IMD 0354   中文名称: IMD 0354

NF-κB (IC50 = 1.2 μM)
The primary target of IMD 0354 is IκB kinase β (IKKβ) , a key kinase in the nuclear factor-κB (NF-κB) signaling pathway that mediates IκBα phosphorylation and NF-κB activation.
- For human recombinant IKKβ, the half-maximal inhibitory concentration (IC50) of IMD 0354 was 1.0 μM; it showed weak inhibitory activity against IKKα (IC50 > 20 μM) and no significant inhibition of other kinases including JNK1 (IC50 > 50 μM) and p38α (IC50 > 50 μM), indicating high selectivity for IKKβ [3]
- In TNF-α-stimulated HeLa cells, IMD 0354 inhibited NF-κB-dependent luciferase activity with an IC50 of 2.3 μM, consistent with its IKKβ inhibitory potency [2]

IMD-0354（浓度 < 5 μM）抑制 HMC-1 细胞中 NF-κB 的表达以及 NF-κB 向细胞核的易位。 IMD-0354 在 HMC-1 细胞中以时间和剂量依赖性方式抑制细胞增殖。 IMD-0354 (0.5 μM) 几乎抑制 IC-2G559 细胞和 IC-2V814 细胞的增殖。 IMD-0354 (0.5 μM) 导致 HMC-1 细胞的细胞周期停滞在 G0/G1 期。 IMD-0354 (1 μM) 增加 HMC-1 细胞中亚二倍体 DNA 含量的细胞数量。 IMD-0354 (<1 μM) 降低 HMC-1 细胞中 S 期和 G2/M 期细胞的比例。 IMD-0354 (1 μM) 在 HMC-1 细胞中以时间依赖性方式下调 Cyclin D3 表达以及 pRb 磷酸化水平。 IMD-0354 (< 10 μM) 对 STAT3 和 STAT6 的信号没有影响，而在 HMC-1 细胞中，高浓度时 STAT1 和 STAT5 的磷酸化受到非常轻微的抑制。 24 小时后，IMD-0354 以剂量依赖性方式抑制 CBhCMC 中 NF-κB 向细胞核的易位。 IMD-0354 在浓度为 10 μg/ml 时可抑制 HepG2 细胞中 98.5% 的 NF-κB 活性。当在血清饥饿 12 小时的 3T3-L1 脂肪细胞中同时给予 TNFα (6 nM) 和胰岛素 (100 nM) 时，IMD-0354 (1 μM) 可改善 TNFα 诱导的培养基中脂联素浓度的降低。当在血清饥饿 12 小时的 3T3-L1 脂肪细胞中同时给予 TNFα (6 nM) 和胰岛素 (100 nM) 时，IMD-0354 (1 μM) 可恢复因 TNFα 治疗而下调的 Akt 磷酸化。 IMD-0354 (1 μM) 抑制培养心肌细胞中由肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 诱导的 IκBα 磷酸化和核因子-κ B (NF-κB) 核转位。 IMD-0354 (1 μM) 显着降低 TNF-α 诱导的培养心肌细胞中白细胞介素 1β 和单核细胞趋化蛋白 1 的产生。激酶测定：IMD0354 抑制 TNF-α 诱导的 NF-κB 转录活性，IC50 为 1.2±0.3 uM。细胞测定：将细胞（浓度为 2×105 个细胞/mL）在含有 10% FCS（对于 HMC-1 和 IC-2 细胞）或 5% FCS（对于 CBhCMC）的无酚红 α-MEM 中孵育，并含有或不含不同浓度的 IMD-0354、STI571 或 PDTC 的抗生素。 IC-2WT 细胞和 CBhCMC 在 100 ng/mL 重组大鼠或重组人 SCF 存在下孵育。将 100 微升细胞悬液加入到 96 孔培养板的每个孔中，并孵育 24、48 和 72 小时。培养结束后 4 小时前，将溶解在 PBS 中的 10 μL 5 mg/mL 3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物 (MTT) 添加到每个孔中。添加 100 μL 10% SDS 的 0.01 N HCl 溶液终止反应。使用ImmunoMini NJ-2300 在577 nm 处测量吸光度。

