GSK8612

Tank-binding Kinase-1 (TBK1) (pIC50 = 6.8)

GSK8612 抑制原代人单核细胞中 I 型 IFN 的产生以及 Ramos 细胞中 Toll 样受体 (TLR)3 诱导的 IRF3 磷酸化。 GSK8612 可以阻止 THP1 细胞与 dsDNA 和 cGAMP（STING 的天然配体）反应而分泌 IFNβ[1]。

重组TBK1抑制作用的测定[1]
Reaction Biology Corporation使用其激酶热点专有技术，一式两份测定GSK8612对TBK1酶活性的抑制作用。 [1]

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亲和富集化合物竞争结合分析方案[1]
如前所述，使用Kinobeads和LipidKinobeads进行竞争结合试验3,4。简而言之，将200μL（1mg蛋白质）细胞提取物（见补充数据）与试验化合物或载体在4°C下预孵育45分钟，然后与Kinobeads或脂质珠（每个样品7μL珠）在4°C下孵育1小时。用裂解缓冲液洗涤珠粒，用20μL SDS样品缓冲液（250 mM Tris-HCl pH 7.4，250 mM Tris-Base，20%甘油，4%SDS，0.01%溴酚蓝）洗脱。根据改进的单罐固相样品制备（SP3）方案消化蛋白质。5,6简而言之，将蛋白质溶液稀释至2%SDS，并通过加入乙醇至终浓度为50%与S6顺磁珠结合。通过用70%乙醇洗涤4次来去除污染物。在o/n孵育后，通过将蛋白质重新悬浮在含有TCEP、氯乙酰胺、胰蛋白酶和LysC的0.1 mM HEPES（pH 8.5）中来消化蛋白质。使用10-plex TMT试剂进行TMT标记，能够在单个实验中对10种条件进行相对定量。4,7标记反应在pH 8.5的40 mM三乙基碳酸铵中在22°C下进行，并用甘氨酸淬灭。每次实验将标记的肽提取物合并到一个样品中。样品在真空中干燥，并重新悬浮在0.05%三氟乙酸水溶液中。将30%的样品注射到与Q Exactive耦合的Ultimate3000 nanoRLSC中。肽在55°C下在定制的35cm×100μm（ID）反相柱（ReproSil-pur C18-AQ，1.9µm）上分离。在3.3小时内，从2%乙腈到40%乙腈的0.1%甲酸和3.5%DMSO溶液中进行梯度洗脱。样品在线注入Q-Exactive质谱仪，采用数据依赖的前10种方法进行操作。通过使用70.000分辨率和3E6离子靶获得MS光谱。使用35%NCE以35.000分辨率（m/z 200）进行了高能碰撞解离（HCD）扫描，并将离子靶设置为2E5以避免聚结。7仪器使用Tune 2.9和Xcalibur 4.1操作。 [1]

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物理化学性质的测定[1]
CLND溶解度、CHROM LogD、人工膜渗透性和人血清白蛋白结合均按照Diaz等人报告的程序进行测定。

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血液中未结合化合物含量测定方案[1]
使用48孔快速平衡透析板进行LC-MS/MS分析的快速平衡透析技术用于测定大鼠、小鼠和人血液中GSK8612的未结合部分。将浓度为200 ng/ml和1000 mg/ml的化合物掺入血液中（有机溶剂终浓度为0.5%）。使用磷酸盐缓冲盐水（100mM磷酸钠+150mM氯化钠，pH 6.9-7.2）作为透析缓冲液。通过在快速平衡透析板中在37℃下孵育4小时，使100µL加标血液与300µL透析缓冲液（n=6）平衡。使用拉贝洛尔作为内标，通过LC-MS/MS分析样品，并计算缓冲液中未结合的化合物分数。

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微粒体稳定性测定方案[1]
该研究由CRO Cyprotex进行。将含有NADPH（1 mM）的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中的小鼠、大鼠或人肝微粒体（蛋白质浓度0.5 mg/mL）与0.5µM的GSK8612（0.25%DMSO）在37°C下孵育45分钟。在0、5、15、30和45分钟时取每个实验的等分试样（50µL），通过加入100µL含甲醇内标物停止反应。这些样品在4°C下以2500 rpm离心20分钟以沉淀蛋白质，然后通过LC-MS/MS分析样品。对照样品也在相同条件下运行，但不添加NADPH。

Ramos细胞中IRF3磷酸化抑制[1]
将Ramos细胞（ATCC， 106个/孔）在含有2%胎牛血清的细胞培养基（RPMI1640）中暴露于GSK8612 60分钟，然后用poly(I:C)（30µg/mL）在37°C， 5% CO2下刺激120分钟。然后收集细胞并用冷水DPBS清洗一次。细胞在含5%甘油、1.5 mM MgCl2、20 mM NaCl、1 mM Na3VO4、0.8% (v/v) IGEPAL™-CA630、50 nM Calyculin A、磷酸酶抑制剂混合物、蛋白酶抑制剂混合物（aprotinin, bestatin, leupeptin, pepstatin, phosphoramidon）、25 mM NaF、1 mM二硫代苏糖醇的50 mM Tris-HCl （pH 7.4）中裂解。离心去除细胞碎片，用NuPAGE™LDS样品缓冲液（添加50 mM二硫苏糖醇）变性可溶性蛋白。采用4-10%聚丙烯酰胺凝胶和抗体进行Western blot分析。用Western blot分析SDS裂解物中IRF3的相对磷酸化。使用LICOR ODYSSEY™扫描仪定量波段强度。正规化磷酸化- irf3信号显示为百分比抑制，未刺激的细胞给出最小信号，而经载体处理的poly（I:C）刺激的细胞给出最大信号。pIC50是使用GraphPad Prism软件（V7）从约束于顶部（100%）的四参数s型曲线拟合得出的。

