GSK1016790A

TRPV4/transient receptor potential vanilloid 4

GSK1016790A (0.1-1000 nM) 当添加到表达人 TRPV4 的小鼠和人胚胎肾 (HEK) 细胞中时，会引起 Ca2+ 流入（EC50 值为 18 和 2.1 nM），并且在剂量为 1 nM 时，TRPV4 全细胞电流。在部分神经元中，(100 nM) 处理会导致细胞内 Ca2+ 快速升高 [2]。

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TRP超家族的瞬时受体电位（TRP）香草醛4（TRPV4）成员最近与许多生理过程有关。在这项研究中，我们描述了一种小分子TRPV4通道激活剂（N-（1S）-1-{[4-（2S）-2-{[（2,4-二氯苯基）磺酰基]氨基}-3-羟基丙酰基）-1-哌嗪基]羰基}-3-甲基丁基）-1-苯并噻吩-2-甲酰胺（GSK1016790A），我们将其用作研究TRPV4在膀胱中作用的有价值的工具。GSK1016790A在小鼠和表达人TRPV4的人胚胎肾（HEK）细胞中引发Ca2+内流（EC50值分别为18和2.1 nM），并且在浓度高于1 nM时，它引发TRPV4全细胞电流的剂量依赖性激活。相比之下，TRPV4激活剂4α佛波醇12,13-癸酸酯（4αPDD）在激活TRPV4电流方面的效力比GSK1016790A低300倍。在TRPV4+/+小鼠膀胱平滑肌（UBSM）和尿道上皮中检测到TRPV4 mRNA。Western印迹和免疫组织化学显示，UBSM和尿路上皮中都有蛋白质表达，而TRPV4-/-膀胱中则没有。在体外，无论是否存在尿路上皮，GSK1016790A激活TRPV4都会收缩TRPV4+/+小鼠膀胱，这种作用在TRPV4-/-膀胱中未被检测到。与对TRPV4-HEK全细胞电流的影响一致，与GSK1016790A相比，4αPDD显示出较弱的收缩膀胱条的能力[1]。

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位于肌间神经元上的TRPV4介导GSK1016790A的作用[2]
然后对从WT和TRPV4-/-小鼠的近端和远端结肠分离和培养的肌间神经元以及表达TRPV4的HEK-293细胞进行研究，以进一步证实GSK1016790A选择性激活TRPV4通道，并阐明细胞外和细胞内Ca2+在GSK101679A诱导的效应中的作用。
GSK1016790A（100 nM）处理引起神经元亚群细胞内Ca2+快速升高（48± 2 % 或1143/2289个神经元 = 12) （图3a）。反应主要在刺激期间持续。非神经元细胞也对TRPV4激活剂有反应。这些是具有多个突起的小细胞，表明在这些培养条件下，Cajal间质细胞或肠神经胶质细胞能够表达TRPV4。然而，由于本研究的重点是神经元TRPV4的表达，因此这些细胞的特性没有得到进一步的表征。
在用TRPV4选择性拮抗剂HC067047（10μM，预处理30分钟）预处理后，对GSK1016790A（100 nM）的反应被有效消除。HC处理后，神经元对卡巴胆碱（10μM）和KCl（50 mM）的反应得以保留，表明神经元存活率没有受到显著影响（图3b）。在用非选择性离子通道抑制剂RuR（1μM，预处理30分钟）预处理后，对GSK1016790A的反应也出现了类似的阻断。通过比较野生型和TRPV4-/-小鼠，证实了肌间神经元对TRPV4的功能表达（图3b-d）。GSK1016790A未能提高TRPV4-/-小鼠培养的神经元的细胞内Ca2+水平。对CCh和KCl的反应不受影响（图3d）。
在稳定表达人TRPV4的HEK细胞中检测了GSK1016790A的特异性。GSK1016790A（10−10–10−6 M）以浓度依赖的方式升高细胞内Ca2+（补充信息，图S2），这种作用被RN 1734阻断（5× 10−6 M） 或在未诱导TRPV4表达的细胞中不存在。我们还观察到GSK1016790A在含有EDTA的无Ca2+缓冲液中没有刺激作用，这表明这种作用需要细胞外钙。
小鼠结肠离体平滑肌条中细胞内钙储存的耗竭（详见补充信息）消除了GSK1016790A诱导的小鼠结肠平滑肌舒张作用（补充信息，图S3）。因此，我们可以假设细胞内钙离子的存在是GSK1016790A诱导效应所必需的。

