GSK8612

Tank-binding Kinase-1 (TBK1) (pIC50 = 6.8)
GSK8612 suppresses type I IFN production in primary human mononuclear cells and toll-like receptor (TLR)3-induced IRF3 phosphorylation in Ramos cells. GSK8612 can prevent IFNβ from being secreted in THP1 cells in reaction to dsDNA and cGAMP, which is STING's natural ligand[1].

GSK8612 抑制原代人单核细胞中 I 型 IFN 的产生以及 Ramos 细胞中 Toll 样受体 (TLR)3 诱导的 IRF3 磷酸化。 GSK8612 可以阻止 THP1 细胞与 dsDNA 和 cGAMP（STING 的天然配体）反应而分泌 IFNβ[1]。

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在生化功能实验中，GSK8612 抑制重组 TBK1 的平均 pIC₅₀ 为 6.8。[1]
在用 TLR3 配体 poly(I:C) 刺激的 Ramos 细胞中，GSK8612 通过 Western blot 检测，抑制干扰素调节因子 3 (IRF3) Ser396 位点磷酸化的平均 pIC₅₀ 为 6.0。[1]
在用 poly(I:C) 刺激的人外周血单个核细胞 (PBMCs) 中，GSK8612 通过基于流式细胞术的细胞因子微球阵列 (CBA) 法检测，抑制干扰素-α (IFNα) 分泌的平均 pIC₅₀ 为 6.1。[1]
在用含 dsDNA 的病毒 (杆状病毒) 刺激的 THP-1 细胞中，GSK8612 抑制干扰素-β (IFNβ) 分泌的 pIC₅₀ 为 5.9。[1]
在用 STING 配体 cGAMP (60 µg/mL) 刺激的 THP-1 细胞中，GSK8612 抑制 IFNβ 分泌的 pIC₅₀ 为 6.3。[1]

重组TBK1抑制作用的测定[1]
Reaction Biology Corporation使用其激酶热点专有技术，一式两份测定GSK8612对TBK1酶活性的抑制作用。 [1]

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亲和富集化合物竞争结合分析方案[1]
如前所述，使用Kinobeads和LipidKinobeads进行竞争结合试验3,4。简而言之，将200μL（1mg蛋白质）细胞提取物（见补充数据）与试验化合物或载体在4°C下预孵育45分钟，然后与Kinobeads或脂质珠（每个样品7μL珠）在4°C下孵育1小时。用裂解缓冲液洗涤珠粒，用20μL SDS样品缓冲液（250 mM Tris-HCl pH 7.4，250 mM Tris-Base，20%甘油，4%SDS，0.01%溴酚蓝）洗脱。根据改进的单罐固相样品制备（SP3）方案消化蛋白质。5,6简而言之，将蛋白质溶液稀释至2%SDS，并通过加入乙醇至终浓度为50%与S6顺磁珠结合。通过用70%乙醇洗涤4次来去除污染物。在o/n孵育后，通过将蛋白质重新悬浮在含有TCEP、氯乙酰胺、胰蛋白酶和LysC的0.1 mM HEPES（pH 8.5）中来消化蛋白质。使用10-plex TMT试剂进行TMT标记，能够在单个实验中对10种条件进行相对定量。4,7标记反应在pH 8.5的40 mM三乙基碳酸铵中在22°C下进行，并用甘氨酸淬灭。每次实验将标记的肽提取物合并到一个样品中。样品在真空中干燥，并重新悬浮在0.05%三氟乙酸水溶液中。将30%的样品注射到与Q Exactive耦合的Ultimate3000 nanoRLSC中。肽在55°C下在定制的35cm×100μm（ID）反相柱（ReproSil-pur C18-AQ，1.9µm）上分离。在3.3小时内，从2%乙腈到40%乙腈的0.1%甲酸和3.5%DMSO溶液中进行梯度洗脱。样品在线注入Q-Exactive质谱仪，采用数据依赖的前10种方法进行操作。通过使用70.000分辨率和3E6离子靶获得MS光谱。使用35%NCE以35.000分辨率（m/z 200）进行了高能碰撞解离（HCD）扫描，并将离子靶设置为2E5以避免聚结。7仪器使用Tune 2.9和Xcalibur 4.1操作。 [1]

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物理化学性质的测定[1]
CLND溶解度、CHROM LogD、人工膜渗透性和人血清白蛋白结合均按照Diaz等人报告的程序进行测定。

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血液中未结合化合物含量测定方案[1]
使用48孔快速平衡透析板进行LC-MS/MS分析的快速平衡透析技术用于测定大鼠、小鼠和人血液中GSK8612的未结合部分。将浓度为200 ng/ml和1000 mg/ml的化合物掺入血液中（有机溶剂终浓度为0.5%）。使用磷酸盐缓冲盐水（100mM磷酸钠+150mM氯化钠，pH 6.9-7.2）作为透析缓冲液。通过在快速平衡透析板中在37℃下孵育4小时，使100µL加标血液与300µL透析缓冲液（n=6）平衡。使用拉贝洛尔作为内标，通过LC-MS/MS分析样品，并计算缓冲液中未结合的化合物分数。

