PCC-0208009

IDO (IC50 = 4.52 nM)

PCC0208009 可作为一种间接 IDO1 抑制剂，因为它能抑制 HeLa 细胞中的 IDO1 活性，IC50 值为 4.52 nM，同时对体外酶活性没有影响[1]。 PCC0208009（0-200 nM；48 小时）剂量依赖性地抑制 IFN-γ 诱导的 IDO 蛋白和 mRNA 表达 [3]。

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PCC-0208009/PCC对HeLa细胞存活和增殖的影响[3]
单独用IFN-γ和PCC-0208009/PCC或PCC加IFN-γ处理HeLa细胞后，检查细胞的存活率和增殖情况。存活率测定的结果如图2（a）所示；PCC和IFN-γ单独组或联合治疗组的活细胞百分比与赋形剂组相比没有显著差异（P>0.05）。增殖试验结果如图2（b）所示；PCC和IFN-γ单独或联合治疗组的IR与赋形剂组相比也没有显著差异（P > 0.05), IRs小于8%。这些结果表明，25-200nM PCC或/和100ng/mL IFN-γ对HeLa细胞的存活率和增殖没有明显影响。

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PCC-0208009/PCC对HeLa细胞IDO活性和表达的影响[3]
IDO在IFN-γ诱导的HeLa细胞中高度表达，广泛用于IDO抑制剂的活性筛选。用100ng/mL IFN-γ诱导10-20小时后，通过Kyn/Trp测定观察到IDO在HeLa细胞中高度表达。本研究在IFN-γ诱导24小时后检测了PCC-0208009/PCC对HeLa细胞的IDO抑制作用。如图2（c）所示，IFN-γ组IDO活性（Kyn/Trp）维持在高水平，10小时后高度表达。在PCC组中，从药物添加到至少72小时，IDO的活性被有效抑制到载体组的水平。
用IFN-γ或IFN-γ加PCC-0208009/PCC处理HeLa细胞48小时，检测IDO在蛋白质和mRNA水平的表达。蛋白质印迹分析的结果如图2（d）和（e）所示；在载体组中几乎检测不到IDO蛋白的表达水平，但经IFN-γ治疗后显著升高。PCC剂量依赖性地抑制IFN-γ诱导的IDO蛋白表达，在100和200 nM时显示出显著差异（P<0.05）。qRT-PCR的结果如图2（f）所示；载体组IDO mRNA表达水平较低，与载体组相比，IFN-γ治疗显著增加（P < 0.05). PCC可剂量依赖性地抑制IFN-γ诱导的IDO mRNA表达，与IFN-γ组相比，在所有剂量下均显示出显著差异（P < 0.05).

在体重为 180-200 克的成年雄性 Sprague Dawley 大鼠中，给药 60、120 和 240 分钟后，在血浆和脑样本中发现了 PCC-0208009（单次口服管饲；50 毫克/千克）。给药后 60 分钟，血浆和大脑中 PCC0208009 的浓度达到最大。 Kyn/Trp 比率也在给药后 60、120 和 240 分钟同时下降，在大脑和血浆中于 60 分钟达到峰值[1]。在成年雄性 Sprague Dawley 大鼠（180 g–200 g）中，给药后 30、60 和 90 分钟检测 PCC0208009（口服灌胃；一次；12–50 mg/kg），以评估 PCC0208009 对神经性疼痛的镇痛作用 [1]。

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在接受脊髓神经结扎（SNL）的大鼠中，ACC和杏仁核中的IDO1表达水平升高。PCC-0208009在福尔马林试验和SNL模型中减弱了疼痛相关行为，并在不影响运动活动和睡眠的剂量下增加了SNL大鼠的认知和焦虑行为。PCC028009通过抑制IL-6-JAK2/STAT3-ID01-GCN2-IL-6通路抑制ACC和杏仁核中IDO1的表达。此外，PCC028009通过抑制ACC和杏仁核中的NMDA2B受体和CDK5/MAP2或CDK5/Tau通路，在功能和结构水平上逆转了突触可塑性。[1]
结论和意义：这些结果支持IDO1介导的分子机制在神经性疼痛中的作用，并表明IDO1抑制剂PCC0208009具有选择性疼痛抑制作用，可能是治疗神经性疼痛的有用药物。[1]

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在小鼠胶质瘤GL261异位模型中，检测了PCC-0208009对l-犬尿氨酸/色氨酸（Kyn/Trp）、肿瘤生长、肿瘤内T细胞流式细胞术以及IDO和Ki67免疫组织化学的影响。在大鼠胶质瘤C6原位模型中，检查了动物存活率、肿瘤内T细胞的流式细胞术以及增殖细胞核抗原（PCNA）和IDO的免疫组织化学。结果表明，PCC028009是一种高效的IDO抑制剂，不仅直接抑制IDO活性，而且在转录和翻译水平上参与IDO表达的基因调控。PCC028009通过增加肿瘤内CD3+、CD4+和CD8+T细胞的百分比并抑制肿瘤增殖，显著增强了替莫唑胺在GL261和C6模型中的抗肿瘤作用。这些发现表明，PCC0208009可以增强替莫唑胺的抗肿瘤疗效，并表明基于IDO抑制剂的免疫治疗与化疗的联合是治疗脑肿瘤的潜在策略。[3]