在小鼠中，GSK1016790A（0.001-0.1 mg/kg；腹腔注射）以剂量依赖性方式抑制转录转运时间 [2]。 GSK1016790A（0.1-1000 nM；假设 10 分钟）以浓度抑制方式产生显着抑制作用 [2]。

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在体内，TRPV4+/+和TRPV4-/-小鼠的尿动力学显示TRPV4--/-小鼠的膀胱容量增强。将GSK1016790A输注到TRPV4+/+小鼠的膀胱中可诱导膀胱过度活动，但对TRPV4-/-小鼠没有影响。总体而言，TRPV4在膀胱功能中起着重要作用，包括由于UBSM中TRPV4的表达而收缩膀胱的能力[1]。

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GSK1016790A抑制小鼠结肠平滑肌收缩性[2]
接下来，我们使用器官浴在体外表征了TRPV4激活对小鼠回肠和结肠段平滑肌收缩性的影响。GSK1016790A以浓度依赖的方式显著抑制了EFS诱导的离体小鼠结肠条的抽搐收缩（图2a）。RN 1734（10-5M）和RuR（10-6M，图2a）阻断了GSK1016790A在小鼠结肠中的作用。为了证实GSK1016790A的作用是由TRPV4通道介导的，在选择性TRPV1拮抗剂4′-氯-3-甲氧基肉桂酰苯胺（SB 366791）存在下重复实验。SB 366791（10-6M）不影响GSK101679A对小鼠结肠平滑肌收缩性的抑制作用（补充信息，图S1）。所用浓度的GSK1016790A对基础肌张力、静息期活动或用白三醇预收缩的平滑肌没有影响（10−7–2× 10−5 M、 数据未显示； n = 8),不太可能对平滑肌产生直接影响。

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GSK1016790A抑制胃肠运动[2]
为了确定TRPV4激活剂对肠道的体外作用是否转化为整个动物，在小鼠胃肠道运动的标准化测试中研究了GSK1016790A的作用。GSK1016790A（0.001–0.1 mg/kg，i.p.）对小鼠的整个肠道转运时间产生剂量依赖性抑制作用，RN 1734（1 mg/kg，i.p..；图4a）逆转了这一作用。GSK1016790A（0.1 mg/kg，i.p.）对TRPV4-/-小鼠没有抑制作用。此外，GSK1016790A对小鼠腹腔注射后的结肠排出产生了剂量依赖性（图4b）和时间依赖性（见图4c）的抑制作用，这被RN 1734（1 mg/kg，腹腔注射）阻断。我们没有观察到GSK1016790A对TRPV4-/-动物结肠珠排出的影响（图4d）。
腹腔注射GSK1016790A（0.1 mg/kg）对小鼠上消化道转运时间没有任何影响（补充信息，图S4）。
因此，本研究使用了两种模拟人类病理生理条件的动物模型，一种可逆的乙酰胆碱酯酶抑制剂新斯的明和应激诱导的高运动。以剂量依赖方式给药GSK1016790A（0.001–0.1 mg/kg，i.p.）可降低新斯的明（2.5μg/kg，i.p..）在小鼠体内诱导的胃肠道高动力（图4e）。此外，腹腔注射GSK1016790A（0.1mg/kg，腹腔注射）减少了暴露于轻度应激的小鼠的粪便颗粒产量（图4f）。GSK1016790A在该模型中对TRPV4-/-小鼠没有影响（图4f）。

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NOS通过可溶性鸟苷酸环化酶作为下游效应器参与TRPV4诱导的小鼠结肠中GSK1016790A的作用[2]
NO是一种主要的抑制性神经递质，由抑制性运动神经元和下行中间神经元产生。在这里，我们研究了NO在TRPV4激动剂对结肠收缩的抑制作用中的作用，并使用已建立的NO成像技术进一步确定了TRPV4下游的效应器。
实验表明，GSK1016790A（10-7M）刺激了小鼠结肠LMMP制剂中NO的释放（图5a，b）。GSK1016790A的作用被RuR（10-6M）、SMTC（10-5M）和1400W（10-5Ms；图5b，c）联合阻断。由于NO是一种易于扩散穿过细胞膜的气态神经递质，因此确定肌间神经丛内NO的细胞来源是一个重大挑战，因为所有细胞都负载有对NO敏感的染料。细胞外NO清除剂2-苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧基-3-氧化物（PTIO，10-4M）的应用阻止了NO的细胞外运动，从而允许基于细胞荧光定位产生NO的细胞（相对于对NO的反应）。肌间神经丛内响应GSK1016790A产生NO的神经元百分比为40 ± 6 (n = 3). 当SMTC和PTIO联合应用时，神经元对GSK1016790A的反应被完全抑制，而在1400W和PTIO存在的情况下，神经元对GSK1016790A的反应与单独使用GSK相比没有变化（图5b）。

