GSK-7975A

CRAC channel
GSK-7975A targets ORAI1 (the pore-forming subunit of the Ca2+ release-activated Ca2+ channel). In murine pancreatic acinar cells, it inhibits thapsigargin-induced SOCE with an IC50 of ~3.4 μM [3].

在 3 μM 浓度下，GSK-7975A 可使组胺、白三烯 C4 和细胞因子（TNFα、IL-5/IL-8/IL-13 和 TNFα）的释放降低 50%，同时还能减少 FcεRI 依赖的 Ca2+ 内流 [1]。GSK-7975A 可增加 T 细胞中炎症细胞因子的完全释放，并抑制多种动物肥大细胞中培养基的释放。GSK-7975A 可抑制 CRAC 通道介导的钙离子内流。这导致不同浓度制剂中肥大细胞的活性均受到抑制。GSK-7975A 不抑制小鼠和豚鼠肥大细胞中细胞因子的释放，但可完全抑制小鼠 T 细胞中细胞因子的释放 [2]。在人胰腺肺泡细胞中，GSK-7975A 可抑制毒素诱导的 ORAI1 激活，该激活继发于 Ca2+ 释放和/或 Ca2+ 电流激活，且抑制率在对照细胞中超过 90%。在小鼠中，GSK-7975A 可阻止人胰腺肺泡细胞坏死的发生 [3]。GSK-7975A 以浓度依赖的方式抑制分离的小鼠和人胰腺腺泡细胞中毒素诱导的 SOCE 和胞质 Ca2+ 超载。在小鼠细胞中，使用 30 μM GSK-7975A 可抑制 TLCS (500 μM) 诱导的 [Ca2+]c 平台期约 80%，而使用 15 μM GSK-7975A 可抑制 CCK (1 nM) 诱导的 [Ca2+]c 超过 95%。在 50 μM 浓度下，GSK-7975A 仍保持疗效，但在 100 μM 浓度下，由于未知机制，观察到疗效丧失 [3]。
在人胰腺腺泡细胞中，GSK-7975A (10–50 μM) 抑制了毒胡萝卜素诱导的 SOCE，并且 30 μM 的 GSK-7975A 显著降低了 TLCS (500 μM) 诱导的坏死性细胞死亡通路激活，该激活通过碘化丙啶摄取量来测定 [3]。
GSK-7975A 还能保护分离的小鼠胰腺腺泡细胞免受 TLCS 诱导的坏死：标准化 PI 摄取量从 100（单独使用 TLCS）降低到 GSK-7975A (30 μM) 的 ~20 [3]。

在 TLCS-AP、CER-AP 和 FAEE-AP 中，GSK-7975A 以剂量和时间依赖的方式抑制急性胰腺炎的全身和局部反应。仅在低剂量下，GSK-7975A 才显著降低肺部 MPO 水平；在高剂量下，它显著降低了胰腺 MPO 水平、IL-6 和血清淀粉酶水平。 GSK-7975A 可显著减轻 TLCS-AP、CER-AP 和 FAEE-AP 小鼠模型的胰腺组织病理学改变 [3]。
在三种急性胰腺炎小鼠模型（TLCS-AP、CER-AP 和 FAEE-AP）中，皮下渗透泵给予前药 GSK-6288B（可在体内快速释放 GSK-7975A），低剂量（28 mg/kg/h）和高剂量（110 mg/kg/h）均可显著减轻疾病的局部和全身症状。在 TLCS-AP 模型中，两种剂量均可降低血清淀粉酶、IL-6 和胰腺 MPO 水平；肺 MPO 水平仅在低剂量组降低。组织病理学（水肿、炎症、坏死、总评分）均得到改善，且高剂量组效果更佳。在CER-AP模型中，两种剂量均降低了血清淀粉酶、胰蛋白酶和MPO水平；低剂量还降低了IL-6和肺MPO水平。高剂量显著降低了所有组织病理学参数，使其接近对照水平。在FAEE-AP模型中，低剂量降低了胰腺和肺MPO水平；高剂量降低了血清淀粉酶、IL-6、胰蛋白酶水平以及组织病理学指标（水肿、炎症、坏死、总评分）。治疗分别在 TLCS-AP 组、CER-AP 组和 FAEE-AP 组在疾病诱导后 30 分钟开始，或在第二次注射西鲁林后 1 小时开始 [3]。
当 TLCS-AP 和 FAEE-AP 组中，将 GSK-7975A（高剂量）给药延迟至疾病诱导后 6 小时时，其疗效不如早期治疗，血清淀粉酶、IL-6（TLCS-AP）、水肿、炎症浸润（TLCS-AP）和总组织病理学评分均有显著差异 [3]。

