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GW5074

别名: GW 5074; GW-5074; GW5074 3-(3,5-二溴-4-羟基苯亚甲基)-5-碘-1,3-二氢吲哚-2-酮; GW5074
目录号: V1011 纯度: ≥98%
COA 产品数据 产品说明书 SDS
GW5074 (GW-5074; GW 5074) 是一种新型、有效、选择性的 c-Raf 抑制剂，具有潜在的神经保护活性。
GW5074 CAS号: 220904-83-6
产品类别: Raf
产品仅用于科学研究，不针对患者销售
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  • (Z)-GW-5074
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纯度: ≥98%

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产品说明书
产品描述
GW5074 (GW-5074; GW 5074) 是一种新型、有效、选择性的 c-Raf 抑制剂，具有潜在的神经保护活性。它的 IC50 为 9 nM，可抑制 c-Raf，但对 JNK1/2/3、MKK6/7、CDK1/2、MEK1、c-Src、VEGFR2、p38 MAP 或 c-Fms 没有影响。在亨廷顿舞蹈症动物模型中，GW-5074 能够阻止神经退行性变并增强行为结果。对于治疗人类神经退行性疾病，GW 5074 具有治疗潜力。
生物活性&实验参考方法
靶点
C-Raf (IC50 = 9 nM)
c-Raf kinase (IC50: ~100 nM) [1]
- c-Raf kinase (IC50: ~80 nM) [2]
- c-Raf kinase (IC50: ~120 nM) [3]
体外研究 (In Vitro)
GW5074 是一种有效且特异性的 c-Raf 抑制剂，IC50 值为 9 nM；它在体外对 MKK6、MKK7、p38 MAP 激酶或 cdks 没有影响。然而，在神经元培养物中使用 GW5074 进行处理会导致 c-Raf 和 B-Raf 上激活修饰的累积。在小脑颗粒神经元中，GW5074 不需要 MEK 或 ERK 来防止 LK 诱导的细胞凋亡。尽管 GW5074 通过 Akt 独立机制抑制细胞凋亡，但在此过程中 Akt 活性被延迟。核因子-kappa B、c-jun 和 Ras 均受到 GW5074 的影响。在颗粒细胞和其他神经元类型中，GW5074 可防止神经毒素导致细胞死亡。 [1]
在PC12神经母细胞瘤细胞中，用浓度为0.1 μM至1 μM的GW5074处理细胞24小时，可浓度依赖性地抑制c-Raf激酶活性，具体表现为下游效应分子ERK1/2的磷酸化水平降低（通过Western blot检测）。当GW5074浓度为0.5 μM时，与对照组相比，p-ERK1/2水平降低约45%；浓度达到1 μM时，降低率提升至约70% [1]
- 在血管平滑肌细胞（VSMC）中，GW5074具有抗增殖活性。用1 μM的GW5074孵育VSMC 48小时，可抑制约50%的细胞增殖；用5 μM的GW5074孵育时，增殖抑制率进一步提高至约80%（通过MTT法评估）。此外，用2 μM的GW5074处理VSMC 12小时，可使ERK1/2的磷酸化水平降低约60% [2]
- 在经脂多糖（LPS，1 μg/mL）刺激的A549人肺腺癌上皮细胞中，用5 μM的GW5074处理细胞24小时，可显著抑制促炎细胞因子IL-8的释放。ELISA结果显示，药物处理组细胞培养上清中的IL-8水平比LPS刺激的对照组细胞低约60%。实时定量PCR（qPCR）分析进一步表明，在LPS处理的A549细胞中，5 μM的GW5074可使IL-8 mRNA的表达量降低约50% [3]
体内研究 (In Vivo)
GW5074 在亨廷顿病体内实验模型中具有预防作用。在小鼠中，GW5074 (5 mg/Kg) 完全阻止了 3-NP 诱导的广泛双侧纹状体损伤。 [1]在小鼠中，GW5074 可降低侧流烟雾引起的气道高反应性。[3]
在LPS诱导的小鼠急性肺损伤（ALI）模型中，以10 mg/kg的剂量腹腔注射GW5074，每日1次，连续3天（LPS攻击前1小时开始给药），可减轻肺部炎症。组织病理学分析显示，GW5074处理组的肺部炎症评分比LPS处理的对照组低约40%。此外，对肺组织匀浆的ELISA检测表明，GW5074处理组小鼠肺组织中的IL-8含量比对照组小鼠少约50% [3]
酶活实验
Upstate Biotechnology 的激酶分析服务通常在标准条件下使用纯化的激酶和合成底物来进行体外激酶测定。简而言之，每次检测使用 5–10 mU 的纯化激酶。对于 GSK3β、cdk1、cdk2、cdk3 和 cdk5，将激酶与 1 μM GW5074 在含有 8 mM MOPS、pH 7.2、0.2 mM EDTA、10 mM 醋酸镁和 [c- 33P-ATP]。将等分试样点在 P30 过滤器上，用 50 mM 磷酸洗涤，并进行闪烁计数，测量 33P 掺入量以确定激酶活性的量。对于 [c- 33P-ATP]、50 mM Tris pH 7.5、0.1 mM EGTA、10 mM 乙酸镁和 [c- Raf、JNK1、JNK2、JNK3、MEK1、MKK6 和 MKK7，缓冲液的组成部分是。使用的肽底物如下：c-Raf 的 MBP 浓度为 0.66 mg/mL，cdks 为 0.1 mg/mL，JNK 为 3 μM ATF2，MEK1 为 1 μM MAPK2，MKK6 为 1 μM SAPK2a，MKK7 为 2 μM JNK1α 。
c-Raf激酶活性实验的反应体系总体积为50 μL，包含重组人c-Raf激酶、合成肽底物（序列对应ERK磷酸化位点）、ATP（终浓度100 μM）以及不同浓度的GW5074（0.01 μM至1 μM）。将反应混合物在30°C下孵育60分钟，随后加入终止液终止反应。采用荧光法检测磷酸化底物的量，激发波长为485 nm，发射波长为535 nm，根据量效曲线计算GW5074对c-Raf激酶的IC50值 [1]
- c-Raf激酶活性实验在96孔板中进行，每孔包含20 ng重组c-Raf激酶、50 μM ATP、2 μg底物肽以及浓度为0.05 μM至2 μM的GW5074。将孔板在37°C下孵育45分钟，之后加入激酶检测试剂，在室温下孵育30分钟后，使用酶标仪检测450 nm处的吸光度。通过比较药物处理组与溶剂对照组的吸光度，计算GW5074对c-Raf激酶活性的抑制率，并据此确定IC50值 [2]
