IMD 0354   中文名称: IMD 0354

NF-κB (IC50 = 1.2 μM)

体外活性：IMD-0354（浓度 < 5 μM）抑制 HMC-1 细胞中 NF-κB 的表达以及 NF-κB 向细胞核的易位。 IMD-0354 在 HMC-1 细胞中以时间和剂量依赖性方式抑制细胞增殖。 IMD-0354 (0.5 μM) 几乎抑制 IC-2G559 细胞和 IC-2V814 细胞的增殖。 IMD-0354 (0.5 μM) 导致 HMC-1 细胞的细胞周期停滞在 G0/G1 期。 IMD-0354 (1 μM) 增加 HMC-1 细胞中亚二倍体 DNA 含量的细胞数量。 IMD-0354 (<1 μM) 降低 HMC-1 细胞中 S 期和 G2/M 期细胞的比例。 IMD-0354 (1 μM) 在 HMC-1 细胞中以时间依赖性方式下调 Cyclin D3 表达以及 pRb 磷酸化水平。 IMD-0354 (< 10 μM) 对 STAT3 和 STAT6 的信号没有影响，而在 HMC-1 细胞中，高浓度时 STAT1 和 STAT5 的磷酸化受到非常轻微的抑制。 24 小时后，IMD-0354 以剂量依赖性方式抑制 CBhCMC 中 NF-κB 向细胞核的易位。 IMD-0354 在浓度为 10 μg/ml 时可抑制 HepG2 细胞中 98.5% 的 NF-κB 活性。当在血清饥饿 12 小时的 3T3-L1 脂肪细胞中同时给予 TNFα (6 nM) 和胰岛素 (100 nM) 时，IMD-0354 (1 μM) 可改善 TNFα 诱导的培养基中脂联素浓度的降低。当在血清饥饿 12 小时的 3T3-L1 脂肪细胞中同时给予 TNFα (6 nM) 和胰岛素 (100 nM) 时，IMD-0354 (1 μM) 可恢复因 TNFα 治疗而下调的 Akt 磷酸化。 IMD-0354 (1 μM) 抑制培养心肌细胞中由肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 诱导的 IκBα 磷酸化和核因子-κ B (NF-κB) 核转位。 IMD-0354 (1 μM) 显着降低 TNF-α 诱导的培养心肌细胞中白细胞介素 1β 和单核细胞趋化蛋白 1 的产生。激酶测定：IMD0354 抑制 TNF-α 诱导的 NF-κB 转录活性，IC50 为 1.2±0.3 uM。细胞测定：将细胞（浓度为 2×105 个细胞/mL）在含有 10% FCS（对于 HMC-1 和 IC-2 细胞）或 5% FCS（对于 CBhCMC）的无酚红 α-MEM 中孵育，并含有或不含不同浓度的 IMD-0354、STI571 或 PDTC 的抗生素。 IC-2WT 细胞和 CBhCMC 在 100 ng/mL 重组大鼠或重组人 SCF 存在下孵育。将 100 微升细胞悬液加入到 96 孔培养板的每个孔中，并孵育 24、48 和 72 小时。培养结束后 4 小时前，将溶解在 PBS 中的 10 μL 5 mg/mL 3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物 (MTT) 添加到每个孔中。添加 100 μL 10% SDS 的 0.01 N HCl 溶液终止反应。使用ImmunoMini NJ-2300 在577 nm 处测量吸光度。

IMD-0354 (5 mg/kg) 显着降低 OVA 致敏小鼠肺部的 NF-κB，但降低幅度低于 20 mg/kg IMD-0354。 IMD-0354 (20 mg/kg) 可改善 OVA 致敏小鼠的气道高反应性并减少支气管嗜酸性粒细胞和粘液产生细胞的数量。 IMD-0354 (20 mg/kg) 还可减少 OVA 致敏小鼠支气管肺泡灌洗液中的细胞和嗜酸性粒细胞总数。 IMD-0354 (20 mg/kg) 抑制 OVA 致敏小鼠气道和/或肺部中 Th2 细胞因子的产生，例如白细胞介素 (IL)-5 和 IL-13 以及嗜酸细胞趋化因子 (eotaxin)，但不影响免疫功能的恢复。在相同的实验条件下，Th1细胞因子如IL-12和干扰素-γ。 IMD-0354 (20 mg/kg) 导致 OVA 致敏小鼠血清 IgE 浓度部分降低。 IMD-0354 以剂量依赖性方式显着降低用 HF 饮食治疗和喂养的 KKAy 小鼠的血浆葡萄糖水平，而不受体重影响。 IMD-0354 (10 mg/kg) 导致梗塞面积/危险面积比显着剂量依赖性降低，并保持分数缩短比。