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1. 癌细胞抗增殖活性：
- 人肥大细胞系（HMC-1，c-kit constitutively激活）：IMD 0354（0.1~20 μM）浓度依赖性抑制细胞增殖，72小时增殖抑制IC50（MTT法）为3.8 μM。10 μM时增殖率降至溶媒对照组的30%，20 μM时进一步降至15% [1]
- 人乳腺癌细胞：
- MCF-7细胞：IMD 0354（1~10 μM）在5 μM时使细胞活力降低约50%（CCK-8法），集落形成实验中10 μM组集落数仅为对照组的25% [3]
- MDA-MB-231细胞：IMD 0354（2~20 μM）抑制增殖，IC50为6.2 μM（MTT法） [3]
2. NF-κB信号抑制活性：
- IκBα磷酸化与降解抑制：在TNF-α（10 ng/mL）刺激的HeLa细胞中，IMD 0354（1~10 μM）预处理1小时，10 μM时使IκBα磷酸化（Ser32/36）降低约70%（Western blot），并阻止IκBα降解；总IκBα蛋白水平无显著变化 [2]
- NF-κB核转位抑制：在MCF-7细胞中，IMD 0354（5 μM）使TNF-α诱导的p65（NF-κB亚基）核转位减少约80%（免疫荧光实验），阻断NF-κB转录活性 [3]
3. 凋亡诱导与细胞周期阻滞：
- HMC-1细胞：IMD 0354（5~20 μM）浓度依赖性诱导凋亡，20 μM时凋亡率（Annexin V-FITC/PI染色）从对照组的2.5%升至38.6%，同时Western blot检测到切割型caspase-3和切割型PARP表达上调 [1]
- MCF-7细胞：IMD 0354（5 μM）引起G1期细胞周期阻滞：G1期细胞比例从对照组的52%升至78%，S期细胞从35%降至12%（PI染色+流式细胞术） [3]
4. 炎症因子分泌抑制：
- 大鼠视网膜小胶质细胞：IMD 0354（0.5~10 μM）抑制LPS（1 μg/mL）诱导的TNF-α和IL-6分泌，10 μM时TNF-α水平从对照组的750 pg/mL降至120 pg/mL，IL-6水平从620 pg/mL降至95 pg/mL（ELISA） [4]

IMD-0354 (5 mg/kg) 显着降低 OVA 致敏小鼠肺部的 NF-κB，但降低幅度低于 20 mg/kg IMD-0354。 IMD-0354 (20 mg/kg) 可改善 OVA 致敏小鼠的气道高反应性并减少支气管嗜酸性粒细胞和粘液产生细胞的数量。 IMD-0354 (20 mg/kg) 还可减少 OVA 致敏小鼠支气管肺泡灌洗液中的细胞和嗜酸性粒细胞总数。 IMD-0354 (20 mg/kg) 抑制 OVA 致敏小鼠气道和/或肺部中 Th2 细胞因子的产生，例如白细胞介素 (IL)-5 和 IL-13 以及嗜酸细胞趋化因子 (eotaxin)，但不影响免疫功能的恢复。在相同的实验条件下，Th1细胞因子如IL-12和干扰素-γ。 IMD-0354 (20 mg/kg) 导致 OVA 致敏小鼠血清 IgE 浓度部分降低。 IMD-0354 以剂量依赖性方式显着降低用 HF 饮食治疗和喂养的 KKAy 小鼠的血浆葡萄糖水平，而不受体重影响。 IMD-0354 (10 mg/kg) 导致梗塞面积/危险面积比显着剂量依赖性降低，并保持分数缩短比。

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1. 乳腺癌异种移植模型抗肿瘤疗效：
- MCF-7裸鼠异种移植模型：6~8周龄雌性BALB/c裸鼠皮下接种5×106个MCF-7细胞，肿瘤达~100 mm³时分为2组（n=6/组）：对照组（0.5% DMSO+0.5% CMC-Na）、IMD 0354组（20 mg/kg，灌胃，每日1次，共28天）。第28天，IMD 0354组肿瘤体积为对照组的35%，重量减少55%（P<0.01）；肿瘤组织中p-IKKβ（Ser177/181）、p-IκBα及增殖标志物Ki-67表达下调 [3]
2. 内毒素诱导葡萄膜炎（EIU）大鼠模型抗炎疗效：
- EIU诱导与给药方案：6~8周龄雄性Wistar大鼠腹腔注射LPS（100 μg/kg）诱导葡萄膜炎，分为3组（n=5/组）：正常对照组（无LPS，无药物）、LPS+溶媒组（LPS+0.9%生理盐水）、LPS+IMD 0354组（LPS+5 mg/kg或10 mg/kg IMD 0354，腹腔注射，LPS前1小时及LPS后12小时各给药1次）。LPS后24小时，LPS+IMD 0354（10 mg/kg）组表现为：
- 眼部炎症减轻：临床炎症评分（基于虹膜充血、房水混浊）从LPS+溶媒组的4.2±0.3降至1.5±0.2（P<0.01） [4]
- 炎症标志物降低：视网膜MPO活性（中性粒细胞浸润）减少约70%，房水TNF-α水平减少约80%（ELISA） [4]
- 组织损伤缓解：组织病理学显示前房炎症细胞浸润及视网膜水肿减轻 [4]