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微粒体稳定性测定方案[1]
该研究由CRO Cyprotex进行。将含有NADPH（1 mM）的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中的小鼠、大鼠或人肝微粒体（蛋白质浓度0.5 mg/mL）与0.5µM的GSK8612（0.25%DMSO）在37°C下孵育45分钟。在0、5、15、30和45分钟时取每个实验的等分试样（50µL），通过加入100µL含甲醇内标物停止反应。这些样品在4°C下以2500 rpm离心20分钟以沉淀蛋白质，然后通过LC-MS/MS分析样品。对照样品也在相同条件下运行，但不添加NADPH。

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TBK1生化抑制实验使用重组TBK1激酶进行。GSK8612的平均pIC₅₀测定为6.8。正文未提供实验方案（如底物、检测方法）的进一步细节。[1]
使用基于亲和富集的化学蛋白质组学方法结合kinobeads，测定了GSK8612针对285种激酶的结合亲和力(pK_d)和选择性谱。Kinobeads由固定在ATP结合位点的激酶抑制剂组成。使用来自HEK293、K-562、HepG2和胎盘细胞的混合细胞裂解液进行蛋白激酶分析。此外，使用脂质激酶亲和基质在混合的HeLa、Jurkat和K-562细胞裂解液中进行了脂质激酶分析。通过质谱定量化合物结合以确定pK_d值。[1]

Ramos细胞中IRF3磷酸化抑制[1]
将Ramos细胞（ATCC， 106个/孔）在含有2%胎牛血清的细胞培养基（RPMI1640）中暴露于GSK8612 60分钟，然后用poly(I:C)（30µg/mL）在37°C， 5% CO2下刺激120分钟。然后收集细胞并用冷水DPBS清洗一次。细胞在含5%甘油、1.5 mM MgCl2、20 mM NaCl、1 mM Na3VO4、0.8% (v/v) IGEPAL™-CA630、50 nM Calyculin A、磷酸酶抑制剂混合物、蛋白酶抑制剂混合物（aprotinin, bestatin, leupeptin, pepstatin, phosphoramidon）、25 mM NaF、1 mM二硫代苏糖醇的50 mM Tris-HCl （pH 7.4）中裂解。离心去除细胞碎片，用NuPAGE™LDS样品缓冲液（添加50 mM二硫苏糖醇）变性可溶性蛋白。采用4-10%聚丙烯酰胺凝胶和抗体进行Western blot分析。用Western blot分析SDS裂解物中IRF3的相对磷酸化。使用LICOR ODYSSEY™扫描仪定量波段强度。正规化磷酸化- irf3信号显示为百分比抑制，未刺激的细胞给出最小信号，而经载体处理的poly（I:C）刺激的细胞给出最大信号。pIC50是使用GraphPad Prism软件（V7）从约束于顶部（100%）的四参数s型曲线拟合得出的。

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人外周血mcs中IFNα分泌抑制[1]
外周血单个核细胞（PBMC）采用密度离心法从人全血中分离得到。PBMCs在含10%胎牛血清的50µL培养基（RPMI1640）中接种于96孔板，每孔50,000个细胞。细胞与GSK8612或载药（DMSO 0.2%）在37℃，5% CO2条件下孵育1小时。然后用100 μg/ml poly（I:C）在37℃、5% CO2条件下刺激细胞16 h。收集上清液，用CBA流式细胞仪分析分泌的IFNα。根据流式细胞术测定的平均荧光强度（MFI）计算IFNα分泌抑制百分比。

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抑制IFN [1]
将人THP-1 THP-1细胞（ATCC）的分泌液在100µL培养基（RPMI-140, 10%热灭活胎牛血清，1%青霉素/链霉素/两性霉素）中以每孔10万个细胞的速度在96孔组织培养板中进行培养，然后在37°C下增加GSK8612浓度（0.003-10µM）培养45分钟。用10µL Bacmam病毒（7.32 × 108 pfu/mL）或10µL 600µg/mL cGAMP溶液（水中）刺激细胞。根据MSD 96孔MULTI-ARRAY Human IFN-b assay （K111ADB-2）的制造商说明，使用MESO Sector s600平台，在20小时孵育后，通过电化学发光从细胞上清液中测量分泌的IFN水平。对三个技术重复实验的数据进行平均，绘制成Graphpad Prism 4.0中GSK8612浓度的函数，并拟合抑制模型以确定IC50。