离体平滑肌条的体外实验[2]
按照所述检查孤立肠段的收缩性（补充信息）GSK1016790A（N-（（1S）-1-{[4-（2S）-2-{[（2,4-二氯苯基）磺酰基]氨基}-3-羟基丙酰基）-1-哌嗪基]羰基}-3-甲基丁基）-1-苯并噻吩-2-甲酰胺，10−10–10−6 M）被累积添加到器官浴中，并记录了对电场刺激（EFS；8 Hz）诱导的收缩或舒张的影响。允许每种浓度孵育10分钟。在添加GSK1016790A之前，使用四次连续抽搐收缩或放松的平均振幅来产生内部对照。收缩或舒张振幅的变化以内部控制的百分比报告。在对照实验中测试了载体（DMSO）的效果。[2]
在单独的实验中，将TRPV4拮抗剂2,4-二氯-N-异丙基-N-（2-异丙基氨基乙基）苯磺酰胺（RN 1734，10-5M）、TRPV拮抗剂钌红（RuR，10-6M）、NOS-1阻断剂S-甲基-L-硫代瓜氨酸添加GSK1016790A前至少一分钟。拮抗剂和对照实验的效果作为配对试验进行，同时使用八个器官浴。

肌间神经元[Ca2+]i的测定[1]
为了测量单个神经元中的细胞内钙[Ca2+]i），细胞在含有20 mM HEPES和0.1%BSA的Hank's平衡盐溶液（HBSS）中装载Fura2 AM酯（2μM，30分钟，37°C）。在37°C下使用Leica DMI-6000B成像系统和×10干物镜测量荧光。在340和380nm激发波长和510nm发射波长下收集图像（间隔5-s）。使用ImageJ软件和McMaster生物光子学设施插件（v1.46b；http://imagej.nih.gov/ij). 结果以340/380nm荧光发射比表示，作为细胞内钙（[Ca2+]i）的间接测量。依次用GSK1016790A（100 nM，TRPV4激动剂）、卡巴胆碱（1μM，毒蕈碱受体激动剂）和KCl（50 mM）攻击神经元。在某些实验中，细胞在加入激动剂前30分钟用HC067047（10μM，TRPV4拮抗剂）或钌红（10μM）预处理。对GSK1016790A和KCl有反应的细胞，其峰值340/380nm比值大于基线0.1单位，被计为TRPV4阳性神经元。

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离体平滑肌条的体外实验[2]
按照所述检查孤立肠段的收缩性（补充信息）。将GSK1016790A（N-（（1S）-1-{[4-（2S）-2-{[（2,4-二氯苯基）磺酰基]氨基}-3-羟基丙酰基）-1-哌嗪基]羰基}-3-甲基丁基）-1-苯并噻吩-2-甲酰胺，10−10–10−6 M）累积添加到器官浴中，并记录对电场刺激（EFS；8 Hz）诱导的收缩或舒张的影响。允许每种浓度孵育10分钟。在添加GSK1016790A之前，使用四次连续抽搐收缩或放松的平均振幅来产生内部对照。收缩或舒张振幅的变化以内部控制的百分比报告。在对照实验中测试了载体（DMSO）的效果。
在单独的实验中，在添加前10分钟，将TRPV4拮抗剂2,4-二氯-N-异丙基-N-（2-异丙基氨基乙基）苯磺酰胺（RN 1734，10-5M）、TRPV拮抗剂钌红（RuR，10-6M）、NOS-1阻断剂S-甲基-L-硫代瓜氨酸（SMTC，10-5MA）、NOS-2阻断剂N-（3-氨基甲基）苄基乙脒（1400W，10-6MA）和可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）抑制剂1H-[1,2,4]恶二唑并[4,3-a]喹喔啉-1-酮（ODQ）加入器官浴中。GSK1016790A。拮抗剂和对照实验的效果作为配对试验进行，同时使用八个器官浴。