构成钙释放激活钙 (CRAC) 通道的两种关键蛋白的功能缺失突变表明，该离子通道在免疫细胞功能中发挥着至关重要的作用。本研究旨在利用人、大鼠、小鼠和豚鼠的细胞制备物，在体外证明使用高选择性 CRAC 通道抑制剂可以抑制免疫细胞活化。我们测试了两种选择性小分子 CRAC 通道阻滞剂 GSK-5498A 和 GSK-7975A，以验证它们抑制肥大细胞释放介质和 T 细胞释放促炎细胞因子的能力。结果表明，GSK-5498A 和 GSK-7975A 均能完全抑制钙离子通过 CRAC 通道的内流，从而抑制多种人和大鼠细胞制备物中肥大细胞介质和 T 细胞因子的释放。豚鼠和小鼠的肥大细胞不受 GSK-5498A 或 GSK-7975A 的抑制；然而，小鼠 T 细胞的细胞因子释放被完全阻断。GSK-5498A 和 GSK-7975A 证实了 CRAC 通道在人肥大细胞和 T 细胞功能中的关键作用，并且体外实验也证实了其抑制作用。大鼠的药理学特性与人类相似，因此该物种适合用于未来开展此类分子的体内研究。这些观察结果共同为鉴定适用于临床开发治疗炎症性疾病的 CRAC 阻滞剂迈出了关键一步。[2]

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膜片钳电生理学[1]
采用之前描述过的全细胞膜片钳技术。在一些实验中，也使用斜坡电压方案诱发电流，该方案包括从 -120 mV 到 +120 mV 的连续电压斜坡。更多详情请参见本文的在线补充材料，网址为 www.jacionline.org。
根据需要，将 CRACM 通道阻滞剂 GSK-7975A 和 Synta-6627、Gd3+ 和 La3+ 直接添加到记录室中。GSK-7975A 是专利 WO 2010/1222089 中的化合物 36。

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使用 Fura-2 荧光法测量了 GSK-7975A 对分离的小鼠或人胰腺腺泡细胞胞质钙浓度 ([Ca2+]c) 的影响。细胞用 5 μM Fura-2 加载，激发波长为 340 nm 和 380 nm，发射波长 >490 nm。记录比值 (340/380)。在SOCE实验中，细胞在零胞外Ca2+浓度下用thapsigargin处理（以耗尽Ca2+储存），然后重新引入胞外Ca2+（1.8 mM或5 mM）；并加入指定浓度的GSK-7975A。或者，用TLCS（500 μM）或超最大浓度CCK（1 nM）灌注细胞以诱导持续的[Ca2+]c升高，并在达到稳定平台期后加入GSK-7975A[3]。
坏死性细胞死亡通路激活通过碘化丙啶（PI）摄取进行评估。分离的胰腺腺泡细胞在室温下用TLCS（500 μM）±GSK-7975A处理30分钟，并以1000 rpm的转速轻柔摇动。洗涤后，用PI（1 μM）和Hoechst 33342（50 μg/ml）对细胞进行染色。Hoechst染色用于细胞核计数，PI用于检测细胞膜破裂。使用共聚焦显微镜对细胞进行成像（PI激发波长488 nm，发射波长630–693 nm；Hoechst激发波长364 nm，发射波长405–450 nm）。每个处理组至少计数3个孔和至少12个随机视野中的PI阳性细胞百分比[3]。

