Eganelisib (IPI-549)   中文名称: 依加利塞

PI3Kγ (IC50 = 16 nM); PI3Kα (IC50 = 3.2 μM); PI3Kβ (IC50 = 3.5 μM)
Eganelisib (IPI-549) targets PI3K-γ (p110γ). Biochemical binding affinity (Kd) = 290 pM; biochemical IC50 (at 3 mM ATP) = 16 nM; cellular IC50 (pAKT inhibition in RAW264.7 cells) = 1.2 nM. Selectivity vs other Class I PI3K isoforms: PI3K-α Kd = 178 nM (>600-fold), PI3K-β Kd = 20 nM (≈70-fold), PI3K-δ Kd = 92 nM (>300-fold). No significant inhibition of 468 protein/lipid kinases (including Class II PI3Ks) at 1 μM [1,2].

Eganelisib (IPI549) 以 16 nM 的 IC50 值抑制 PI3Kγ，对其他脂质和蛋白激酶的选择性超过 100 倍（PI3Kα IC50=3.2 μM，PI3Kβ IC50=3.5 μM，PI3Kδ IC50>8.4 μM）。Eganelisib 对所有 I 类 PI3K 亚型的活性均进行了评估。采用平衡荧光滴定法测定了 PI3K-α、β 和 δ 的各反应速率常数，以确定 Eganelisib 与 PI3K-γ 的结合亲和力。 Eganelisib 与 PI3Kγ 具有极强的结合力，其解离常数 (Kd) 为 290 pM，而对其他 I 类 PI3K 亚型（PI3Kα Kd=17 nM，PI3Kβ Kd=82 nM，PI3Kδ Kd=23 M）的亲和力则弱 58 倍以上。在 PI3K-α、-β、-γ 和 -δ 依赖性细胞磷酸化 AKT 检测中，Eganelisib 对 PI3K-γ 表现出优异的抑制活性（IC50=1.2 nM），并且对其他 I 类 PI3K 亚型具有极高的选择性（>146 倍）。通过ELISA检测pAKT S473的抑制情况，分别在SKOV-3、786-O、RAW 264.7和RAJI细胞中测定了I类PI3Kα（250 nM）、PI3Kβ（240 nM）、PI3Kγ（1.2 nM）和PI3Kδ（180 nM）的细胞IC50值。此外，Eganelisib呈剂量依赖性地抑制PI3Kγ依赖的骨髓来源巨噬细胞（BMDM）迁移。 Eganelisib 在 10 μM 浓度下对 80 种 GPCR、离子通道和转运蛋白具有选择性[1]

---

Eganelisib (IPI-549) 在生化试验中抑制 PI3K-γ，IC50 = 16 nM，Kd = 290 pM，并且对其他 I 类 PI3K 亚型的选择性超过 100 倍[1]。
在 RAW264.7 细胞中，它抑制佛波酯诱导的 pAKT (S473)，IC50 = 1.2 nM[1]。
在骨髓来源巨噬细胞 (BMDM) 向 CXCL12 (100 μg/mL) 迁移的试验中，Eganelisib (IPI-549) 呈剂量依赖性地减少了迁移细胞的数量（图 1）[1]。
在体外， Eganelisib (IPI-549) (1 μM) 可抑制骨髓来源巨噬细胞中 IL-4 诱导的 ARG1 表达（扩展数据图 2a）[2]。在人全血中，Eganelisib (IPI-549) 可抑制单核细胞中 CXCL12 刺激的 pAKT (S473)，其 IC50 值在低纳摩尔范围内（扩展数据图 4a）[2]。在人 MDSC 抑制试验中，Eganelisib (IPI-549) 可逆转自体 MDSC 对 CD8+ T 细胞增殖的抑制作用（扩展数据图 4b）[2]。

Eganelisib (IPI549) 具有优异的药代动力学特性，并能有效抑制 PI3K 介导的中性粒细胞迁移。Eganelisib 口服生物利用度高，清除率低，在体内（小鼠、大鼠、犬和猴）组织中的平均分布容积为 1.2 L/kg。总体而言，Eganelisib 具有良好的药代动力学特征，能够有效且精准地抑制体内 PI3K 信号通路。IPI-549 在小鼠、大鼠、犬和猴体内的半衰期 (t1/2) 分别为 3.2 小时、4.4 小时、6.7 小时和 4.3 小时。在该模型中，所有测试剂量的口服eganelisib均能以剂量依赖的方式显著降低中性粒细胞的迁移[1]。\n