动物/疾病模型： S100β-GFP 和 TRPV4 基因敲除 (TRPV4-/-) 小鼠 [2]
剂量： 0.001、0.01、0.1 mg/kg
给药途径： 腹腔注射；单次给药
实验结果： 对小鼠全肠道转运时间的影响：剂量依赖性抑制。产生剂量依赖性和时间依赖性的结肠排空抑制。

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TRPV4−/− 小鼠的构建。[1]
使用 Expand 长模板 PCR 试剂盒（Roche，Palo Alto，CA），通过聚合酶链式反应 (PCR) 从 E14.1 胚胎干细胞 (ES) 系克隆与 TRPV4 基因座同源的基因组片段。 5′同源臂引物为VR4_5F（5′-TTC TTG TTG ACC CAC AAG AAG CGC CT-3′）和VR4_5R（5′-ATG GTG TCG TTG CGC CCG TTG CTT AGG TT-3′），跨越编码外显子3至4； 3′臂的引物序列为VR4_3F（5′-TTC TTC CAG CCC AAG GAT GAG GGA GGC T-3′）和VR4_3R（5′-AGA TGC CGG GTG TCC TCA TCT GTC ACC...

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体内全胃肠道转运[2]
为了评估小鼠全肠道的蠕动，我们采用既定方案测量了全肠道转运时间。简而言之，我们使用18号动物饲管，将0.15 ml由5%伊文思蓝（一种不可吸收的彩色标记物）和5%阿拉伯胶组成的粘稠液体灌胃给小鼠。在灌胃标记物前15分钟，小鼠腹腔注射GSK1016790A或载体。在部分实验中，我们在注射激动剂前15分钟腹腔注射TRPV4拮抗剂RN 1734。给药。给药后，立即将小鼠放回单独的笼子中，笼子放置在白色床单上，以便于识别有色粪便团块。从胃内给药到排出第一个有色粪便团块之间的时间间隔被视为全肠道转运时间。

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体内结肠排出试验[2]
采用以下方案测量远端结肠排出：小鼠禁食过夜后，腹腔注射GSK1016790A或载体，并使用硅胶推杆将预热至37℃的玻璃珠（2 mm）插入远端结肠2 cm。插入玻璃珠后，将小鼠放回单独的笼子中，并测定玻璃珠排出时间。30分钟内未排出玻璃珠的小鼠被处死，以确认玻璃珠存在于肠腔内。

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体内粪便排出量[2]
为了测试其影响为了研究GSK1016790A对应激诱导排便的影响，在实验开始前15分钟，对未禁食的小鼠腹腔注射GSK1016790A（0.001–0.1 mg/kg）或载体。随后，将小鼠置于干净的新笼子中的金属网格上，或留在原笼中不加干扰，并计数60分钟内排出的粪便颗粒数。此外，还测量了腹腔注射新斯的明（2.5 μg/kg，腹腔注射，一种可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂）的小鼠的粪便排出量。

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药物处理[2]
GSK1016790A（0.001–0.1 mg/kg）或载体在实验开始前15–75分钟腹腔注射。在选定的实验中，在激动剂给药前15分钟腹腔注射RN 1734。

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一氧化氮成像[2]
一氧化氮(NO)成像按所述方法进行（见补充信息）。在5分钟基线期后，将GSK1016790A (10−7 M)灌注30秒。抑制剂在整个实验过程中持续灌注，包括RuR (10−6 M)、SMTC (10−5 M)和1400W (10−5 M)。此外，还使用了细胞外NO清除剂2-苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧基-3-氧化物(PTIO, 10−4 M)。

[1]. N-((1S)-1-{[4-((2S)-2-{[(2,4-dichlorophenyl)sulfonyl]amino}-3-hydroxypropanoyl)-1-piperazinyl]carbonyl}-3-methylbutyl)-1-benzothiophene-2-carboxamide (GSK1016790A), a novel and potent transient receptor potential vanilloid 4 channel agonist induces urinary bladder contraction and hyperactivity: Part I. J Pharmacol Exp Ther. 2008 Aug;326(2):432-42.

[2]. Transient receptor potential vanilloid 4 inhibits mouse colonic motility by activating NO-dependent enteric neurotransmission. J Mol Med (Berl). 2015 Dec;93(12):1297-309.