通过导管注射牛磺石胆酸-3-硫酸酯或静脉注射西鲁林或乙醇和棕榈油酸，在C57BL/6J小鼠中诱导急性胰腺炎。随后，在不同时间点给予部分小鼠GSK-7975A或CM_128（ORAI1抑制剂），以评估其局部和全身效应。GSK-7975A和CM_128均能以浓度依赖的方式抑制毒素诱导的ORAI1激活和/或Ca²⁺释放后Ca²⁺电流的激活，在小鼠和人胰腺腺泡细胞中均观察到此现象（抑制率>90%，高于对照细胞）。ORAI1抑制剂还能阻止小鼠和人胰腺腺泡细胞中坏死性细胞死亡途径的激活。 GSK-7975A 和 CM_128 均能以剂量和时间依赖的方式抑制所有 3 种急性胰腺炎模型的局部和全身特征。在胰腺炎诱导后 1 小时给药时，这些药物在多种参数上均表现出显著更高的疗效。[3]

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腹腔注射 GSK-7975A 还会延缓小鼠出生后第 6 天视网膜血管的发育，因为它会缩短血管长度并减少血管连接数量，同时增加血管腔隙。此外，我们发现 SARAF 和 Orai1 参与了 VEGF 介导的 [Ca2+]i 升高，并且使用 siRNA 敲低它们会损害 HUVEC 的管状结构形成、增殖和迁移。最后，免疫染色和原位邻位连接分析表明，SARAF 可能与 HUVEC 中的 Orai1 相互作用。因此，这些发现首次揭示了SARAF和Orai1在内皮细胞中的功能性相互作用，并强调了它们在血管生成过程不同阶段的关键作用。[4]

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动物：10周龄雄性C57BL/6J小鼠（约25克）。GSK-7975A通过其磷酸盐前药GSK-6288B，使用皮下ALZET渗透泵（型号2001D）进行持续给药。测试了三种剂量：GSK-6288B分别为2、28（低）和110（高）mg/kg/h。对照组小鼠通过微型泵接受载体（生理盐水或适当溶剂）[3]。
TLCS-AP模型：使用输液泵以5 μl/min的流速，经胰管逆行灌注牛磺石胆酸3-硫酸盐（TLCS，3 mM）10分钟，诱导急性胆源性胰腺炎。TLCS灌注30分钟后，皮下植入微型泵。小鼠分别于6小时或24小时后处死[3]。
CER-AP模型：通过每隔一小时腹腔注射一次胰泌素（50 μg/kg），共7小时，诱导高刺激性胰腺炎。在第三次注射胰泌素时植入微型泵。小鼠在首次注射胰泌素12小时后处死[3]。
FAEE-AP模型：通过每隔一小时腹腔注射棕榈油酸（150 mg/kg）和乙醇（1.35 g/kg）诱导酒精性胰腺炎。第二次注射后1小时植入微型泵。小鼠在 6 小时或 24 小时后处死 [3]。
对于延迟治疗实验，在 TLCS-AP 和 FAEE-AP 模型中，于疾病诱导后 6 小时进行 GSK-6288B（高剂量，110 mg/kg/h）微型泵植入，并在 24 小时评估参数 [3]。
测量的终点包括：血清淀粉酶（罗氏分析仪）、血清 IL-6（ELISA）、胰蛋白酶活性（使用 Boc-Gln-Ala-Arg-MCA 底物的荧光测定）、胰腺和肺中的髓过氧化物酶 (MPO) 活性（使用 3,3,5,5-四甲基联苯胺的比色测定）以及胰腺组织病理学（H&E 染色，由不知晓分组情况的研究人员根据 0-3 分制对水肿、炎症和坏死进行评分）[3]。

GSK-7975A 以磷酸盐前药 GSK-6288B 的形式，通过皮下渗透泵给药。稳态血药浓度：低剂量（28 mg/kg/h，GSK-6288B）达到约 4.3 μM GSK-7975A；高剂量（110 mg/kg/h）达到约 13.3 μM。胰腺浓度：低剂量约 8.9 μM，高剂量约 49.3 μM。在任何剂量或时间点，均未在血液或胰腺中检测到前药，表明其迅速转化为 GSK-7975A。微型泵植入后，低剂量组1小时或高剂量组4小时即可达到稳态[3]。
蛋白结合：在血液和胰腺匀浆中，采用快速平衡透析（RED）法测定GSK-7975A的结合情况。如讨论部分所述，游离部分<10%（即结合部分>90%）[3]。
GSK-7975A对小鼠胰腺腺泡细胞SOCE抑制的IC50约为3.4 μM；对T淋巴细胞的IC50约为1 μM[3]。