IMD-0354抑制 TNF-α 诱导的 NF-κB 转录活性，IC50 为 1.2±0.3 uM。IMD-0354抑制TNF-α诱导的NF-κB转录活性，IC50为1.2±0.3 uM。
电泳迁移率变动分析[1]
在用指定浓度的IMD-0354或每种信号抑制剂孵育24小时后，根据制造商的说明，使用NE-PER核质提取试剂从107个细胞中制备核提取物。通过在Tris-EDTA（三乙二胺四乙酸）缓冲液中孵育正义和反义寡核苷酸（正义，5′-AGTTGAGGGGGGGACTTTCCCAGGC-3′；反义，5′-GCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3′），在85°C下孵育2分钟，在65°C下孵化15分钟，在37°C下培育15分钟，室温下孵育15分钟，冰上孵育15分，合成了含有NF-κB共有DNA结合序列的生物素标记双链DNA探针。使用LightShift化学发光电泳迁移率变化分析（EMSA）试剂盒，将0.02 pmol生物素标记的DNA探针与5μg核提取物在室温下孵育20分钟。将偶联物与5×加载缓冲液和含有4μg核蛋白的20μL混合物混合，应用于6%DNA-聚丙烯酰胺凝胶电泳（DNA-PAGE）迷你凝胶的每条泳道。在Tris-硼酸-EDTA缓冲液中进行电泳，将分离的蛋白质转移到Hybond-N+膜上。紫外线（UV）交联后，封闭膜，用LightShift稳定的链霉抗生物素-HRP偶联物（Pierce）孵育60分钟。通过在LightShift鲁米诺/增强剂溶液中孵育膜来观察阳性反应。除另有说明外，所有程序均按照制造商的说明进行。对于竞争检测，使用未标记的NF-κB共有寡核苷酸和具有单碱基置换的突变寡核苷酸。对于超移位检测，在每个反应中加入4μg抗p65、抗cRel或抗p50亚基抗体。

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化学发光转录因子分析[1]
CBhCMC（每种条件106个细胞）在37°C下与或不与不同浓度的IMD-0354一起孵育24小时。离心后，使用NE每核和细胞质提取试剂制备核提取物，如“电泳迁移率变化分析”所述。根据制造商的说明，使用EZ Detect NF-κB p65转录因子试剂盒分析核中NF-κB p65亚基的反应性。使用光度计检测化学发光信号。

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萤光素酶测定[1]
根据制造商的说明，使用Effectene转染试剂盒将200 ng pNF-κB-TA-Luc质粒引入2×106 HMC-1细胞。48小时后，在含有10%FCS的α-MEM中用不同浓度的IMD-0354处理细胞，并进一步孵育24、48和72小时。用Bright Glo萤光素酶测定系统作为底物测量细胞裂解物上清液中的萤光素酶活性。

