。该化合物对涵盖主要丙型肝炎病毒（HCV）基因型以及对早期蛋白酶抑制剂耐药变异株的多种酶谱均表现出亚纳摩尔级的活性。在复制子筛选中，MK-5172发挥了高选择压力，仅产生了极少的耐药菌落。在大鼠和犬体内，MK-5172均表现出良好的血浆和肝脏暴露量，24小时肝脏浓度提示每日一次给药即可。当给感染慢性gt1a或gt1b型HCV的黑猩猩服用MK-5172时，以1 mg/kg体重每日两次（bid）的剂量给药，持续7天，可使病毒载量降低4至5个对数级。根据其临床前研究结果，MK-5172 预计对多种 HCV 基因型和具有临床意义的耐药变异株具有广泛的活性，非常适合纳入新型全口服治疗方案。[1]表型分析表明，格拉佐普韦/MK-5172 对来自 HCV 感染患者血浆的 1a 和 1b 基因型序列的遗传多样性样本均保持了活性。在临床前动物模型中，MK-5172 表现出良好的药代动力学特征，具有良好的血浆浓度，同时保持了与之前报道的瓦尼普韦类似的肝脏高浓度。重要的是，中等口服剂量在临床前动物模型中可使 24 小时肝脏浓度远高于体外 EC50 值。耐药性筛选实验表明，即使在低浓度下，MK-5172 也仅诱导少量菌落形成。 MK-5172 在体内对感染慢性丙型肝炎病毒 (HCV) 的黑猩猩表现出中等剂量的高效性，包括与在同一动物身上以相同剂量和频率交替使用瓦尼普韦 (vaniprevir) 相比，其病毒载量抑制效果更佳。这些特性共同表明，MK-5172 是一种比目前正在研发的 HCV 蛋白酶抑制剂效力更高的抑制剂，具有改善 HCV 治疗方案的潜力。事实上，在健康志愿者和 HCV 感染患者中进行的早期 I 期研究表明，MK-5172 具有良好的临床前特征，可转化为临床有效的药物，对多种 HCV 基因型具有广泛的活性，并且具有良好的药代动力学特征，提示可每日一次 (QD) 给药。[1]

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利用分子建模策略设计了一种新型的含有 P2 至 P4 大环约束的 HCV NS3/4a 蛋白酶抑制剂。基于先前临床化合物的特性，并探索该系列化合物的P2和连接区，我们优化了其对多种基因型和突变酶的抑制效力、细胞活性以及口服给药后大鼠肝脏的暴露量。这些研究最终鉴定出临床候选药物15（格拉佐普韦），该药物对1-3型NS3/4a基因型及临床相关的突变酶具有活性，并且在多种动物模型中均具有良好的血浆暴露量和优异的肝脏暴露量。[2] 总之，对3a基因型活性的初步筛选以及分子建模，我们发现了一系列P2喹啉大环化合物，这些化合物对NS3/4a基因型和临床观察到的1b基因型突变酶均具有优异的广谱活性。我们针对该系列化合物在临床前动物模型中的酶活性和肝脏暴露量进行了优化。化合物 15 是在该系列化合物中引入弱碱性喹喔啉 P2 杂环而得到的，旨在解决与碱性更强的喹啉 P2 杂环发生歧化反应的问题。我们认为，化合物 15 良好的药代动力学特性和广泛的酶抑制活性使其有望成为重要的第二代 NS3/4a 蛋白酶抑制剂，并可能成为丙型肝炎全口服治疗方案的基石。目前正在进行化合物 15（格拉佐普韦）的进一步研究，包括药代动力学和疗效的临床研究。[2]

C38H50N6O9S

766.9

766.335

C, 59.51; H, 6.57; N, 10.96; O, 18.78; S, 4.18

1350514-68-9

Grazoprevir potassium salt;1206524-86-8;Grazoprevir hydrate;1350462-55-3;Grazoprevir sodium salt;1425038-27-2

44603531

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1.633

3.93

203.6

3

11

8

54

1580

7

S(C1([H])C([H])([H])C1([H])[H])(N([H])C([C@]1(C([H])([H])[C@@]1([H])C([H])=C([H])[H])N([H])C([C@]1([H])C([H])([H])[C@]2([H])C([H])([H])N1C([C@]([H])(C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])N([H])C(=O)O[C@]1([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1C(=NC3C([H])=C(C([H])=C([H])C=3N=1)OC([H])([H])[H])O2)=O)=O)=O)(=O)=O

OBMNJSNZOWALQB-NCQNOWPTSA-N

InChI=1S/C38H50N6O9S/c1-6-22-19-38(22,35(47)43-54(49,50)25-13-14-25)42-32(45)29-18-24-20-44(29)34(46)31(37(2,3)4)41-36(48)53-30-16-21(30)10-8-7-9-11-27-33(52-24)40-28-17-23(51-5)12-15-26(28)39-27/h6,12,15,17,21-22,24-25,29-31H,1,7-11,13-14,16,18-20H2,2-5H3,(H,41,48)(H,42,45)(H,43,47)/t21-,22-,24-,29+,30-,31-,38-/m1/s1

(33R,35S,91R,92R,5S)-5-(tert-butyl)-N-((1R,2S)-1-((cyclopropylsulfonyl)carbamoyl)-2-vinylcyclopropyl)-17-methoxy-4,7-dioxo-2,8-dioxa-6-aza-1(2,3)-quinoxalina-3(3,1)-pyrrolidina-9(1,2)-cyclopropanacyclotetradecaphane-35-carboxamide

MK5172; MK 5172; Grazoprevir; 1350514-68-9; Grazoprevir anhydrous; Grazoprevir [INN]; MK-5172 ANHYDROUS; 8YE81R1X1J; Trade name: Zepatier‎; 1350514-68-9; MK-5172; Grazoprevir anhydrous; MK5172; Grazoprevir [INN]; MK-5172 ANHYDROUS; 8YE81R1X1J;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 50~100 mg/mL ( 65.20~130.39 mM )
Ethanol : 66.67~100 mg/mL(86.93 mM )

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.26 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.26 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 10% DMSO+40% PEG300+5% Tween-80+45% Saline: ≥ 2.5 mg/mL (3.26 mM)

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配方 4 中的溶解度: 12.5 mg/mL (16.30 mM) in 100% PEG-300 (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。