GSK1016790A 是一种叔酰胺，属于哌嗪类化合物，其中一个氨基与 N-[(2,4-二氯苯基)磺酰基]-L-丝氨酸的羧基发生缩合反应，而另一个氨基与 N-(1-苯并噻吩-2-基羰基)-L-亮氨酸的羧基发生缩合反应。它是一种细胞渗透性强、选择性高的 TRPV4（瞬时受体电位香草酸受体 4）通道激动剂。它作为 TRPV4 激动剂发挥作用。它属于 1-苯并噻吩类、N-酰基哌嗪类、磺酰胺类、二氯苯类、叔酰胺类和芳香伯醇类化合物。

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TRPV4 激活剂 GSK1016790A 的鉴定 [[1]
作为小分子筛选工作的一部分，GSK1016790A 被鉴定为一种新型 TRPV4 通道激活剂（图 1A）。GSK1016790A 能有效诱导表达小鼠 TRPV4 通道的 HEK 细胞中 Ca2+ 内流，EC50 值为 18 nM（补充图 2）。GSK1016790A 对人 TRPV4 通道也表现出类似的效力（EC50 = 2.1 nM）。GSK1016790A 对 TRPV1 通道无活性（参见相关文章，Willette 等，2008），TRPV1 通道基于序列同源性属于 TRP 超家族。
GSK1016790A 是一种新型 TRPV4 通道激活剂，其效力比常用的 TRPV4 激活剂 4α-PDD 高约 300 倍。我们结合分子生物学技术、TRPV4−/−小鼠、体外收缩力测定和体内尿动力学实验，并应用GSK1016790A，证实了TRPV4在膀胱平滑肌（UBSM）中的作用。我们通过PCR扩增了TRPV4 mRNA，并通过Western blot分析和免疫组织化学证实了UBSM和尿路上皮中TRPV4蛋白的表达。GSK1016790A可独立于尿路上皮诱导膀胱收缩。在本研究中，我们使用TRPV4选择性激动剂GSK1016790A来评估TRPV4在胃肠动力中的作用。我们的目标是阐明GSK1016790A对小鼠肠道平滑肌在体外和胃肠道转运动物模型中的收缩和舒张作用。为了阐明TRPV4依赖性信号传导所涉及的细胞内通路，我们采用了钙成像和NO成像技术。此外，我们还对健康人和运动障碍患者的组织进行了研究。我们的数据表明，TRPV4可能成为治疗人类运动相关疾病的一个可行靶点。[2]

C28H32CL2N4O6S2

655.61

654.114

C, 51.30; H, 4.92; Cl, 10.81; N, 8.55; O, 14.64; S, 9.78

942206-85-1

23630211

White to off-white solid powder

5.285

176.23

3

8

10

42

1070

2

CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCN(CC1)C(=O)[C@H](CO)NS(=O)(=O)C2=C(C=C(C=C2)Cl)Cl)NC(=O)C3=CC4=CC=CC=C4S3

IVYQPSHHYIAUFO-VXKWHMMOSA-N

InChI=1S/C28H32Cl2N4O6S2/c1-17(2)13-21(31-26(36)24-14-18-5-3-4-6-23(18)41-24)27(37)33-9-11-34(12-10-33)28(38)22(16-35)32-42(39,40)25-8-7-19(29)15-20(25)30/h3-8,14-15,17,21-22,32,35H,9-13,16H2,1-2H3,(H,31,36)/t21-,22-/m0/s1

N-[(2S)-1-[4-[(2S)-2-[(2,4-dichlorophenyl)sulfonylamino]-3-hydroxypropanoyl]piperazin-1-yl]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]-1-benzothiophene-2-carboxamide

GSK1016790A; GSK-1016790A; GSK1016790A; 942206-85-1; GSK-1016790A; N-[(2S)-1-[4-[(2S)-2-[(2,4-dichlorophenyl)sulfonylamino]-3-hydroxypropanoyl]piperazin-1-yl]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]-1-benzothiophene-2-carboxamide; N-((S)-1-(4-((S)-2-(2,4-dichlorophenylsulfonaMido)-3-hydroxypropanoyl)piperazin-1-yl)-4-Methyl-1-oxopentan-2-yl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide; CHEMBL4461515; (N-((1S)-1-{[4-((2S)-2-{[(2,4-Dichlorophenyl)sulfonyl]amino}-3-hydroxypropanoyl)-1-piperazinyl]carbonyl}-3-methylbutyl)-1-benzothiophene-2-carboxamide; GSK 1016790A.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 33 mg/mL (~50.33 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (3.81 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (3.81 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.17 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。