采用快速平衡透析 (RED) 法，使用透析特氟龙块和透析膜条评估了GSK-7975A的血浆蛋白结合率。血液收集于肝素化试管中，并用 PBS（pH 7.4）以 1:1 的比例稀释。胰腺匀浆以 1:10 的比例稀释。样品在 37 °C 下用 PBS 透析 5 小时（血液）或 4 小时（胰腺）。达到平衡后，使用 LC-MS/MS 测定样品室和缓冲液室中的浓度。结合百分比计算公式为 ([C]样品 – [C]缓冲液)/[C]样品 × 100% [3]。未报告明显的毒性或 LD50 数据。体外实验表明，在 100 μM 浓度下，GSK-7975A 的疗效降低，但机制未知；而在 50 μM 浓度下未观察到这种疗效降低 [3]。

[1]. Ashmole I, et al. CRACM/Orai ion channel expression and function in human lung mast cells. J Allergy Clin Immunol. 2012 Jun;129(6):1628-35.e2.
[2]. Rice LV, et al. Characterization of selective Calcium-Release Activated Calcium channel blockers in mast cells and T-cells from human, rat, mouse and guinea-pig preparations. Eur J Pharmacol. 2013 Mar 15;704(1-3):49-57.
[3]. Wen L, et al. Inhibitors of ORAI1 Prevent Cytosolic Calcium-Associated Injury of Human Pancreatic Acinar Cells and Acute Pancreatitis in 3 Mouse Models. Gastroenterology. 2015 Aug;149(2):481-92.e7.
[4]. SARAF and Orai1 Contribute to Endothelial Cell Activation and Angiogenesis. Front Cell Dev Biol . 2021 Mar 4:9:639952.

背景：细胞外Ca²⁺流入人肺肥大细胞（HLMCs）对于FcεRI依赖性释放预先形成的颗粒衍生介质以及新合成的自身活性物质和细胞因子至关重要。然而，介导这种Ca²⁺内流的离子通道尚不清楚。最近发现的CRACM/Orai离子通道家族成员，携带Ca²⁺释放激活的Ca²⁺电流，是潜在的候选者。[1]
目的：探讨CRACM通道在HLMCs中的表达和功能。[1]
方法：检测纯化的HLMCs和分离的人支气管中CRACM mRNA、蛋白和功能表达。[1]
结果：在HLMCs中检测到CRACM1、-2和-3 mRNA转录本以及CRACM1和-2蛋白。在FcεRI依赖性激活后的HLMC细胞以及经30 μM肌醇三磷酸透析的HLMC细胞中均检测到了CRACM样电流。两种条件下获得的Ca²⁺选择性电流均可被10 μM La³⁺和Gd³⁺（已知的CRACM通道阻滞剂）以及两种不同的特异性CRACM通道阻滞剂GSK-7975A和Synta-66阻断。两种阻滞剂均能降低FcεRI依赖性Ca²⁺内流，3 μM GSK-7975A和Synta-66可使组胺、白三烯C₄和细胞因子（IL-5/IL-8/IL-13和TNFα）的释放减少高达50%。Synta-66还能抑制离体组织中过敏原依赖性支气管平滑肌收缩。 [1]
结论：CRACM通道、CRACM样电流的存在，以及CRACM通道阻滞剂对HLMC Ca(2+)内流、介质释放和过敏原诱导的支气管平滑肌收缩的功能性抑制，支持CRACM通道在FcεRI依赖性HLMC分泌中的作用。因此，CRACM通道是治疗哮喘及相关过敏性疾病的潜在靶点。[1]