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PCC-0208009在福尔马林试验中的作用[1]
足底注射福尔马林（2.5%，20μL）诱导了典型的双相伤害反应，包括退缩和舔舐。PCC028009以剂量依赖的方式显著抑制了第二阶段（15分钟-45分钟）（25、50、100 mg·kg-1，图2；F（5,78）=18.10，p<0.001）。此外，60 mg·kg-1普瑞巴林组与50或100 mg·kg-1PCC-0208009组之间没有显著差异（p>0.05）。

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PCC-0208009对SNL大鼠持续疼痛的影响[1]
持续疼痛是神经性疼痛的主要症状。在这里，我们测试了PCC-0208009是否可以使用CPP和开放式现场测试方法来减轻持续的疼痛，这两种方法是检测持续疼痛的两种广泛使用的方法。 在预处理阶段，所有大鼠都喜欢黑色墙壁和光滑地板的房间，各组之间没有显著差异。与赋形剂组相比，12.5、25和50 mg·kg-1 PCC028009显著增加了大鼠在药物配对室中的时间（图3A；F（5,66）=17.43，p<0.001）。此外，25和50 mg·kg-1 PCC028009在诱导CPP方面与30 mg·kg−1普瑞巴林表现出相似的效果（p>0.05）。

由于疼痛的存在会减少一般运动，我们使用开放场试验直接测量PCC-0208009是否可以恢复SNL大鼠疼痛抑制的运动。如图3所示，与假手术大鼠相比，车辆处理的SNL大鼠的运动和饲养频率较低。普瑞巴林和50 mg·kg-1 PCC028009均显著逆转了疼痛引起的低运动（图3B-C；运动，F（5,66）=2.48，p<0.05；饲养，F（5,66）=2.34，p=0.051），而所有三个剂量的PCC028009在增加运动活动和饲养行为方面与普瑞巴林（30mg·kg-1）表现出相似的程度（p>0.05）。

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PCC-0208009对SNL诱导的机械和热超敏反应的影响 [1]
在单次PCC028009剂量后，对大鼠进行机械性异常性疼痛测试。SNL组术后10天内平均PWT降至2.83 g±0.76 g，与假手术组（12.09 g±0.30 g）有显著差异。12.5、25和50 mg·kg-1 PCC028009在单次给药后30、60和90分钟剂量依赖性地增加了PWT，给药后60分钟观察到峰值抗异常性疼痛作用（图3D；F（7,88）=143.53，p<0.001；普瑞巴林，F（7,88）=78.77，p<0.001；12.5 mg·kg-1 PCC028009，F（7,88）=12.00，p<0.01；25 mg·kg-1 PCC028009，F（7,88）=21.53，p<0.001；50 mg·kg-1 PCC028009，F（7,88）=42.76，p<0.001）

我们进一步测试了PCC-0208009在给药后60分钟对接受重复药物治疗的大鼠的镇痛作用。PCC028009（12.5、25、50 mg·kg−1）以剂量依赖的方式显著增加了POD17和POD24的PWT（图3F；F（5,66）=109.59，p<0.001；普瑞巴林，F（5,66）=81.36，p<0.001；12.5 mg·kg-1 PCC028009，F（5,66）=12.04，p<0.01；25 mg·kg-1 PCC028009，F（5,66）=34.96，p<0.001；50 mg·kg-1 PCC028009，F（5,66）=53.69，p<0.001）。此外，高剂量PCC0208009（50 mg·kg-1）对POD17和POD24的影响与30 mg·kg−1普瑞巴林相似（p>0.05）

在POD11上单剂量注射PCC-0208009后测试热异常性疼痛。SNL载体大鼠的PWL从10.76 s±0.56 s显著降低到6.40 s±0.45 s。PCC028009在12.5、25和50 mg·kg-1的剂量下，以剂量依赖的方式增加了给药后30、60和90 min的PWL（图3E；F（7,88）=39.91，p<0.001；普瑞巴林，F（7,88）=35.88，p<0.001；25 mg·kg-1 PCC028009，F（7,88）=23.13，p<0.05；50 mg·kg-1 PCC028009，F（7,88）=29.37，p<0.001）。

在POD18和POD25上也检查了PCC-0208009对热异常性疼痛的重复治疗。与赋形剂组相比，25和50 mg·kg-1 PCC028009均显著增加了PWL（图3G；F（5,66）=45.05，p<0.001；普瑞巴林，F（5,66）=51.82，p<0.001；12.5 mg·kg-1 PCC028009，F（5,66）=14.63，p<0.01；25 mg·kg-1 PCC028009，F（5,66）=34.24，p<0.001；50 mg·kg-1 PCC028009，F（5,66）=33.08，p<0.001）。PCC028009（50 mg·kg-1）的镇痛效果优于30 mg·kg−1普瑞巴林（p>0.05），尽管在统计学上并不显著。

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PCC-0208009对SNL诱导的认知缺陷和焦虑行为的影响[1]
认知障碍和焦虑等情绪障碍是临床上慢性神经性疼痛的重要共病表现，尽管在临床前疼痛研究中很少与疼痛敏感性一起进行评估。每天用PCC-0208009治疗大鼠28天，以检查其对神经性疼痛引起的认知改变和焦虑效应的影响。