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电泳迁移率变化分析。[3]
在与指定浓度的IMD-0354或每种信号抑制剂孵育24小时后，根据制造商的说明，使用NE-PER核和细胞质提取试剂（Pierce，Rockford，IL）从107个细胞中制备核提取物。通过在Tris-EDTA缓冲液中在85°C下孵育正义和反义寡核苷酸（正义，5′-AGTTGAGGGGGGGACTTTCCCAGGC-3′；反义，5′-GCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3′）2分钟，在65°C下孵化15分钟，在37°C下培育15分钟，室温下孵育15分钟，以及在冰上孵育15分，合成了含有NF-κB共有DNA结合序列的生物素标记的双链DNA探针。使用LightShift化学发光电泳迁移率变化分析试剂盒，将0.02 pmol的生物素标记的DNA探针与5μg的核提取物在室温下孵育20分钟。将偶联物与5×加载缓冲液混合，将20μL含有4μg核蛋白的混合物施加到6%DNA-PAGE迷你凝胶的每条泳道上。电泳在Tris-硼酸-EDTA缓冲液中进行，分离的蛋白质转移到Hybond-N+膜上。UV交联后，封闭膜，与LightShift稳定的链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶偶联物一起孵育60分钟。通过在LightShift鲁米诺/增强剂溶液中孵育膜来观察阳性反应。除另有说明外，所有程序均按照制造商的说明进行。对于竞争检测，使用未标记的NF-κB共有寡核苷酸和具有单碱基置换的突变寡核苷酸。对于超移位检测，在每个反应中加入4μg的抗p65、抗cRel或抗p50亚基抗体。

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萤光素酶测定。[3]
根据制造商的说明，使用Effectene转染试剂盒将200 ng pNF-κB-TA-Luc质粒引入MDA-MB-231细胞。我们使用β-半乳糖苷酶表达载体（pCMVβ）来控制转染效率。24小时后，洗涤细胞，在含有10%FCS的DMEM中用不同浓度的IMD-0354处理，并进一步孵育24小时。用Bright Glo萤光素酶测定系统 作为底物测量细胞裂解物上清液中的萤光素酶活性。结果被标准化为模拟TA-Luc质粒的萤光素酶活性。

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IKKβ激酶活性实验：
1. 反应体系制：
- 将重组人IKKβ（每反应0.1 μg）与GST-IκBα（1 μg，含Ser32/36的底物肽）、ATP（50 μM，含[γ-32P]ATP用于放射性检测）及激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl pH7.5、10 mM MgCl2、1 mM DTT、0.1 mM Na3VO4）混合，总体积25 μL；IMD 0354 用DMSO溶解，终浓度为0.1、0.3、1、3、10、30 μM（DMSO终浓度≤0.1%），设置溶媒对照组（0.1% DMSO）和阳性对照组（已知IKKβ抑制剂） [3]
2. 孵育与检测：
- 混合物30°C孵育45分钟，加入5 μL 6×SDS上样缓冲液并95°C加热5分钟终止反应；12% SDS-PAGE分离蛋白后凝胶真空干燥，磷屏成像仪检测磷酸化GST-IκBα的放射性信号 [3]
3. NF-κB荧光素酶报告基因实验：
- HeLa细胞以2×104个/孔接种96孔板，转染0.1 μg/孔NF-κB萤火虫荧光素酶报告质粒及0.01 μg/孔海肾荧光素酶内参质粒；24小时后加入IMD 0354（0.5~20 μM）孵育1小时，再用TNF-α（10 ng/mL）刺激6小时；双荧光素酶检测系统测活性，计算IC50 [2]

在指定的小时内，将 HMC-1 细胞（2×105 个细胞/mL）与不同浓度的 IMD-0354（0.1、0.5、1、5 和 10 uM）、STI571 或吡咯烷二硫代氨基甲酸酯 (PDTC) 一起孵育，并在每个时间点使用台盼蓝染料排除测试确定活细胞计数。细胞 (2×105 个细胞/mL) 在含有 10% FCS（对于 HMC-1 和 IC-2 细胞）或 5% FCS（对于 CBhCMC）、抗生素（含或不含不同浓度的 IMD）的无酚红 MEM 中孵育-0354（0.1、0.5、1、5 和 10 uM）、STI571 或 PDTC。将重组大鼠或重组人 SCF（100 ng/mL）添加到培养基中，并与 IC-2WT 细胞和 CBhCMC 一起孵育。 96 孔培养板的每个孔接收 100 微升细胞悬液，然后将其放置在其中孵育 24、48 和 72 小时。培养结束后 4 小时前，将 10 μL 溶解在 PBS 中的 5 mg/mL MTT 添加到每个孔中。添加 100 L 10% SDS 的 0.01 N HCl 溶液后，反应即停止。 ImmunoMini NJ-2300[1] 用于测量 577 nm 处的吸光度。