---

\n基于小鼠体内的药代动力学特性和体外药理学特征，化合物26非常适合用于研究强效且选择性PI3K-γ抑制剂在体内的作用。先前研究表明，IL-8刺激的中性粒细胞向小鼠气囊的迁移依赖于PI3K-γ。因此，为了验证化合物26在体内的PI3K-γ依赖性活性，我们评估了口服化合物26对IL-8刺激的中性粒细胞流入小鼠气囊的影响[7,8]。在该模型中，所有测试剂量的口服化合物26均能以剂量依赖的方式显著降低中性粒细胞的迁移（图2a）。在这些小鼠中观察到的抑制程度与化合物 26 的血浆浓度直接相关（图 2b），这清楚地表明口服化合物 26 可以抑制体内 PI3K-γ 的功能。此外，化合物 26（Eganelisib (IPI-549)）已被证明可通过改变肿瘤微环境中的免疫细胞来抑制小鼠同源模型中的肿瘤生长。[1]为了验证这一假设，我们使用了选择性 PI3K-γ 抑制剂 Eganelisib (IPI-549)，并在多种肿瘤模型中进行了研究[19]（扩展数据图 2a）。单独使用 Eganelisib (IPI-549) 治疗即可抑制 4T1、B16-GMCSF、MC38、CT26 和 LLC 肿瘤模型中的肿瘤生长（图 2a 和扩展数据图 2b）。在肿瘤抑制性巨噬细胞（TAMC）水平较低的肿瘤（B16-F10，图2a）中未观察到活性，提示PI3K-γ抑制剂主要影响髓系细胞，而对肿瘤细胞或其他肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）无直接作用。我们还观察到IPI-549治疗后肺转移显著减少（图2b）。TIL定量分析显示，在IPI-549或载体处理的4T1或B16-GMCSF肿瘤中，总髓系细胞（CD11b+）或巨噬细胞（CD11b+/F480+）的数量均无显著差异（图2c）。IPI-549对TAMC亚群的影响与p110γ-/-小鼠中观察到的结果相似^17,18。 PI3K-γ抑制剂可将巨噬细胞的活化状态从免疫抑制性的M2样（CD11b+F4/80+CD206+）表型转变为更具炎症性的M1样（CD11b+F4/80+MHCII+）状态（图2c，扩展数据图2c）。我们进一步检测了IPI-549处理后4T1和B16-GM-CSF肿瘤中M1和M2标志物的RNA表达。结果显示，IPI-549处理的肿瘤中，典型的M2标志物（TGF-β、Arg-1、IDO）表达降低，而M1标志物（IL-12、INOS）表达升高（图2d）。鉴于 CD11b+F4/80+ 巨噬细胞仅构成抑制性 TAMC 的一部分，我们将髓系细胞进一步细分为粒细胞 (CD11b+Ly6G+)、单核细胞 (Ly6Chigh/MHCIIlow = Mono-Lo)、未成熟巨噬细胞 (LyC6high/MHCIIhigh = Mono-Hi)、M1 型巨噬细胞 (Ly6Clow/MHCIIhigh = TAM-M1) 或 M2 型巨噬细胞 (Ly6Clow/MHCIIlow = TAM-M2)20,21。当我们使用上述设门策略分析 4T1 TIL 中的髓系细胞时，我们也观察到 Eganelisib (IPI-549) 使髓系细胞向 TAM-M1 群体转移（扩展数据图 3a）。此外，M1和M2标志物的相对mRNA表达水平与这些细胞的抑制功能减弱相关（扩展数据图3b）。随后，我们检测了经IPI-549处理的B16-GM-CSF荷瘤小鼠来源的髓系细胞对初始CD8 T细胞增殖的抑制功能（图2e）。结果表明，在经IPI-549处理的小鼠中或在培养基中添加IPI-549后，CD8+ T细胞的抑制作用消失。在人外周血单核细胞（PBMC）中的髓系抑制细胞中也观察到了类似的功能（扩展数据图4b），证实了其潜在的临床应用价值。此外，全血药效学评估证实，在人志愿者中，经PI3K-γ刺激激活后，单核细胞中的PI3K-γ活性受到抑制（扩展数据图4a）。为了证实抑制髓系细胞中的 PI3K-γ 是延缓肿瘤进展所必需的，我们在将 LLC-Brei 肿瘤植入小鼠体内之前，先用抗 CD11b 抗体清除了髓系细胞。在缺乏 TAMC 的情况下，IPI-549 治疗并未延缓肿瘤生长（扩展数据图 2e）。综上所述，这些结果表明，使用 IPI-549 抑制 PI3K-γ 主要在富含抑制性髓系细胞的肿瘤微环境中有效，并且能够更精确地筛选出可能从中获得最大疗效的患者群体。\n[2]我们在 4T1 和 B16-GMCSF 模型中测试了抗 PD-1 和抗 CTLA-4 与 Eganelisib (IPI-549) 的联合用药（图 4a）。单独使用双重免疫检查点阻断疗法并未使4T1荷瘤小鼠的肿瘤完全消退，仅有20%的B16-GMCSF荷瘤小鼠从该疗法中获益，进一步证实了这些模型中存在多重免疫检查点耐药。值得注意的是，在抗CTLA-4+抗PD-1联合疗法中加入Eganelisib (IPI-549)后，4T1荷瘤小鼠的完全缓解率为30%，B16-GMCSF荷瘤小鼠的完全缓解率为80%。重要的是，无瘤存活小鼠对肿瘤再植入具有抵抗力（扩展数据图9），表明存在持久的适应性免疫[2]。\n口服Eganelisib (IPI-549)（0.3-30 mg/kg）可剂量依赖性地抑制IL-8诱导的中性粒细胞向小鼠气囊的迁移（ED50未报告）。抑制作用与血浆化合物浓度相关（图 2）[1]。
在多种对免疫检查点阻断疗法耐药的同源肿瘤模型（4T1、B16-GMCSF、MC38、CT26、LLC）中，口服Eganelisib (IPI-549)（15 mg/kg/天）显著抑制肿瘤生长并减少肺转移（B16-GMCSF）[2]。
肿瘤生长抑制与肿瘤相关髓系细胞的表型转变相关：M2 标志物（CD206、Arg-1、TGF-β、IDO）减少，M1 标志物（MHCII、iNOS、IL-12）增加（图 2c、d；扩展数据图 2c、d）[2]。
在 4T1 和 B16-GMCSF 肿瘤中，Eganelisib （IPI-549）可增加 CD8+ T 细胞浸润、颗粒酶 B 表达和 CD8/Treg 比率，同时上调 CD8+ T 细胞上的 PD-1 和 CTLA-4（图 3a；扩展数据图 5a）[2]。
当与抗 CTLA-4 或抗 PD-1 抗体联合使用时，Eganelisib (IPI-549) 可显著延缓肿瘤生长，并在 30% (4T1) 和 80% (B16-GMCSF) 的小鼠中诱导肿瘤完全消退；无肿瘤存活小鼠对再次攻击具有抵抗力（图 4；扩展数据图 9）[2]。