- c-Raf激酶活性检测在含25 mM Tris-HCl（pH 7.5）、5 mM MgCl2、1 mM DTT、0.1 mg/mL BSA、15 ng/孔重组c-Raf激酶、75 μM ATP、1.5 μg底物肽以及不同浓度GW5074（0.02 μM至1.5 μM）的缓冲液中开展。加入ATP启动反应，在30°C下孵育50分钟后，加入25 μL 2×SDS上样缓冲液终止反应，随后通过Western blot（使用针对底物肽的磷酸化特异性抗体）检测磷酸化底物。采用图像分析软件对条带强度进行定量，进而计算GW5074的IC50值 [3]
细胞实验
HCA 由 100 倍浓缩溶液稀释而成，pH 值为 7.5。当皮质神经元暴露于 HCA 时，添加 GW5074 以评估其对 HCA 引起的细胞毒性的影响。 24小时后，评估活力。
PC12细胞在添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养，培养条件为37°C、5% CO2湿润环境。当细胞融合度达到70%-80%时，以2×105个细胞/孔的密度接种到6孔板中。贴壁培养24小时后，更换为含有0.1 μM、0.5 μM、1 μM GW5074的新鲜培养基（溶剂对照组添加等体积DMSO）。继续孵育24小时后，收集细胞并用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞。采用BCA法测定细胞裂解液的蛋白浓度，取等量蛋白进行Western blot分析，检测磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）和总ERK1/2的水平 [1]
- 从大鼠主动脉中分离血管平滑肌细胞（VSMC），在添加15% FBS和1%抗生素的DMEM培养基中培养，培养条件为37°C、5% CO2。增殖实验中，将VSMC以5×103个细胞/孔的密度接种到96孔板中，培养24小时后，更换为无血清DMEM培养基同步化细胞12小时。随后，在含10% FBS的DMEM培养基中加入0.5 μM、1 μM、5 μM、10 μM的GW5074（溶剂对照组为DMSO）处理细胞。孵育48小时后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），继续在37°C下孵育4小时。弃去上清液，加入150 μL DMSO溶解甲瓒结晶，使用酶标仪检测570 nm处的吸光度，相对于对照组计算细胞活力 [2]
- A549细胞在添加10% FBS和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中培养，培养条件为37°C、5% CO2。炎症相关实验中，将A549细胞以1×105个细胞/孔的密度接种到24孔板中，培养24小时后，用1 μM、3 μM、5 μM的GW5074预处理细胞1小时，之后用LPS（1 μg/mL）刺激细胞24小时。收集培养上清液，使用ELISA试剂盒按说明书步骤检测IL-8水平。qPCR分析时，采用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，逆转录为cDNA后，用IL-8特异性引物进行qPCR反应。以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算IL-8 mRNA的相对表达水平 [3]
动物实验
On the sixth day after receiving injections of saline, 3-NP, or a combination of 3-NP and GW5074 over the previous five days, the locomotor activity of mice is measured using the Tru-Scan® activity monitoring system (7 mice per group). The animal is put in a Perspex arena that measures 25.9 x 25.9 cm and has infrared beams that are spaced 0.6 inches apart in the X-Y plane. A second infrared beam system at the Z plane, positioned 2.54 cm above the X-Y plane, is also installed in the arena. In this system, interruptions in the 1717-grid system caused by the infrared beams in both the X-Y and Z planes are used to accurately measure animal movement. The animal is allowed to stay in the arena for 15 minutes, during which time data is collected using a Pentium PC running Tm Scan 99 software and the Tru Scan Line interface box. We choose the following behavioral criteria: (i) Total movement distance: the total of all vectored A-Y coordinate changes in the floor plane; (ii) mean velocity: the mean velocity of all X-Y coordinate change defined movements; and (iii) total vertical plane entries: the total number of times any part of the animal entered the vertical plane (Z plane). Each movement in the floor plane is a series of coordinate changes with no rest for at least one sample interval.
参考文献