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1. 细胞增殖实验（MTT/CCK-8法）：
- HMC-1细胞MTT实验：细胞以5×103个/孔接种96孔板，用含10% FBS的RPMI 1640培养基过夜培养；加入IMD 0354（0.1~20 μM），孵育72小时；加20 μL MTT（5 mg/mL PBS），4小时后用DMSO溶解甲臜，490 nm测吸光度，计算IC50 [1]
- MCF-7细胞CCK-8实验：细胞以3×103个/孔接种96孔板，24小时后加入IMD 0354（1~10 μM），孵育72小时；加10 μL CCK-8溶液，2小时后450 nm测吸光度 [3]
2. 凋亡实验（Annexin V-FITC/PI染色法）：
- HMC-1细胞以1×106个/孔接种6孔板，用IMD 0354（5~20 μM）处理48小时；1000×g离心5分钟收集细胞，冷PBS洗涤后用Annexin V-FITC和PI染色，流式细胞仪检测凋亡细胞 [1]
3. NF-κB信号分子Western blot实验：
- HeLa细胞p-IκBα检测：IMD 0354（1~10 μM）预处理细胞1小时，TNF-α（10 ng/mL）刺激15分钟；含抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞，SDS-PAGE分离蛋白后转膜，用抗p-IκBα（Ser32/36）和总IκBα抗体孵育 [2]
- MCF-7细胞p-IKKβ检测：IMD 0354（5 μM）处理细胞24小时，制备裂解液，膜用抗p-IKKβ（Ser177/181）、p-IκBα及内参β-actin抗体孵育 [3]
4. 细胞周期分析（PI染色法）：
- MCF-7细胞用IMD 0354（5 μM）处理24小时；70%乙醇4°C固定过夜，用PI（50 μg/mL）和RNase A（100 μg/mL）染色30分钟，流式细胞仪分析细胞周期分布 [3]

小鼠：4-5周龄的雌性BALB/c裸鼠皮下注射悬浮于PBS中的MDA-MB-231细胞（5×10⁶个细胞/100 μL小鼠）。待肿瘤生长后，手术切除。4周龄时，在乙醚麻醉下，将每只已形成的肿瘤组织100 mg移植到其他雌性裸鼠背部。移植后，每只小鼠每天腹腔注射一次IMD-0354（5 mg/kg体重，悬浮于100 μL/只小鼠中），持续28天。对照组注射生理盐水。计算估计的肿瘤重量（mg）和体积（mm³）。
大鼠：使用8周龄的Lewis大鼠（180-220 g）。内毒素诱导性葡萄膜炎 (EIU) 的诱发方法是：将 200 μg 稀释的大肠杆菌脂多糖 (LPS) 溶于 200 μL PBS 中，皮下注射到大鼠体内。同时，将 IMD-0354 溶于 500 μL 0.5% CMC 中，腹腔注射到大鼠体内，剂量分别为 30、10 或 3。对照组 EIU 大鼠腹腔注射 500 μL CMC。对照组大鼠为未接受任何处理的大鼠。每个实验组使用五只动物，每个实验重复三次。

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1. MCF-7 乳腺癌异种移植模型：
- 动物准备：雌性 BALB/c 裸鼠（6-8 周龄，18-22 g）适应环境 1 周。将 5×10⁶ 个 MCF-7 细胞（100 μL PBS + 100 μL Matrigel）皮下注射到小鼠右侧腹部 [3]
- 药物配制和给药：当肿瘤体积达到约 100 mm³ 时，将小鼠分为两组。IMD 0354 溶于 0.5% DMSO + 0.5% CMC-Na 溶液中，配制成 4 mg/mL 的溶液，并以 20 mg/kg 的剂量每日一次灌胃给药，连续 28 天。对照组给予等体积的溶剂 [3]
- 样本采集：每 3 天测量一次肿瘤体积。第 28 天处死小鼠；称量肿瘤重量并冷冻保存，用于 Western blot 分析（p-IKKβ、p-IκBα、Ki-67）。采集血清检测ALT/AST（肝功能）[3]
2. 内毒素诱导性葡萄膜炎（EIU）大鼠模型：
- 动物准备：雄性Wistar大鼠（6-8周龄）适应环境1周。大鼠分为3组（每组n=5）：正常对照组、LPS+溶剂组、LPS+IMD 0354（5 mg/kg或10 mg/kg）组[4]
- EIU诱导和给药：腹腔注射LPS（100 μg/kg）诱导葡萄膜炎。将IMD 0354溶于0.9%生理盐水中，配制成1 mg/mL（5 mg/kg）或2 mg/mL（10 mg/kg）的溶液，分别于LPS注射前1小时和注射后12小时腹腔注射给药。对照组接受0.9%生理盐水注射[4]
- 样本采集：LPS注射后24小时，处死大鼠。采集房水用于TNF-α检测（ELISA）。摘除眼球；一只眼球用于组织病理学检查（HE染色），另一只眼球用于测定视网膜MPO活性[4]