在Morris水迷宫测试中，SNL大鼠比假大鼠花更多的时间搜索平台，50 mg·kg-1 PCC-0208009阻止了这种效果（图4C；F（23216）=9.03，p<0.001）。在探针测试（POD25）期间，SNL大鼠在目标象限的时间比假大鼠少，12.5、25和50 mg·kg-1 PCC028009组防止了这种损伤（图4D；F（5,54）=5.82，p<0.001）
在EOM测试中，SNL大鼠在开放区域停留的时间比假大鼠少（图4E；F（5,66）=4.37，p<0.01），活动性也比假大白鼠低（图4F；F（5-66）=5.57，p<0.001），表明存在焦虑样表型。25和50 mg·kg-1 PCC028009显著增加了大鼠在开放区域的时间，而不会改变SNL大鼠的运动活动。

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PCC-0208009对运动、镇静和翻正反射丧失的影响[1]
在旋转棒试验中，SNL大鼠在转子鼓上花费的时间和从鼓上脱落的速度显著减少。50 mg·kg-1 PCC028009显著增加了脱落前的持续时间和最大速度（图5A；F（5,66）=4.29，p<0.01；图5B；F（5,66）=4.18，p<0.01），而30 mg·kg-1普瑞巴林未能达到统计学意义（p>0.05）。

在单次给药后的开放场试验中，与对照组大鼠相比，12.5、25或50 mg·kg-1 PCC-0208009没有显著降低整体运动活性，但30 mg·kg−1普瑞巴林显著降低了大鼠的运动活性（p<0.001）

在戊巴比妥诱导的翻正反射丧失实验中，PCC028009在高达100 mg·kg-1的剂量下没有增强戊巴比妥诱导翻正反射的亚阈值剂量，因此与正常对照小鼠相比，小鼠表现出相似的睡眠潜伏期（图5E；F（5,66）=7.02，p<0.001）和睡眠持续时间（图5F；F（4,55）=27.19，p<0.001），以及进入睡眠的小鼠数量（图5D；Mann-Whitney检验，p<0.01）。相比之下，60 mg·kg-1普瑞巴林显著增加了小鼠翻正反射的丧失（p<0.001）。

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PCC-0208009对SNL大鼠ACC和杏仁核IDO1酶活性的影响 与假手术组相比，SNL大鼠ACC和杏仁核中的Kyn/Trp比值显著增加，这在脊髓背角和海马中也有观察到，表明IDO1酶活性增加（图6A；脊髓背角，F（2,15）=4.84，p<0.05；海马，F（2,15）=8.21，p<0.01；ACC，F（2,15）=11.41，p<0.001；杏仁核，F（2,15）=5.05，p<0.05）。与假手术大鼠相比，SNL大鼠的Ido1 mRNA和Ido1蛋白表达也升高。PCC028009在显著降低SNL大鼠疼痛相关行为的剂量（50 mg·kg-1）下，显著降低了ACC、杏仁核、海马和脊髓背角中的Kyn/Trp比值，并显著降低了Ido1 mRNA（图6B；ACC，F（2,14）=8.41，p<0.005；杏仁核，F（2,14）=23.73，p<0.001）和蛋白质表达（图6C-D；ACC，F（2,24）=46.64；杏仁核，F（2,14）=16.45，均p<0.001）。

在NOR测试中，与假手术组相比，接受SNL手术的大鼠探索新物体的时间要少得多（图4A；F（5,66）=3.40，熟悉物体的p<0.01；F（5,66）=27.22，对于新对象，p<0.001），重复使用25或50 mg·kg-1 PCC028009可显著提高识别指数（图4B；F（5,6）=15.42，p<0.001）。

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PCC-0208009对SNL大鼠ACC和杏仁核中IL-6-JAK2/STAT3-IDO-1-GCN2通路的影响[1]
由于IL-6的激活通过JAK2/STAT3途径增加IDO1的表达[8]，我们研究了间接IDO1抑制剂PCC-0208009对SNL大鼠该途径的影响。 SNL手术上调了ACC和杏仁核星形胶质细胞中IDO1和GFAP的共表达（图6G），同时GFAP蛋白表达增加（图6E-F；ACC，F（2,12）=69.83；杏仁核，F（2,15）=23.21；均p<0.001）。SNL手术还显著增加了促炎细胞因子（IL-6、IL-1β）的产生及其相关受体（IL-6Rα、IL-1R1）的表达（图7A；ACC，F（2,15）=20.33；杏仁核，F（2,15）=10.61；所有p<0.001）（图7A；ACC，F（2,15）=40.12；杏仁核，F（2,15）=26.42；所有p均<0.001）（图7B-C；ACC，F（2,15）=36.89；杏仁核，F（2,15）=28.67；所有p<0.001）（图7D-E；ACC，F（2,12）=27.24；杏仁核，F（2,15）=24.21；所有p<0.001），Thr667处GCN2的磷酸化（图7F-G；ACC，F（2,15）=31.99；杏仁核，F（2,15）=55.71；所有p<0.001），Y1008时的JAK2（图7H-I；ACC，F（2,15）=26.61；杏仁核，F（2,15）=10.48；所有p<0.001）和Tyr705上的STAT3（图7J-K；ACC，F（2,15）=23.91；杏仁核，F（2,15）=38.39；均p<0.001）。50 mg·kg-1 PCC028009治疗显著减少了这些变化。