IMD-0354抑制 TNF-α 诱导的 NF-κB 转录活性，IC50 为 1.2±0.3 uM。IMD-0354抑制TNF-α诱导的NF-κB转录活性，IC50为1.2±0.3 uM。
电泳迁移率变动分析[1]
在用指定浓度的IMD-0354或每种信号抑制剂孵育24小时后，根据制造商的说明，使用NE-PER核质提取试剂从107个细胞中制备核提取物。通过在Tris-EDTA（三乙二胺四乙酸）缓冲液中孵育正义和反义寡核苷酸（正义，5′-AGTTGAGGGGGGGACTTTCCCAGGC-3′；反义，5′-GCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3′），在85°C下孵育2分钟，在65°C下孵化15分钟，在37°C下培育15分钟，室温下孵育15分钟，冰上孵育15分，合成了含有NF-κB共有DNA结合序列的生物素标记双链DNA探针。使用LightShift化学发光电泳迁移率变化分析（EMSA）试剂盒，将0.02 pmol生物素标记的DNA探针与5μg核提取物在室温下孵育20分钟。将偶联物与5×加载缓冲液和含有4μg核蛋白的20μL混合物混合，应用于6%DNA-聚丙烯酰胺凝胶电泳（DNA-PAGE）迷你凝胶的每条泳道。在Tris-硼酸-EDTA缓冲液中进行电泳，将分离的蛋白质转移到Hybond-N+膜上。紫外线（UV）交联后，封闭膜，用LightShift稳定的链霉抗生物素-HRP偶联物（Pierce）孵育60分钟。通过在LightShift鲁米诺/增强剂溶液中孵育膜来观察阳性反应。除另有说明外，所有程序均按照制造商的说明进行。对于竞争检测，使用未标记的NF-κB共有寡核苷酸和具有单碱基置换的突变寡核苷酸。对于超移位检测，在每个反应中加入4μg抗p65、抗cRel或抗p50亚基抗体。

---

化学发光转录因子分析[1]
CBhCMC（每种条件106个细胞）在37°C下与或不与不同浓度的IMD-0354一起孵育24小时。离心后，使用NE每核和细胞质提取试剂制备核提取物，如“电泳迁移率变化分析”所述。根据制造商的说明，使用EZ Detect NF-κB p65转录因子试剂盒分析核中NF-κB p65亚基的反应性。使用光度计检测化学发光信号。

---

萤光素酶测定[1]
根据制造商的说明，使用Effectene转染试剂盒将200 ng pNF-κB-TA-Luc质粒引入2×106 HMC-1细胞。48小时后，在含有10%FCS的α-MEM中用不同浓度的IMD-0354处理细胞，并进一步孵育24、48和72小时。用Bright Glo萤光素酶测定系统作为底物测量细胞裂解物上清液中的萤光素酶活性。

---

电泳迁移率变化分析。[3]
在与指定浓度的IMD-0354或每种信号抑制剂孵育24小时后，根据制造商的说明，使用NE-PER核和细胞质提取试剂（Pierce，Rockford，IL）从107个细胞中制备核提取物。通过在Tris-EDTA缓冲液中在85°C下孵育正义和反义寡核苷酸（正义，5′-AGTTGAGGGGGGGACTTTCCCAGGC-3′；反义，5′-GCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3′）2分钟，在65°C下孵化15分钟，在37°C下培育15分钟，室温下孵育15分钟，以及在冰上孵育15分，合成了含有NF-κB共有DNA结合序列的生物素标记的双链DNA探针。使用LightShift化学发光电泳迁移率变化分析试剂盒，将0.02 pmol的生物素标记的DNA探针与5μg的核提取物在室温下孵育20分钟。将偶联物与5×加载缓冲液混合，将20μL含有4μg核蛋白的混合物施加到6%DNA-PAGE迷你凝胶的每条泳道上。电泳在Tris-硼酸-EDTA缓冲液中进行，分离的蛋白质转移到Hybond-N+膜上。UV交联后，封闭膜，与LightShift稳定的链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶偶联物一起孵育60分钟。通过在LightShift鲁米诺/增强剂溶液中孵育膜来观察阳性反应。除另有说明外，所有程序均按照制造商的说明进行。对于竞争检测，使用未标记的NF-κB共有寡核苷酸和具有单碱基置换的突变寡核苷酸。对于超移位检测，在每个反应中加入4μg的抗p65、抗cRel或抗p50亚基抗体。