生化分析材料：[1]
I 类 PI3K 亚型 α、β 和 δ 与 p85α 调节亚基一起提供，γ 亚型单独提供。所用亚型的目录号（cat #）如下：PI3K-α：p110α/p85α cat #14-602-K，PI3K-β：p110β/p85α cat #14-603-K，PI3K-γ：p120γ cat #14-558-K，PI3K-δ：p110δ/p85α cat #14-604。II 类 PI3K 亚型以 N 端 6xHis 标签蛋白的形式提供； PI3K-C2α 氨基酸 299 端：货号 14-906-K，PI3K-C2β 全长：货号 14-907-K，PI3K-C2γ：货号 14-910-K。ATP 二钠盐配制成 30 mM 的水溶液储备液，并用氢氧化钠 (NaOH) 调节 pH 至约 7.0。浓度通过紫外 (UV) 吸光度法测定，波长为 260 nm，消光系数为 15.4 × 10³ M⁻¹ cm⁻¹。二辛酰磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸 (diC8PIP2) 配制成 5 mM 的水溶液储备液，并储存于 -20°C。二辛酰磷脂酰肌醇 (diC8PIP) 配制成 5 mM 的水溶液，并储存于 -20°C。

---

3 mM ATP 条件下 I 类和 II 类 PI3K 生化测定的一般步骤：[1]
使用 Promega ADP-Glo Max 检测试剂盒测定人 PI3 激酶 I 类 α、β、δ 和 γ 以及 II 类 α、β 和 γ 亚型的 IC50 值。将激酶样品（20 nM PI3K-α、PI3K-δ、PI3K-C2α、PI3K-C2β 和 PI3K-C2γ 或 40 nM PI3K-β 和 PI3K-γ）与化合物在室温下于反应缓冲液（15 mM HEPES pH 7.4、20 mM NaCl、1 mM EGTA、0.02% Tween 20、10 mM MgCl2、0.2 mg/mL 牛γ球蛋白）中孵育 15 分钟，然后加入 ATP/diC8-PP2 混合物，使最终浓度为 3 mM ATP 和 500 µM diC8PIP2 底物（对于 I 类 PI3K）或 500 µM diC8PIP 底物（对于 II 类 PI3K）。反应在室温下孵育 2 小时后，加入 25 µL Promega 试剂盒终止液。室温孵育 40 分钟后，加入 50 µL Promega 检测混合液，并在室温下孵育 1 小时。然后使用 Envision 酶标仪在发光模式下读取反应板。数据转换为抑制率（%），然后绘制抑制率（%）与化合物浓度的关系图，并拟合四参数逻辑方程以确定 IC50 值。