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PCC-0208009对SNL大鼠突触可塑性的影响[1]
高尔基体染色用于检查ACC和杏仁核中树突和树突棘的形态变化（图8A）。树突棘总密度（图8B；ACC，F（2,72）=55.76；杏仁核，F（2,72）=37.72；所有p<0.001），蘑菇状数量（图8B；ACC，F（2,72）=28.13；杏仁核，F（2,72）=31.29；所有p<0.001）和薄状（图8B；ACC，F（2,72）=9.52；杏仁核，F（2,72）=21.76；与假手术大鼠相比，接受SNL手术的大鼠的脊柱密度显著增加，50 mg·kg-1 PCC028009治疗可以防止这些形态变化。 PCC/PCC-0208009对GL261皮下小鼠模型中Kyn/Trp的影响[3]
为了研究PCC在体内的生化机制，我们制备了携带GL261的小鼠模型。在小鼠以100mg/kg的剂量腹腔注射单剂量PCC后，在不同时间点测定了血浆和肿瘤中药效生物标志物Kyn/Trp和PCC的水平。如图3（a）所示，PCC在肿瘤和血浆中高度分布。与给药前（0小时）相比，给药后2至8小时，肿瘤和血浆样本中的Kyn/Trp比值均显著降低（P<0.05）（图3（b））。

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PCC/PCC-0208009和TMZ联合治疗GL261皮下小鼠模型[3]
为了探讨PCC联合TMZ对体内肿瘤生长的抗肿瘤作用及其机制，制备了小鼠GL261皮下模型。小鼠用赋形剂、PCC、TMZ或PCC加TMZ治疗。测量动物的体重和肿瘤的体积和重量。通过流式细胞术分析肿瘤样本中的T细胞群，并用免疫组织化学方法检测IDO和Ki67的表达。

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荷瘤小鼠体重[3]
如图3（c）和表1所示，与赋形剂组相比，在研究期间，PCC-0208009/PCC组对动物体重没有显著影响（P > 0.05). 从第12天和第16天到本研究结束，TMZ和PCC加TMZ组的小鼠体重与赋形剂组相比显著降低（P < 0.05). 与研究开始时相比，TMZ组和PCC加TMZ组的体重分别下降了12.56%和12.66%（P < 0.05). 然而，在PCC加TMZ组和TMZ组之间没有观察到体重下降（P > 0.05), 表明PCC不会增加TMZ的副作用。

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肿瘤体积和肿瘤重量[3]
在PCC/PCC-0208009、TMZ和PCC+TMZ组中观察到肿瘤生长的抑制作用，PCC联合TMZ对肿瘤生长的影响比单独使用PCC或TMZ更强（图3（d））。研究结束时，PCC、TMZ和组合治疗组的平均肿瘤重量明显小于赋形剂组（P < 0.05), 肿瘤IR分别为42.59%、53.01%和70.83%（图3（e）和表1）。PCC组和TMZ组之间的肿瘤重量没有显著差异（P>0.05）。PCC加TMZ组的平均肿瘤重量小于PCC和TMZ两组（P < 0.05).

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GL261肿瘤中的T细胞亚型[3]
为了了解用PCC/PCC-0208009和TMZ治疗的动物的免疫变化，分析了肿瘤内的T细胞群。如图4（a）和（b）所示，与溶媒组相比，PCC组的CD3+、CD4+和CD8+T细胞百分比略有增加（P>0.05），而TMZ组的百分比显著降低（P<0.05）。在PCC+TMZ组中，CD3+细胞百分比显著高于溶媒组和TMZ组（P < 0.05), CD4+和CD8+的百分比高于溶媒组（P>0.05），显著高于TMZ组（P < 0.05).

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GL261肿瘤中IDO和Ki67的表达[3]
采用免疫组织化学检测GL261肿瘤中IDO和Ki67表达的变化。Ki67蛋白是增殖的细胞标志物。如图4（c）和（d）所示，Ki67在载体组中的表达水平很高。在PCC-0208009/PCC和TMZ组中观察到Ki67表达的显著降低（P > 0.05), 与赋形剂组相比，PCC加TMZ组的Ki67表达显著降低（P<0.05）。TMZ组和PCC组之间的Ki67的表达没有显著差异（P>0.05）。IDO的表达如图4（e）和（f）所示。载体组GL261肿瘤中观察到IDO的高表达水平，而PCC组的IDO表达显著降低（P < 0.05).

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PCC-0208009/PCC和TMZ联合治疗C6原位大鼠模型[3]
通过将肿瘤细胞植入SD大鼠的尾状核，制备了大鼠胶质瘤C6的同基因颅内原位模型。肿瘤接种日被指定为第1天。

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动物存活率和体重[3]
动物存活曲线如图5（a）所示。与赋形剂组相比，PCC-0208009/PCC或TMZ组的动物存活率没有显著延长（P > 0.05). PCC加TMZ组的动物存活率明显延长，与赋形剂组（P<0.05）和PCC和TMZ组相比（P<0.05）。

如图5（b）所示，与赋形剂组相比，在研究期间，PCC-0208009/PCC组对大鼠体重没有显著影响（P > 0.05); 从第8天到本研究结束，从第8天至第21天，TMZ组和PCC加TMZ组的大鼠体重明显下降（P < 0.05). 然而，在PCC加TMZ组和TMZ组之间没有观察到体重的额外下降（P > 0.05), 表明PCC在该模型中没有增加TMZ的副作用。

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C6肿瘤中的T细胞亚型[3]
为了了解PCC-0208009/PCC和PCC和TMZ联合治疗抗肿瘤作用的免疫机制，分析了肿瘤内的T细胞群。如图5（c）和（d）所示，与赋形剂组相比，PCC组的CD3+、CD4+和CD8+T细胞百分比增加，范围在40%至70%之间，TMZ组略有下降。在PCC+TMZ组中，CD3+、CD8+和CD4+T细胞的百分比与赋形剂和TMZ组相比显著增加了约两倍。