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Ramos细胞IRF3磷酸化实验：用TLR3配体poly(I:C)刺激Ramos细胞。用不同浓度的GSK8612处理细胞。刺激后，裂解细胞，通过SDS-PAGE分离蛋白。使用特异性抗体通过Western blot检测IRF3 Ser396位点的磷酸化和总IRF3水平。通过光密度法量化条带强度，并根据归一化至总IRF3的pIRF3抑制情况计算pIC₅₀值。[1]
人PBMCs中IFNα分泌实验：在人PBMCs中，在poly(I:C)刺激的同时加入不同浓度的GSK8612。孵育16小时后，收集细胞培养上清液。使用基于流式细胞术的细胞因子微球阵列(CBA)法测量分泌的IFNα浓度。将平均荧光强度(MFI)数据归一化至溶剂处理的刺激对照组，以计算抑制百分比和pIC₅₀值。[1]
THP-1细胞中IFNβ分泌实验：THP-1细胞分别用含dsDNA的杆状病毒或用60 µg/mL的STING配体cGAMP刺激。细胞与一系列浓度的GSK8612共处理。孵育后，收集上清液。使用合适的免疫分析法（文中未详述具体方法）定量分泌的IFNβ量（pg/mL）。生成剂量反应曲线以确定pIC₅₀值。[1]

GSK8612 的计算 logD 值较低，表明其水溶性高，超过了其对 TBK1 的亲和力。[1] GSK8612 在人和大鼠体内微粒体清除率较低，在小鼠体内微粒体清除率较低至中等。[1] GSK8612 在小鼠、大鼠和人血液中均与蛋白质高度结合。[1]

[1]. Discovery of GSK8612, a Highly Selective and Potent TBK1 Inhibitor. ACS Med Chem Lett. 2019 Mar 11;10(5):780-785.

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶TBK1（Tank结合激酶-1）是IkB激酶（IKK）家族的非经典成员。该激酶调控先天免疫、肿瘤发生、能量稳态、自噬和神经炎症等信号通路。本文报道了一种新型高效高选择性TBK1抑制剂GSK8612的发现和表征。在细胞实验中，该小分子抑制了Ramos细胞中Toll样受体（TLR）3诱导的干扰素调节因子（IRF）3磷酸化以及原代人单核细胞中I型干扰素（IFN）的分泌。在THP1细胞中，GSK8612能够抑制dsDNA和cGAMP（STING的天然配体）诱导的干扰素β（IFNβ）分泌。 GSK8612 是一种 TBK1 小分子抑制剂，具有优异的选择性，因此是深入研究 TBK1 在免疫、神经炎症、肥胖或癌症模型中生物学功能的理想探针。[1] 总之，GSK8612 的生物活性已得到证实，其能够以低微摩尔浓度抑制 Ramos 细胞中 IRF3 的磷酸化、人外周血单核细胞 (PBMC) 中 IFNα 的分泌以及 THP-1 细胞中 IFNβ 的分泌。GSK8612 是一种高选择性 TBK1 抑制剂，因此是深入研究 TBK1 在免疫、神经炎症、肥胖和癌症等生物模型中生理作用的理想工具。[1] GSK8612 是一种 2,4-二氨基嘧啶衍生物，通过两个连续的亲核芳香取代反应合成。 [1]
分子对接至TBK1晶体结构（PDB 4IWQ）预测GSK8612与ATP结合口袋结合。关键相互作用包括嘧啶核心与铰链区残基Cys89之间的氢键，以及磺酰胺NH与Asn140和Asp157侧链之间的氢键。[1]
化学蛋白质组学分析表明，在细胞提取物中，GSK8612与TBK1磷酸化（活化）形式（pK_d 6.8）的亲和力低于与非活化形式（pK_d 7.7）的亲和力。[1]
GSK8612被认为是一种高选择性化学探针，可用于解析TBK1在免疫、神经炎症、肥胖和癌症模型中的生物学功能。 [1]

C17H17BRF3N7O2S

520.3268

519.029

C, 39.24; H, 3.29; Br, 15.36; F, 10.95; N, 18.84; O, 6.15; S, 6.16

2361659-62-1

137553174

White to off-white solid powder

1.7±0.1 g/cm3

671.0±65.0 °C at 760 mmHg

359.6±34.3 °C

0.0±2.1 mmHg at 25°C

1.674

1.77

136

3

11

7

31

688

0

FFPHMUIGESPOTK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H17BrF3N7O2S/c1-10-14(8-28(27-10)9-17(19,20)21)25-16-24-7-13(18)15(26-16)23-6-11-2-4-12(5-3-11)31(22,29)30/h2-5,7-8H,6,9H2,1H3,(H2,22,29,30)(H2,23,24,25,26)

4-((5-bromo-2-((3-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-pyrazol-4-yl)amino)pyrimidin-4-ylamino)methyl)benzenesulfonamide

GSK-8612; GSK 8612; GSK8612; 2361659-62-1; 4-(((5-Bromo-2-((3-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-pyrazol-4-yl)amino)pyrimidin-4-yl)amino)methyl)benzenesulfonamide; CHEMBL4446892; 4-[[[5-bromo-2-[[3-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)pyrazol-4-yl]amino]pyrimidin-4-yl]amino]methyl]benzenesulfonamide; 4-((5-Bromo-2-((3-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-pyrazol-4-yl)amino)pyrimidin-4-ylamino)methyl)benzenesulfonamide; GSK8612;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 125 mg/mL (~240.23 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.00 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.00 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.00 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。