---

萤光素酶测定。[3]
根据制造商的说明，使用Effectene转染试剂盒将200 ng pNF-κB-TA-Luc质粒引入MDA-MB-231细胞。我们使用β-半乳糖苷酶表达载体（pCMVβ）来控制转染效率。24小时后，洗涤细胞，在含有10%FCS的DMEM中用不同浓度的IMD-0354处理，并进一步孵育24小时。用Bright Glo萤光素酶测定系统 作为底物测量细胞裂解物上清液中的萤光素酶活性。结果被标准化为模拟TA-Luc质粒的萤光素酶活性。

在指定的小时内，将 HMC-1 细胞（2×105 个细胞/mL）与不同浓度的 IMD-0354（0.1、0.5、1、5 和 10 uM）、STI571 或吡咯烷二硫代氨基甲酸酯 (PDTC) 一起孵育，并在每个时间点使用台盼蓝染料排除测试确定活细胞计数。细胞 (2×105 个细胞/mL) 在含有 10% FCS（对于 HMC-1 和 IC-2 细胞）或 5% FCS（对于 CBhCMC）、抗生素（含或不含不同浓度的 IMD）的无酚红 MEM 中孵育-0354（0.1、0.5、1、5 和 10 uM）、STI571 或 PDTC。将重组大鼠或重组人 SCF（100 ng/mL）添加到培养基中，并与 IC-2WT 细胞和 CBhCMC 一起孵育。 96 孔培养板的每个孔接收 100 微升细胞悬液，然后将其放置在其中孵育 24、48 和 72 小时。培养结束后 4 小时前，将 10 μL 溶解在 PBS 中的 5 mg/mL MTT 添加到每个孔中。添加 100 L 10% SDS 的 0.01 N HCl 溶液后，反应即停止。 ImmunoMini NJ-2300[1] 用于测量 577 nm 处的吸光度。

Mice: Female BALB/c nude mice are injected s.c. with MDA-MB-231 cells suspended in PBS (5×106 cells/100 L mouse) when they are 4 to 5 weeks old. Following growth, the tumor is surgically removed, and at the age of 4 weeks, under ether anesthesia, 100 mg of each established tumor is transplanted to the back of additional female nude mice. Each mouse receives an intraperitoneal injection of 5 mg/kg body weight of IMD-0354 (suspended in 100 L/mouse) once daily for 28 days following the implantation. As a control, saline is injected into naked mice. Calculations are made for the estimated tumor weight (mg) and volume (mm3).
Rats: Lewis rats (180–220 g) that are eight weeks old are used. Endotoxin-induced uveitis (EIU) is brought on by injecting 200 μg of diluted Escherichia coli LPS in 200 l of PBS subcutaneously. IMD-0354, diluted in 500 μL of 0.5% CMC, is injected intraperitoneally into the rats at the same time in doses of 30, 10, or 3. 500 μL of CMC alone is intraperitoneally administered to control EIU rats. Control rats are naive rats. Five animals are used in each group for each experiment, which is carried out in triplicate.

[1]. A novel NF-kappaB inhibitor, IMD-0354, suppresses neoplastic proliferation of human mast cells with constitutively activated c-kit receptors. Blood. 2005 Mar 15;105(6):2324-31.

[2]. Study of the inhibitory effects on TNF-α-induced NF-κB activation of IMD0354 analogs. Chem Biol Drug Des. 2017 Dec;90(6):1307-1311.

[3]. A new IkappaB kinase beta inhibitor prevents human breast cancer progression through negative regulation of cell cycle transition. Cancer Res. 2006 Jan 1;66(1):419-26

[4]. Amelioration of endotoxin-induced uveitis treated with an IκB kinase β inhibitor in rats. Mol Vis. 2012;18:2586-97.

N-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]-5-chloro-2-hydroxybenzamide is a member of benzamides.