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免疫组织化学法检测C6肿瘤中PCNA和IDO的表达[3]
免疫组织化学染色结果如图6所示。PCNA表达是胶质瘤的有用预后和诊断生物标志物。19 PCNA在脑组织中的表达非常低，在载体组的肿瘤中高度表达（图6（a））。与溶媒组相比，PCC-0208009/PCC、TMZ和PCC+TMZ组的PCNA显著降低（P < 0.05). 与PCC和TMZ组相比，PCC+TMZ组的PCNA显著降低（P < 0.05). 与赋形剂组相比，PCC组C6肿瘤中的IDO表达显著降低（P<0.05）（图6（b））。

IDO1活性测定[1]
通过LC-MS/MS系统分析脊髓和脑中Trp和Kyn的浓度。对大鼠（每组6只）实施安乐死，并在给药后解剖和收获L3-L4脊髓背角、海马、ACC和杏仁核组织，以测定IDO1活性。所有组织均用去离子水（40μL中含10mg组织）均质化，离心并收集上清液。使用PK研究中描述的方法确定每个组织中Kyn/Trp的比率。

蛋白质印迹分析[3]
细胞类型： HeLa 细胞
测试浓度： 0、50、100、200 nM
孵育时间：48小时
实验结果：PCC剂量依赖性地抑制IFN-γ诱导的IDO蛋白表达，在100和200 nM时表现出显着差异（ P<0.05）。

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RT-PCR [3]
细胞类型： HeLa 细胞
测试浓度： 0、50、100、200 nM
孵育持续时间：48小时
实验结果：PCC以剂量依赖性方式抑制IFN-γ的IDO mRNA表达，这在以下时间表现出显着差异：所有剂量与IFN-γ组相比。

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PCC/PCC-0208009对HeLa细胞存活和增殖的影响[3]
HeLa细胞以6×103个细胞/孔的速度接种到96孔板中。培养10-12小时后，用含有100 ng/mL干扰素-γ（IFN-γ）或PCC-0208009的新鲜培养基替换培养基，在25、50、100或200 nM浓度下添加或不添加100 ng/mL IFN-γ，并使用含有0.1%DMSO的培养基作为载体处理。在添加药物后72小时，观察细胞存活率和增殖情况。在存活率测定中，使用CountStar IC1000自动细胞计数器洗涤、胰蛋白酶处理和计数贴壁细胞，并通过0.1%台盼蓝排除法确认计数细胞的存活率，该排除率表示为活细胞的百分比。在增殖试验中，使用3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）法检测细胞。对照细胞的细胞增殖率表示为100%，并计算其他组的相对细胞增殖率。

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PCC/PCC-0208009对HeLa细胞IDO活性的抑制作用[3]
HeLa细胞以6×103个细胞/孔的速度接种在96孔板中。培养10-12小时后，仅用新鲜培养基或含有100 ng/mL IFN-γ的培养基替换培养基。除载体组外，其他组均由IFN-γ诱导24小时。然后，仅用新鲜培养基、含有100 ng/mL IFN-γ的培养基或含有100 nMPCC-0208009的培养基替换培养基。在添加药物后0.5、1、2、5、10、24、48和72小时，收集细胞上清液，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定l-犬尿氨酸（Kyn）和色氨酸（Trp）。

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PCC/PCC-0208009对HeLa细胞IDO表达的影响[3]
HeLa细胞以2×105个细胞/孔的速度接种在6孔板中。培养10-12h后用新鲜培养基替换培养基，分别在50、100和200 nM下为100 ng/mL IFN-γ或100 ng/mL IFN-γ加PCC-0208009。孵育48小时后，收获细胞。分别通过Western blot和定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测IDO在蛋白质和mRNA水平的表达。

动物/疾病模型：成年雄性Sprague Dawley大鼠（180 g-200 g）[1]
剂量：50 mg/kg
给药途径：单次灌胃
实验结果：给药后60分钟，血浆和脑组织中PCC-0208009的浓度达到最高。

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动物/疾病模型：成年雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，脊神经结扎（SNL）[1]
剂量：12.5 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg
给药途径：灌胃
实验结果：展示了行为学测试和时间线。\n

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\n\n福尔马林诱导的炎症性疼痛模型[1]
\n根据改良方案，在透明测试箱（23 cm × 13 cm × 14 cm；长 × 宽 × 高）中对小鼠进行福尔马林测试。在注射福尔马林前60分钟，分别给予假手术组（0.5% CMC-Na，口服）、赋形剂组（0.5% CMC-Na，口服）、普瑞巴林组（60 mg·kg−1，口服）或PCC-0208009组（25、50、100 mg·kg−1，口服），剂量为10 mL·kg−1体重（每组n = 14只小鼠）。注射福尔马林前，小鼠在测试笼中适应10分钟。将20 μL 2.5%福尔马林溶液（36.5–38%甲醛溶液，溶于0.9%生理盐水）皮下注射到小鼠右后爪（假手术组小鼠注射20 μL 0.9%生理盐水），并以5分钟为间隔监测小鼠的疼痛样伤害性防御行为，持续60分钟。观察室后方放置一面镜子，以便清晰观察注射福尔马林的爪子。按所述方法计数注射爪子的舔舐、抖动和抬爪的累计时间（秒）。注射福尔马林后0–5分钟的行为反应被视为第一阶段，注射福尔马林后15–45分钟的行为反应被视为第二阶段。\n