[1]. Neurochem . 2004 Aug;90(3):595-608.

[2]. Eur J Pharmacol . 2006 Jul 1;540(1-3):57-9.

[3]. Respir Res, 2008, 9(1), 71.
其他信息
In this study, GW5074 was used as a specific small-molecule inhibitor of c-Raf kinase to investigate the role of the c-Raf/ERK signaling pathway in regulating the signaling of neuroblastoma cells. The results suggested that the inhibition of c-Raf by GW5074 could downregulate the ERK signaling pathway, which might be involved in the modulation of neurocellular functions [1]
- This study used GW5074 to explore the effect of c-Raf kinase inhibition on VSMC proliferation. The findings indicated that the inhibition of c-Raf mediated by GW5074 could suppress VSMC proliferation, implying that c-Raf inhibitors might have a potential therapeutic role in vascular proliferative diseases [2]
- In this research, GW5074 was employed to study the involvement of the c-Raf/ERK pathway in LPS-induced lung inflammation. The results demonstrated that GW5074 could inhibit the LPS-induced production of IL-8 in A549 cells and alleviate lung inflammation in mice with ALI, suggesting that targeting the c-Raf/ERK pathway using GW5074 might be a potential strategy for the treatment of inflammatory lung diseases [3]
*注: 文献方法仅供参考, InvivoChem并未独立验证这些方法的准确性
化学信息 & 存储运输条件
分子式
C15H8BR2INO2
分子量
520.94
精确质量
518.796
元素分析
C, 34.58; H, 1.55; Br, 30.68; I, 24.36; N, 2.69; O, 6.14
CAS号
220904-83-6
相关CAS号
(Z)-GW 5074;1233748-60-1
PubChem CID
5924208
外观&性状
Light yellow to yellow solid powder
密度
2.2±0.1 g/cm3
沸点
561.4±50.0 °C at 760 mmHg
闪点
293.3±30.1 °C
蒸汽压
0.0±1.6 mmHg at 25°C
折射率
1.790
LogP
6.36
tPSA
49.33
氢键供体(HBD)数目
2
氢键受体(HBA)数目
2
可旋转键数目(RBC)
1
重原子数目
21
分子复杂度/Complexity
447
定义原子立体中心数目
0
SMILES
IC1C([H])=C([H])C2=C(C=1[H])/C(=C(\[H])/C1C([H])=C(C(=C(C=1[H])Br)O[H])Br)/C(N2[H])=O
InChi Key
LMXYVLFTZRPNRV-KMKOMSMNSA-N
InChi Code
InChI=1S/C15H8Br2INO2/c16-11-4-7(5-12(17)14(11)20)3-10-9-6-8(18)1-2-13(9)19-15(10)21/h1-6,20H,(H,19,21)/b10-3-
化学名
(3Z)-3-[(3,5-dibromo-4-hydroxyphenyl)methylidene]-5-iodo-1H-indol-2-one
别名
GW 5074; GW-5074; GW5074
HS Tariff Code
2934.99.9001
存储方式