---

Constitutive phosphorylation of c-kit tyrosine kinase is the major cause of factor-independent proliferation of mast cells. Recently available tyrosine kinase inhibitors have shown marked activity against mast cell lines that carry wild-type c-kit, and some, but not others, carry mutant c-kit. Here we clearly demonstrated that a novel NF-kappaB inhibitor, IMD-0354, restrained factor-independent proliferation of mast cells with c-kit mutations but not of normal mast cells. In HMC-1 cells with the Asp816Val and Val560Gly mutations, we found that NF-kappaB was constitutively activated without exogenous stimulation. When the DNA-binding activity of NF-kappaB was inhibited by treatment with IMD-0354, cell proliferation was completely suppressed. We detected the expression of cyclin D2, D3, and E in HMC-1 cells and observed that cyclin D3 expression was dramatically decreased by treatment with IMD-0354. Abolishing protein kinase C or phosphatidylinositol 3 kinase pathways also inhibited NF-kappaB translocation to the nucleus, indicating the involvement of these signaling cascades in NF-kappaB activation in HMC-1 cells. Our findings indicated that autophosphorylated c-kit receptors induced NF-kappaB activation, resulting in the up-regulation of cyclin D3 expression and cell cycle progression. The observations from the current study suggest a therapeutic potential, in systemic mastocytosis, for compounds that interfere with NF-kappaB signaling.[1]

---

Nuclear factor-κB (NF-κB) is an important nuclear transcription factor which regulates pro-inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-6. Its role as immunoregulatory mediator makes it an attractive target in the development of treatments for inflammatory and autoimmune diseases. In this study, we synthesized derivatives of IMD0354, a known inhibitor for NF-κB, in attempt to understand the effect of benzanilide substitutions on its activity. The inhibition of these analogs on NF-κB activation was analyzed by luciferase assay. The inhibition of IKKβ phosphorylation and pro-inflammatory cytokines was determined by Western blot and real-time PCR. The structure activity relationships showed that the hydroxyl group on IMD0354 is a critical moiety that resulting in the inhibition of NF-κB. Derivatives 1m, 2b, and 2c were shown to inhibit pro-inflammatory cytokine production at low concentration. These newly synthesized compounds may be useful for the treatment of chronic inflammatory disorders or for cancer prevention. [2]

---

Constitutive nuclear factor-kappaB (NF-kappaB) activity plays a crucial role in the development and progression of lymphoma, leukemia, and some epithelial cancers. Given the contribution of NF-kappaB in carcinogenesis, a novel approach that interferes with its activity might have therapeutic potential against cancers that respond poorly to conventional treatments. Here, we have shown that a new IkappaB kinase beta inhibitor, IMD-0354, suppressed the growth of human breast cancer cells, MDA-MB-231, HMC1-8, and MCF-7, by arresting cell cycle and inducing apoptosis. In an electrophoretic mobility shift assay and a reporter assay, IMD-0354 abolished the NF-kappaB activity in MDA-MB-231 cells in a dose-dependent manner. In the cells incubated with IMD-0354, cell cycle arrested at the G0-G1 phase and apoptotic cells were increased. The expression of some cell cycle regulatory molecules and antiapoptotic molecules was suppressed in cells treated with IMD-0354. On the other hand, cyclin-dependent kinase suppressor p27Kip1 was up-regulated by the addition of IMD-0354. Daily administration of IMD-0354 inhibited tumor expansion in immunodeficient mice into which MDA-MB-231 cells were transplanted. These results indicate that NF-kappaB may contribute to cell proliferation through up-regulation of cell cycle progression; accordingly, inhibition of NF-kappaB activity might have a therapeutic ability in the treatment of human breast cancers.[3]

C15H8CLF6NO2

383.67

383.015

C, 46.96; H, 2.10; Cl, 9.24; F, 29.71; N, 3.65; O, 8.34

978-62-1

5081913

White to off-white solid powder

1.561g/cm3

323.1ºC at 760 mmHg

149.2ºC

1.543

5.408

49.33

2

8

2

25

462

0

O=C(C1C(O)=CC=C(Cl)C=1)NC1C=C(C(F)(F)F)C=C(C(F)(F)F)C=1

CHILCFMQWMQVAL-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H8ClF6NO2/c16-9-1-2-12(24)11(6-9)13(25)23-10-4-7(14(17,18)19)3-8(5-10)15(20,21)22/h1-6,24H,(H,23,25)

N-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]-5-chloro-2-hydroxybenzamide

IKK2 Inhibitor V; IMD0354; N-(3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl)-5-chloro-2-hydroxybenzamide; IKK-2 Inhibitor V; IMD0354; N-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]-5-chloro-2-hydroxybenzamide; TCMDC-125465; IMD 0354; IMD-0354

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.52 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (6.52 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: 2% DMSO+5% Tween 80+0.5% CMC Na: 3 mg/mL

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。