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背景与目的：胞质钙浓度的持续升高会导致胰腺腺泡细胞损伤和坏死。ORAI1是一种由钙释放激活的钙调节因子，是胰腺腺泡细胞中最丰富的Ca(2+)内流通道；它维持暴露于诱导性胰腺炎毒素的小鼠体内的钙超载。我们研究了ORAI1在小鼠胰腺腺泡细胞损伤和急性胰腺炎发生发展中的作用。 [3]
方法：将小鼠和人腺泡细胞以及转染人ORAI1和人基质相互作用分子1的HEK 293细胞进行过度刺激或与人胆汁酸、类胡萝卜素或环吡唑酸孵育，以诱导钙离子内流。向部分细胞中加入GSK-7975A或CM_128，并通过共聚焦显微镜、视频显微镜和膜片钳记录进行分析。通过导管内注射牛磺酸3-硫酸盐或静脉注射cilulin或乙醇和棕榈油酸，在C57BL/6J小鼠中诱导急性胰腺炎。随后，在不同时间点用ORAI1抑制剂GSK-7975A或CM_128治疗部分小鼠，以评估其局部和全身效应。 [3]
结果：GSK-7975A 和 CM_128 均以浓度依赖的方式抑制毒素诱导的 ORAI1 激活和/或 Ca²⁺ 释放后小鼠和人胰腺腺泡细胞中 Ca²⁺ 电流的激活（对照细胞的抑制率超过 90%）。ORAI1 抑制剂还能阻止小鼠和人胰腺腺泡细胞中坏死性细胞死亡通路的激活。GSK-7975A 和 CM_128 均以剂量和时间依赖的方式抑制所有三种急性胰腺炎模型中的所有局部和全身特征。与诱导后 6 小时给药相比，诱导后 1 小时给药在多个参数上显示出显著更高的疗效。[3]
结论：细胞质钙超载（由 ORAI1 介导）是急性胰腺炎发病机制的一部分。ORAI1 抑制剂有望用于治疗胰腺炎患者。 [3]

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GSK-7975A（CAS# 1253186-56-9）是一种选择性ORAI1抑制剂。其化学名称为2,6-二氟-N-(1-(4-羟基-2-(三氟甲基)苄基)-1H-吡唑-3-基)苯甲酰胺。磷酸盐前药GSK-6288B在体内可快速裂解释放GSK-7975A。该化合物由葛兰素史克公司开发，已被证实可预防人和小鼠胰腺腺泡细胞的胞质钙相关损伤，并可改善三种小鼠模型（胆汁性、过度刺激性和酒精性）的急性胰腺炎。治疗窗口期为疾病发作早期；延迟给药（6小时）会降低疗效。 GSK-7975A抑制免疫细胞（例如T淋巴细胞）中的SOCE，IC50约为1 μM，这可能有助于其抗炎作用[3]。

C18H12F5N3O2

397.298801422119

397.084

C, 54.42; H, 3.04; F, 23.91; N, 10.58; O, 8.05

1253186-56-9

59547990

White to off-white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

462.2±45.0 °C at 760 mmHg

233.3±28.7 °C

0.0±1.2 mmHg at 25°C

1.574

2.88

67.2Ų

2

8

4

28

540

0

FC(C1C=C(C=CC=1CN1C=CC(NC(C2C(=CC=CC=2F)F)=O)=N1)O)(F)F

CPYTVBALBFSXSH-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C18H12F5N3O2/c19-13-2-1-3-14(20)16(13)17(28)24-15-6-7-26(25-15)9-10-4-5-11(27)8-12(10)18(21,22)23/h1-8,27H,9H2,(H,24,25,28)

2,6-difluoro-N-(1-(4-hydroxy-2-(trifluoromethyl)benzyl)-1H-pyrazol-3-yl)benzamide

GSK-7975A; GSK 7975A; GSK7975A; GSK-7975; GSK 7975; GSK7975; GSK-7975A; 1253186-56-9; 2,6-difluoro-N-(1-(4-hydroxy-2-(trifluoromethyl)benzyl)-1H-pyrazol-3-yl)benzamide; CHEMBL4570175; 2,6-difluoro-N-[1-[[4-hydroxy-2-(trifluoromethyl)phenyl]methyl]pyrazol-3-yl]benzamide; 2,6-difluoro-N-(1-{[4-hydroxy-2-(trifluoromethyl)phenyl]methyl}pyrazol-3-yl)benzamide; SCHEMBL705705; GSK7975A;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 90 mg/mL (~226.53 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.29 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。