---

生化和细胞分析 [2]
I 类和 II 类 PI3K 亚型的生化和细胞分析按先前描述的方法进行。

---

PI3K 生化活性采用荧光法测定（详见参考文献 3、4；文中未提供详细实验方案）。通过平衡荧光滴定法测定 I 类 PI3K 亚型的结合亲和力 (Kd) [1]。
对于 PI3K-γ 细胞活性，用佛波酯刺激 RAW264.7 细胞，并通过 ELISA 定量 pAKT S473 [1]。
对于人全血 PI3K-γ PD 检测，用不同剂量的 Eganelisib (IPI-549) 预处理全血，用 CXCL12 (2.3 μg/mL) 刺激 2 分钟，并通过流式细胞术测量 CD14+ 单核细胞中的 pAKT [2]。

将SKOV-3细胞以200,000个细胞/200 μL/孔的密度接种于含10% FBS的RPMI-1640培养基中，置于96孔细胞培养板中。细胞在5% CO2和37℃条件下培养过夜。加入待测物质，使DMSO终浓度达到0.5%，然后在37℃和5% CO2条件下孵育30分钟。吸出培养基后，向每个孔中加入50 μL冰冷的裂解缓冲液。冰上孵育5分钟后，将培养板在4℃下以3000 rpm离心5分钟。

---

\n\nT细胞抑制实验[2]
\n从未感染小鼠中分离脾脏，并通过40 μm滤膜研磨，制备单细胞悬液。红细胞裂解后，根据制造商的方案，使用抗CD8（Ly-2）微珠纯化CD8+细胞，并在预热至37°C的PBS中加入1 mM CFSE，孵育10分钟进行标记。将CFSE标记的CD8+ T细胞接种于预先包被1 μg/ml抗CD3（克隆1454-2C11）和5 μg/ml抗CD28（克隆37N）抗体的96孔圆底板中（每孔25 × 10³个细胞），培养基为添加0.05 M β-巯基乙醇的完全RPMI培养基。按指定比例加入纯化的髓系细胞，并在37°C下孵育。48小时后，收集细胞，并通过流式细胞术检测设门CD8+ T细胞中的CFSE信号。在人源髓源性抑制细胞（MDSC）抑制实验中，使用Lymphoprep™从供体血液中分离外周血单核细胞（PBMC）。通过CD3+细胞分选分离T细胞，并将其冻存于Sigma冻存液中以备后用。将剩余的去除T细胞的PBMC与20 ng/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和20 ng/ml白细胞介素-6（IL-6）共同培养6天以诱导髓系细胞分化，并分别加入或不加入Eganelisib（IPI-549）进行培养。6天后，通过CD33+细胞分选分离MDSC细胞。然后将这些MDSC细胞与自体T细胞（比例为1:4）混合，自体T细胞预先用细胞示踪紫染色，并用抗CD3和抗CD28磁珠（Dynal）激活。 T细胞增殖通过流式细胞术测定Cell Trace Violet染料稀释度来确定，测定时间为72小时。\n

---

\n\nIFN-γ ELISPOT检测[2]
\n在接受载体和Eganelisib (IPI-549) (15mg/kg)治疗10天后，采集荷瘤CT26小鼠的血液。使用Lymphoprep密度梯度培养基分离PBMC。根据制造商的说明，使用CTL小鼠免疫斑点IFN-γ单色ELISPOT试剂盒定量IFN-γ产生细胞。对于体外再刺激，将1×10⁵个PBMC与1×10⁵个经2000 rad照射的CT26结肠癌靶细胞在CTL测试培养基(CTL)中共培养16小时。使用经 2000 rad 照射的 4T1 乳腺癌靶细胞作为阴性对照靶细胞来评估特异性。使用 CTL Immunospot S6 微量分析仪和 Immunospot Professional 软件 (CTL) 对 IFN-γ 斑点进行定量。\n