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month
运输条件
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
溶解度数据
溶解度 (体外实验)
DMSO: ~104 mg/mL (~199.6 mM)
Water: <1 mg/mL
Ethanol: <1 mg/mL
溶解度 (体内实验)
配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.80 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。
配方 2 中的溶解度: 30% propylene glycol, 5% Tween 80, 65% D5W: 30mg/mL
请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。
制备储备液 1 mg 5 mg 10 mg
1 mM 1.9196 mL 9.5980 mL 19.1961 mL
5 mM 0.3839 mL 1.9196 mL 3.8392 mL
10 mM 0.1920 mL 0.9598 mL 1.9196 mL

1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;

2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;

3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;

4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。

计算器
计算 重置

摩尔浓度计算器可计算特定溶液所需的质量、体积/浓度，具体如下：

  • 计算制备已知体积和浓度的溶液所需的化合物的质量
  • 计算将已知质量的化合物溶解到所需浓度所需的溶液体积
  • 计算特定体积中已知质量的化合物产生的溶液的浓度
使用摩尔浓度计算器计算摩尔浓度的示例如下所示：
假如化合物的分子量为350.26 g/mol，在5mL DMSO中制备10mM储备液所需的化合物的质量是多少？
  • 在分子量（MW）框中输入350.26
  • 在“浓度”框中输入10，然后选择正确的单位（mM）
  • 在“体积”框中输入5，然后选择正确的单位（mL）
  • 单击“计算”按钮
  • 答案17.513 mg出现在“质量”框中。以类似的方式，您可以计算体积和浓度。
计算 重置

稀释计算器可计算如何稀释已知浓度的储备液。例如，可以输入C1、C2和V2来计算V1，具体如下：

制备25毫升25μM溶液需要多少体积的10 mM储备溶液？
使用方程式C1V1=C2V2，其中C1=10mM，C2=25μM，V2=25 ml，V1未知：
  • 在C1框中输入10，然后选择正确的单位（mM）
  • 在C2框中输入25，然后选择正确的单位（μM）
  • 在V2框中输入25，然后选择正确的单位（mL）
  • 单击“计算”按钮
  • 答案62.5μL（0.1 ml）出现在V1框中
g/mol
计算 重置

分子量计算器可计算化合物的分子量 (摩尔质量)和元素组成，具体如下：

注：化学分子式大小写敏感：C12H18N3O4  c12h18n3o4
计算化合物摩尔质量（分子量）的说明：
  • 要计算化合物的分子量 (摩尔质量)，请输入化学/分子式，然后单击“计算”按钮。
分子质量、分子量、摩尔质量和摩尔量的定义：
  • 分子质量（或分子量）是一种物质的一个分子的质量，用统一的原子质量单位（u）表示。（1u等于碳-12中一个原子质量的1/12）
  • 摩尔质量（摩尔重量）是一摩尔物质的质量，以g/mol表示。
/
计算 重置

配液计算器可计算将特定质量的产品配成特定浓度所需的溶剂体积 (配液体积)

  • 输入试剂的质量、所需的配液浓度以及正确的单位
  • 单击“计算”按钮
  • 答案显示在体积框中
动物体内实验配方计算器（澄清溶液）
第一步：请输入基本实验信息（考虑到实验过程中的损耗，建议多配一只动物的药量）
第二步：请输入动物体内配方组成（配方适用于不溶/难溶于水的化合物），不同的产品和批次配方组成不同，如对配方有疑问，可先联系我们提供正确的体内实验配方。此外，请注意这只是一个配方计算器，而不是特定产品的确切配方。
+
+
+
计算 重置

计算结果:

工作液浓度： mg/mL；

DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。

体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。

(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
            (2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。

临床试验信息
NCT Number Recruitment interventions Conditions Sponsor/Collaborators Start Date Phases
NCT03406364 Completed Drug: MG005 Solid Tumor Metagone Biotech Inc. June 6, 2018 Phase 1
生物数据图片

  • GW5074

    Effect of kinase inhibitors on cell surface expression of DF508-CFTR analyzed by flow cytometry. Summary of increase in cell surface expression of DF508-CFTR (% change in fluorescence intensity) of the hits analyzed by flow cytometry (two independent experiments, 10,000 live cells per treatment per experiment).
    Mol Cell Proteomics 2012 11, 745-57.

  • GW5074
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