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\n\n神经性疼痛动物模型[1]
\n如前所述，通过结扎L5脊神经诱导神经性疼痛模型。简而言之，大鼠先用戊巴比妥钠（50 mg·kg−1，腹腔注射）麻醉。随后，在后髂嵴水平做一个2 cm长的切口，在冷光照射下显露右侧腰椎脊神经。找到L5脊神经后，小心地将其与相邻的L4脊神经分离，然后用6-0丝线在背根神经节远端进行结扎。最后，用3-0和2-0丝线分层缝合肌肉和皮肤，完成脊神经结扎手术。术后连续三天，每天肌注0.4 mL青霉素以预防感染。在假手术组中，不进行L5神经结扎。大鼠在行为测试前恢复7天。\n

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\n\nSNL大鼠的实验设计[1]
\n行为测试的时间线和实验设计如图1E所示。实验1至4均针对SNL大鼠，每个实验组包含12只大鼠，但并非同一批动物。\n实验1：为了评估急性剂量PCC-0208009对神经性疼痛的镇痛作用，使用了六组大鼠（每组n=12），分别进行以下处理：假手术组（0.5% CMC-Na，口服）、溶剂对照组（0.5% CMC-Na，口服）、普瑞巴林组（30 mg·kg−1，口服）和PCC0208009组（12.5、25和50 mg·kg−1，口服）。在脊髓神经结扎术（SNL）后第10天（POD10）和第11天（POD11），分别于给药前和给药后30、60和90分钟测量机械性痛觉过敏和热痛觉过敏。

\n\n实验2：为了测量PCC-0208009对自发性疼痛的镇痛作用，在POD10至POD17期间进行条件性位置偏好（CPP）实验。实验采用六组大鼠（每组n=12），分别进行以下处理：假手术组（0.5% CMC-Na，口服）、溶剂对照组（0.5% CMC-Na，口服）、普瑞巴林组（30 mg·kg−1，口服）和PCC0208009组（12.5、25和50 mg·kg−1，口服）。

\n\n实验3：为了测量重复给药的效果为了研究PCC-0208009对神经性疼痛和运动功能的影响，本研究使用了六组大鼠（每组n=12），分别接受以下治疗：假手术组（0.5% CMC-Na，口服）、溶媒组（0.5% CMC-Na，口服）、普瑞巴林组（30 mg·kg⁻¹，口服）和PCC0208009组（12.5、25和50 mg·kg⁻¹，口服）。药物每日两次口服给药，连续21天。分别于术后第17天和第24天给药后60分钟测量机械性痛觉过敏，于术后第18天和第25天给药后60分钟测量热痛觉过敏。分别于术后第26天至第28天以及第29天给药后60分钟进行转棒试验和旷场试验。此外，在 POD14 收集了 ACC 和杏仁核组织进行免疫荧光分析。术后第30天（POD30）收集脊髓背角、海马、前扣带回皮层（ACC）和杏仁核组织，用于IDO1活性测定；同时收集ACC和杏仁核组织，用于IL-6、IL-1β酶联免疫吸附试验（ELISA）、高尔基-考克斯染色、蛋白质印迹和逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）分析（假手术组n=6；载体组n=6；PCC0208009 50 mg·kg−1组n=6）。\n

\n实验4：为了测量重复给予PCC-0208009对焦虑样行为和认知相关行为的影响，使用了7组大鼠（每组n=12），分别进行以下处理：假手术组（0.5% CMC-Na，口服）、载体组（0.5% CMC-Na，口服）、地西泮组（3 mg·kg−1）、利培酮（1 mg·kg−1）和 PCC0208009（12.5、25 和 50 mg·kg−1）。药物每日两次口服给药，连续 19 天。在给药后第14天和第15天（POD14和POD15）60分钟进行新物体识别（NOR）测试，在给药后第21天和第25天（POD21和POD25）60分钟进行莫里斯水迷宫（MWM）测试，在给药后第28天（POD28）60分钟进行高架零迷宫（EOM）测试。\n

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\n\n戊巴比妥诱导正常小鼠翻正反射消失[1]
\n小鼠（每组n=12）在透明测试箱（23 cm × 13 cm × 14 cm；长×宽×高）中适应环境至少2小时，然后随机分为六组：赋形剂（0.5% CMC-Na，口服）、地西泮（3 mg·kg−1，口服）、普瑞巴林（60 mg·kg−1，口服）和PCC-0208009（25、50、100 mg·kg−1，口服）。在测试前，小鼠分别接受戊巴比妥钠（28 mg·kg⁻¹，口服）和戊巴比妥钠（28 mg·kg⁻¹，腹腔注射）给药。戊巴比妥钠给药后立即进行30分钟的翻正反射丧失测试。记录在30分钟测试期间出现至少1分钟翻正反射丧失的小鼠数量。睡眠潜伏期定义为戊巴比妥注射到观察到翻正反射消失之间的时间，睡眠持续时间定义为翻正反射消失开始到小鼠恢复翻正反射之间的时间。\n