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人外周血mcs中IFNα分泌抑制[1]
外周血单个核细胞（PBMC）采用密度离心法从人全血中分离得到。PBMCs在含10%胎牛血清的50µL培养基（RPMI1640）中接种于96孔板，每孔50,000个细胞。细胞与GSK8612或载药（DMSO 0.2%）在37℃，5% CO2条件下孵育1小时。然后用100 μg/ml poly（I:C）在37℃、5% CO2条件下刺激细胞16 h。收集上清液，用CBA流式细胞仪分析分泌的IFNα。根据流式细胞术测定的平均荧光强度（MFI）计算IFNα分泌抑制百分比。

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抑制IFN [1]
将人THP-1 THP-1细胞（ATCC）的分泌液在100µL培养基（RPMI-140, 10%热灭活胎牛血清，1%青霉素/链霉素/两性霉素）中以每孔10万个细胞的速度在96孔组织培养板中进行培养，然后在37°C下增加GSK8612浓度（0.003-10µM）培养45分钟。用10µL Bacmam病毒（7.32 × 108 pfu/mL）或10µL 600µg/mL cGAMP溶液（水中）刺激细胞。根据MSD 96孔MULTI-ARRAY Human IFN-b assay （K111ADB-2）的制造商说明，使用MESO Sector s600平台，在20小时孵育后，通过电化学发光从细胞上清液中测量分泌的IFN水平。对三个技术重复实验的数据进行平均，绘制成Graphpad Prism 4.0中GSK8612浓度的函数，并拟合抑制模型以确定IC50。

[1]. Discovery of GSK8612, a Highly Selective and Potent TBK1 Inhibitor. ACS Med Chem Lett. 2019 Mar 11;10(5):780-785.

The serine/threonine protein kinase TBK1 (Tank-binding Kinase-1) is a noncanonical member of the IkB kinase (IKK) family. This kinase regulates signaling pathways in innate immunity, oncogenesis, energy homeostasis, autophagy, and neuroinflammation. Herein, we report the discovery and characterization of a novel potent and highly selective TBK1 inhibitor, GSK8612. In cellular assays, this small molecule inhibited toll-like receptor (TLR)3-induced interferon regulatory factor (IRF)3 phosphorylation in Ramos cells and type I interferon (IFN) secretion in primary human mononuclear cells. In THP1 cells, GSK8612 was able to inhibit secretion of interferon beta (IFNβ) in response to dsDNA and cGAMP, the natural ligand for STING. GSK8612 is a TBK1 small molecule inhibitor displaying an excellent selectivity profile and therefore represents an ideal probe to further dissect the biology of TBK1 in models of immunity, neuroinflammation, obesity, or cancer.[1]
In summary, the biological activity of GSK8612 was demonstrated, resulting in inhibition of IRF3 phosphorylation in Ramos cells, IFNα secretion from human PBMCs, and IFNβ secretion from THP-1 cells with low micromolar potency. GSK8612 is a highly selective TBK1 inhibitor, thus representing an ideal tool to further dissect the physiological roles of TBK1 in biological models of immunity, neuroinflammation, obesity, and cancer.[1]

C17H17BRF3N7O2S

520.3268

519.029

C, 39.24; H, 3.29; Br, 15.36; F, 10.95; N, 18.84; O, 6.15; S, 6.16

2361659-62-1

137553174

White to off-white solid powder

1.7±0.1 g/cm3

671.0±65.0 °C at 760 mmHg

359.6±34.3 °C

0.0±2.1 mmHg at 25°C

1.674

1.77

136

3

11

7

31

688

0

FFPHMUIGESPOTK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H17BrF3N7O2S/c1-10-14(8-28(27-10)9-17(19,20)21)25-16-24-7-13(18)15(26-16)23-6-11-2-4-12(5-3-11)31(22,29)30/h2-5,7-8H,6,9H2,1H3,(H2,22,29,30)(H2,23,24,25,26)

4-((5-bromo-2-((3-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-pyrazol-4-yl)amino)pyrimidin-4-ylamino)methyl)benzenesulfonamide

GSK-8612; GSK 8612; GSK8612; 2361659-62-1; 4-(((5-Bromo-2-((3-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-pyrazol-4-yl)amino)pyrimidin-4-yl)amino)methyl)benzenesulfonamide; CHEMBL4446892; 4-[[[5-bromo-2-[[3-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)pyrazol-4-yl]amino]pyrimidin-4-yl]amino]methyl]benzenesulfonamide; 4-((5-Bromo-2-((3-methyl-1-(2,2,2-trifluoroethyl)-1H-pyrazol-4-yl)amino)pyrimidin-4-ylamino)methyl)benzenesulfonamide; GSK8612;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 125 mg/mL (~240.23 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.00 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.00 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.00 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。