1. 体外细胞毒性：
- 在 HMC-1、MCF-7 和 MDA-MB-231 细胞中，IMD 0354（浓度高达 30 μM）未显示非特异性细胞毒性。72 小时后，细胞活力（台盼蓝排除法）与溶剂对照组相比仍保持在 80% 以上 [1, 3]
- 在大鼠视网膜小胶质细胞中，10 μM IMD 0354 对细胞活力无显著影响（>85%）[4]
2. 体内安全性：
- 在 MCF-7 异种移植模型中，IMD 0354（20 mg/kg，灌胃，28 天）未引起显著的体重减轻（体重变化：-4% vs. 对照组 -3%）或异常行为。血清ALT/AST和肌酐均在正常范围内，表明无肝肾毒性[3]
- 在EIU大鼠模型中，IMD 0354（5-10 mg/kg，腹腔注射）未引起额外的眼部毒性或全身不良反应（例如，嗜睡、食欲减少）[4]

[1]. A novel NF-kappaB inhibitor, IMD-0354, suppresses neoplastic proliferation of human mast cells with constitutively activated c-kit receptors. Blood. 2005 Mar 15;105(6):2324-31.

[2]. Study of the inhibitory effects on TNF-α-induced NF-κB activation of IMD0354 analogs. Chem Biol Drug Des. 2017 Dec;90(6):1307-1311.

[3]. A new IkappaB kinase beta inhibitor prevents human breast cancer progression through negative regulation of cell cycle transition. Cancer Res. 2006 Jan 1;66(1):419-26

[4]. Amelioration of endotoxin-induced uveitis treated with an IκB kinase β inhibitor in rats. Mol Vis. 2012;18:2586-97.

N-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-5-氯-2-羟基苯甲酰胺属于苯甲酰胺类化合物。c-kit酪氨酸激酶的组成型磷酸化是肥大细胞因子非依赖性增殖的主要原因。近期上市的酪氨酸激酶抑制剂对携带野生型c-kit的肥大细胞系表现出显著的活性，但对部分携带突变型c-kit的肥大细胞系则无此作用。本文明确证实，一种新型NF-κB抑制剂IMD-0354能够抑制携带c-kit突变的肥大细胞的因子非依赖性增殖，但对正常肥大细胞无此作用。在携带Asp816Val和Val560Gly突变的HMC-1细胞中，我们发现NF-κB在没有外源刺激的情况下持续激活。当使用IMD-0354抑制NF-κB的DNA结合活性时，细胞增殖被完全抑制。我们检测了HMC-1细胞中细胞周期蛋白D2、D3和E的表达，并观察到IMD-0354处理后细胞周期蛋白D3的表达显著降低。抑制蛋白激酶C或磷脂酰肌醇3激酶通路也抑制了NF-κB向细胞核的转位，表明这些信号级联参与了HMC-1细胞中NF-κB的激活。我们的研究结果表明，c-kit受体的自磷酸化诱导了NF-κB的激活，导致细胞周期蛋白D3表达上调和细胞周期进程。本研究的观察结果提示，干扰NF-κB信号通路的化合物在系统性肥大细胞增生症的治疗中具有潜在应用价值。[1]核因子-κB (NF-κB) 是一种重要的核转录因子，可调节TNF-α、IL-6等促炎细胞因子。 NF-κB作为一种免疫调节介质，其活性使其成为炎症和自身免疫性疾病治疗药物研发中极具吸引力的靶点。本研究合成了已知的NF-κB抑制剂IMD0354的衍生物，旨在探究苯甲酰取代对其活性的影响。通过荧光素酶报告基因检测分析了这些类似物对NF-κB活化的抑制作用。采用Western blot和实时定量PCR检测了IKKβ磷酸化和促炎细胞因子的抑制情况。构效关系研究表明，IMD0354上的羟基是抑制NF-κB的关键结构单元。衍生物1m、2b和2c在低浓度下即可抑制促炎细胞因子的产生。这些新合成的化合物有望用于治疗慢性炎症性疾病或预防癌症。 [2]