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\n\n正常大鼠的运动活性[1]
\n大鼠（每组 n = 12）在测试前至少 2 小时被转移到测试室，并随机分为五组：载体（0.5% CMC-Na，口服）、普瑞巴林（30 mg·kg−1，口服）和PCC-0208009（12.5、25、50 mg·kg−1，口服）。给药55分钟后，将大鼠放入测试箱（50 cm × 50 cm × 50 cm；长 × 宽 × 高）中，并使用TopScan监测系统记录和分析其10分钟的运动活性。\n

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\n\n\n\n对药效学生物标志物Kyn/Trp的影响[3]
\n当肿瘤体积达到约300–400 mm3时，小鼠经胃内灌注（ig）单次给予100 mg/kg的PCC-0208009/PCC。给药后0、2、4和8小时，收集血浆和肿瘤组织，用于检测Trp、Kyn和PCC，每个时间点取5只动物。采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定色氨酸（Trp）、犬尿氨酸（Kyn）和PCC的含量。\n

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\n\nPCC-0208009/PCC联合替莫唑胺（TMZ）的抗肿瘤作用[3]
\n当肿瘤体积达到约100 mm³时，将小鼠随机分为四组：载体组、PCC-0208009/PCC组、TMZ组和PCC+TMZ组；每组10只小鼠。PCC组以100 mg/kg的剂量灌胃给药，每日两次；TMZ组以100 mg/kg的剂量灌胃给药，每两天一次；载体组灌胃给药1% SCMC溶液，每日两次。给药体积为0.1 mL/10 g。研究期间，每3或5天测量一次动物体重和肿瘤体积。研究结束时，收集肿瘤并迅速称重。计算各组的平均肿瘤重量（MTW）。抑制率（IR，%）按以下公式计算：IR (%) = [(MTWvehicle − MTWtreatment)/MTWvehicle] × 100。随机选取5个肿瘤进行流式细胞术分析，随机选取3个肿瘤进行免疫组织化学检测。\n

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\n\n动物生存研究[3]
\n根据体重，将动物随机分为四组：载体组、PCC-0208009/PCC组、替莫唑胺组和PCC+TMZ组。每组10只动物。从第5天到第35天，PCC以50 mg/kg的剂量每日两次灌胃给药，TMZ以50 mg/kg的剂量每两天灌胃给药一次，对照组灌胃给予1% SCMC溶液，每日两次。给药体积为0.2 mL/100 g。研究期间，每周测量两次大鼠体重，并记录和分析大鼠的存活时间。动物饲养至死亡或濒死为止。

PCC-0208009 在大鼠单次口服给药后的药代动力学/药效学特征[1]
为了评估 PCC-0208009 在大鼠体内的平均血浆或脑组织浓度-时间曲线以及其对 IDO1 酶活性的抑制作用（该酶活性可将色氨酸转化为犬尿氨酸），我们进行了大鼠药代动力学/药效学试验。在给药后 60、120 和 240 分钟，我们在血浆和脑组织样本中检测到了 PCC-0208009，并且在给药后 60 分钟时，血浆（图 1B）和脑组织（图 1C）中的 PCC-0208009 浓度达到最高。同时，Kyn/Trp 比值在给药后 60、120 和 240 分钟时均有所下降，并且在给药后 60 分钟时，血浆和脑组织中的 Kyn/Trp 比值达到最低值（图 1D）。

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PCC-0208009/PCC 在大鼠脑内的分布 [3]
肿瘤接种后 15 天，大鼠经口灌胃单次给予 50 mg/kg 的 PCC-0208009/PCC，并取大脑和小脑进行 PCC 含量检测。0.5 小时、2.5 小时和 6.5 小时，大脑和小脑中 PCC 含量分别为 122.3 nM/g 和 113.7 nM/g，分别为 70.6 nM/g 和 63.5 nM/g，分别为 32.8 nM/g 和 34.3 nM/g。这些结果表明 PCC 可以穿过血脑屏障并分布到脑内。

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药代动力学 (PK) 和药效学 (PD) 研究 [1]
测定了大鼠血浆和脑组织中 PCC-0208009 的浓度以及犬尿氨酸/色氨酸 (Kyn/Trp) 比值。健康 Sprague-Dawley 大鼠单次口服 50 mg·kg−1 的 PCC-0208009。分别于给药后 60、120 和 240 分钟采集血浆和脑组织样本。脑组织样本在纯水中匀浆（重量与体积比为 4:1）。采用经验证的高效液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 方法测定血浆和脑组织中 PCC-0208009 的浓度，使用配备电喷雾电离 (ESI) 源的 Agilent 1100 系列高效液相色谱系统和 TSQ Quantum Access 串联质谱仪进行分析。样品（5 μL）先用 3 mL 叔丁基甲基醚-二氯甲烷（3/2，v/v）进行液液萃取预处理。流动相为含 0.02 mM 乙酸铵的乙腈-水（80:20，v/v），流速为 0.2 mL·min⁻¹。高效液相色谱系统采用 Symmetry C18 色谱柱（150 mm × 2.1 mm 内径，3.5 μm，Waters，美国，序列号：0124362291265）。色谱参数如下：喷雾电压 4 kV；鞘气和辅助气压力分别为 30 psi 和 5 psi；毛细管温度 350℃；氩气压力 1.5 mTorr。所有样品的碰撞诱导解离电压均为 18 V。监测的离子跃迁（前体到产物）为 m/z 436.1 → 253.9。犬尿氨酸 (Kyn) 和色氨酸 (Trp) 的含量根据实验室先前建立的方法测定。

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PCC-0208009/PCC 在大鼠脑内的分布 [3]
肿瘤接种 15 天后，大鼠经口灌胃单次给予 50 mg/kg 的 PCC。给药后 0.5、2.5 和 6.5 小时，取大脑和小脑，使用 LC-MS/MS 检测 PCC 含量。

[1]. PCC0208009, an indirect IDO1 inhibitor, alleviates neuropathic pain and co-morbidities by regulating synaptic plasticity of ACC and amygdala. Biochem Pharmacol. 2020 Jul;177:113926.

[2]. Development of a series of novel o-phenylenediamine-based indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 2018 Feb 15;28(4):732-736.

[3]. PCC0208009 enhances the anti-tumor effects of temozolomide through direct inhibition and transcriptional regulation of indoleamine 2,3-dioxygenase in glioma models. Int J Immunopathol Pharmacol. Jan-Dec 2018;32:2058738418787991.

背景与目的：吲哚胺2,3-双加氧酶1 (IDO1) 与神经性疼痛相关，IDO1抑制剂已被证实可减轻动物疼痛。一些研究表明，神经性疼痛后海马和脊髓中IDO1表达增加，但前扣带回皮层 (ACC) 和杏仁核中是否存在类似变化尚不清楚，IDO1抑制如何产生镇痛作用也尚不明确。本研究旨在评估间接IDO1抑制剂PCC0208009对神经性疼痛的镇痛作用，并探讨其相关的神经生物学机制。实验方法：采用神经性疼痛大鼠模型，评估PCC0208009对疼痛、认知和焦虑行为的影响。同时评估运动障碍、镇静和嗜睡等症状。采用生化技术检测了前扣带回皮层（ACC）和杏仁核中IDO1介导的信号通路变化。主要结果：在接受脊神经结扎（SNL）的大鼠中，ACC和杏仁核中IDO1的表达水平升高。PCC0208009在福尔马林试验和SNL模型中均能减轻疼痛相关行为，并在不影响运动活性和睡眠的情况下，增强SNL大鼠的认知功能和焦虑行为。PCC0208009通过抑制IL-6-JAK2/STAT3-IDO1-GCN2-IL-6通路来抑制ACC和杏仁核中IDO1的表达。此外，PCC0208009通过抑制ACC和杏仁核中的NMDA2B受体和CDK5/MAP2或CDK5/Tau通路，在功能和结构水平上逆转了突触可塑性。结论和意义：这些结果支持IDO1介导的分子机制在神经性疼痛中的作用，并表明IDO1抑制剂PCC0208009具有选择性镇痛作用，可能成为治疗神经性疼痛的有效药物。[1]

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已发现一系列新型的邻苯二胺类吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）抑制剂。IDO是一种含血红素的酶，在多种癌症的肿瘤微环境中过度表达，这可能导致宿主免疫系统的抑制。对先前报道的二芳醚系列化合物进行合成修饰，获得了额外的分子多样性，并利用这种多样性合成了在HeLa人宫颈癌细胞IDO1活性检测中表现出显著活性的化合物。[2]吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）在人胶质母细胞瘤中高表达，参与肿瘤免疫逃逸和化疗耐药，其表达与肿瘤进展和不良预后密切相关，是胶质母细胞瘤的一个有前景的治疗靶点。IDO抑制剂作为单药疗效有限；因此，与其他疗法联合应用有望用于癌症治疗。本研究旨在探讨IDO抑制剂PCC0208009与替莫唑胺联合用药的抗肿瘤作用及其机制。观察了PCC0208009对HeLa细胞中IDO活性抑制以及mRNA和蛋白表达的影响。在小鼠胶质瘤GL261异位移植模型中，我们检测了PCC0208009对L-犬尿氨酸/色氨酸（Kyn/Trp）比值、肿瘤生长、肿瘤内T细胞流式细胞术分析以及IDO和Ki67免疫组化表达的影响。在大鼠胶质瘤C6原位移植模型中，我们检测了动物存活率、肿瘤内T细胞流式细胞术分析以及增殖细胞核抗原（PCNA）和IDO免疫组化表达。结果表明，PCC0208009是一种高效的IDO抑制剂，它不仅能直接抑制IDO活性，还能参与IDO基因表达的转录和翻译调控。PCC0208009显著增强了替莫唑胺在GL261和C6模型中的抗肿瘤作用，具体表现为增加肿瘤内CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺ T细胞的比例并抑制肿瘤增殖。这些研究结果表明，PCC0208009 可以增强替莫唑胺的抗肿瘤疗效，并提示基于 IDO 抑制剂的免疫疗法与化疗相结合是治疗脑肿瘤的潜在策略。[3]

C29H35N7O

497.6345

497.29

C, 69.99; H, 7.09; N, 19.70; O, 3.21

1668565-74-9

90718185

White to off-white solid powder

6.5

98.8

3

5

9

37

686

0

O=C(N([H])C1C([H])=C([H])C(C([H])([H])[H])=C([H])C=1[H])N([H])C1C([H])=C(C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C2C2N=NN([H])N=2)C([H])=C([H])C=1N(C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H]

CJNMMPAEIYFQIJ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C29H35N7O/c1-19(2)17-36(18-20(3)4)27-15-12-22(24-8-6-7-9-25(24)28-32-34-35-33-28)16-26(27)31-29(37)30-23-13-10-21(5)11-14-23/h6-16,19-20H,17-18H2,1-5H3,(H2,30,31,37)(H,32,33,34,35)

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.02 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.02 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。