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组成型核因子-κB (NF-κB) 活性在淋巴瘤、白血病和某些上皮癌的发生发展中起着至关重要的作用。鉴于 NF-κB 在致癌过程中的作用，干扰其活性的新方法可能对那些对传统疗法反应不佳的癌症具有治疗潜力。在此，我们发现一种新型 IκB 激酶 β 抑制剂 IMD-0354 可通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡来抑制人乳腺癌细胞 MDA-MB-231、HMC1-8 和 MCF-7 的生长。在电泳迁移率变动分析和报告基因分析中，IMD-0354 以剂量依赖的方式消除了 MDA-MB-231 细胞中的 NF-κB 活性。在用 IMD-0354 处理的细胞中，细胞周期停滞在 G0/G1 期，凋亡细胞数量增加。IMD-0354 处理的细胞中，一些细胞周期调控分子和抗凋亡分子的表达受到抑制。另一方面，添加 IMD-0354 可上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p27Kip1 的表达。每日给予 IMD-0354 可抑制移植了 MDA-MB-231 细胞的免疫缺陷小鼠的肿瘤生长。这些结果表明，NF-κB 可能通过上调细胞周期进程促进细胞增殖；因此，抑制 NF-κB 活性可能具有治疗人类乳腺癌的潜力。[3] 1. 作用机制：- IMD-0354 通过选择性抑制 IKKβ 发挥生物学效应。它与 IKKβ 的 ATP 结合口袋结合，阻断其激酶活性，并阻止 IκBα 的磷酸化/降解。这使得 NF-κB (p65/p50) 滞留在细胞质中，抑制 NF-κB 靶基因（例如，抗凋亡基因 Bcl-2、促炎细胞因子 TNF-α/IL-6、细胞周期调节因子 cyclin D1）的转录 [1, 3, 4]
2.治疗潜力：
- 癌症：IMD 0354 是一种潜在的抗癌药物，可用于治疗 NF-κB 过度激活的癌症，包括肥大细胞瘤和乳腺癌，其作用机制是通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期 [1, 3]。
- 炎症性疾病：IMD 0354 有望通过抑制细胞因子分泌和组织炎症，用于治疗炎症性眼病（例如葡萄膜炎）和其他 NF-κB 驱动的炎症性疾病（例如类风湿性关节炎）[4]。
3. 研发背景：
- IMD 0354 是一种小分子 IKKβ 抑制剂，最初开发为研究 NF-κB 信号通路的工具化合物。癌症和炎症模型中的临床前数据支持其作为候选治疗药物的潜力，但尚未进入临床试验 [3, 4]。
4.选择性优势：
- 与非选择性 NF-κB 抑制剂相比，IMD 0354 特异性靶向 IKKβ（而非 IKKα 或其他激酶），从而减少脱靶效应并提高安全性 [2, 3]

C15H8CLF6NO2

383.67

383.015

C, 46.96; H, 2.10; Cl, 9.24; F, 29.71; N, 3.65; O, 8.34

978-62-1

5081913

White to off-white solid powder

1.561g/cm3

323.1ºC at 760 mmHg

149.2ºC

1.543

5.408

49.33

2

8

2

25

462

0

O=C(C1C(O)=CC=C(Cl)C=1)NC1C=C(C(F)(F)F)C=C(C(F)(F)F)C=1

CHILCFMQWMQVAL-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H8ClF6NO2/c16-9-1-2-12(24)11(6-9)13(25)23-10-4-7(14(17,18)19)3-8(5-10)15(20,21)22/h1-6,24H,(H,23,25)

N-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]-5-chloro-2-hydroxybenzamide

IKK2 Inhibitor V; IMD0354; N-(3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl)-5-chloro-2-hydroxybenzamide; IKK-2 Inhibitor V; IMD0354; N-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]-5-chloro-2-hydroxybenzamide; TCMDC-125465; IMD 0354; IMD-0354

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.52 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (6.52 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: 2% DMSO+5% Tween 80+0.5% CMC Na: 3 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。