---

\n\n巨噬细胞极化分析 [2]
\n从 C57Bl/6 小鼠的股骨和胫骨中制备骨髓来源的巨噬细胞。裂解红细胞后，将剩余细胞接种于由 DMEM、20% FBS、青霉素/链霉素和 50 ng/ml M-CSF 组成的骨髓巨噬细胞培养基 (BMM) 中，并培养 6 天。在添加 20 ng/ml IL4 和 50 ng/ml M-MCSF（添加或不添加 Eganelisib (IPI-549)）的情况下，将细胞极化为 M2 表型。细胞培养 48 小时后，提取 RNA。使用小鼠 ARG1 和小鼠 β-肌动蛋白的引物进行 qRT-PCR。\n\n

---

\n\n\nPI3K-γ 特异性全血 PD 检测 [2]
\n取自 6 名健康供体的全血，预先用不同剂量的 Eganelisib (IPI-549) 进行滴定处理，然后用 2.3 μg/ml CXCL12 刺激 2 分钟。裂解细胞，固定并染色。人血样本已获得知情同意书 (ICF) 的批准。通过流式细胞术检测单核细胞 (CD14+) 中 AKT S473 的磷酸化水平，并与未处理的对照组进行比较，从而确定刺激反应。计算每位供体对 Eganelisib (IPI-549) 的 IC50 值，以评估化合物对 PI3K-γ 和全血的效力。

---

RAW264.7 细胞 pAKT 检测：将细胞用化合物处理 2 小时，然后用佛波酯刺激；使用 ELISA 试剂盒 [1] 分析裂解液中的 pAKT S473。
BMDM 迁移实验：将骨髓来源的巨噬细胞与化合物预孵育，然后使其在 5 μm Boyden 小室中向 100 μg/mL CXCL12 迁移 3 小时；迁移细胞计数[1]。
T细胞抑制实验（小鼠）：将幼稚CD8+ T细胞用CFSE标记，并与纯化的肿瘤浸润CD11b+髓系细胞（不同比例）在抗CD3/CD28包被的培养板上共培养48小时；通过流式细胞术检测CFSE稀释度来评估增殖情况[2]。
人MDSC抑制实验：去除PBMC中的CD3+ T细胞；用GM-CSF（20 ng/mL）和IL-6（20 ng/mL）诱导剩余细胞分化6天，并加入或不加入Eganelisib（IPI-549）。然后分离CD33+ MDSC，并与用抗CD3/CD28磁珠激活的自体细胞示踪紫标记的CD3+ T细胞（1:4比例）共培养72小时；增殖通过染料稀释法测定[2]。
流式细胞术检测肿瘤浸润细胞：用Liberase/DNase消化肿瘤组织，过滤后，用针对CD45、CD11b、Ly6G、Ly6C、F4/80、MHCII、CD206、CD8、CD4、FoxP3、Ki67、颗粒酶B、PD-1、CTLA-4等的抗体对细胞进行染色。数据在LSRII上采集，并使用FlowJo软件进行分析[2]。

本研究使用的小鼠为6至8周龄的C57BL/6J和Balb/c小鼠。实验第一天，将肿瘤细胞皮内注射（id）于小鼠右侧腹部。从肿瘤植入后第7天开始，每天灌胃给予15 mg/kg的eganelisib，持续至第21天。对照组小鼠接受运输（5% NMP，95% PEG）。每隔2至3天，用尺子测量肿瘤的体积（长、宽、高）。当肿瘤总体积达到2500 mm³或动物出现痛苦迹象时，终止实验。随后将肿瘤分离并保存在冰上直至需要使用[2]。

---

RNA测序[2]
携带CT26肿瘤的小鼠接受载体或Eganelisib (IPI-549)（15 mg/kg/天，口服）治疗6天或9天。分离肿瘤并冷冻保存直至需要使用；然后将肿瘤解冻并从所有细胞中提取RNA。RNA测序在Expression Analysis (Q2 Solutions)进行。使用OmicSoft ArrayStudio和UCSC基因模型将序列读段比对到小鼠B38参考基因组。计算每个基因的Log2(FPKM)值，并将数据进行均值中心化处理以在热图中显示。该分析重点关注约4200个与癌症免疫学和PI3K通路信号传导相关的鼠基因，这些基因来自包括BioCarta通路、GO基因本体、KEGG通路、WikiPathways和文献在内的多个来源。⁵小鼠[2]
C57BL/6J和Balb/c小鼠（6-8周龄）购自Jackson Laboratory。Pmel-1 TCR转基因小鼠此前已有报道。每个治疗组使用10-15只小鼠，以达到90%的统计功效和5%的显著性水平，并检测出肿瘤无进展生存率在10%至80%之间的差异。通常情况下，所有对照组动物均出现肿瘤生长。每组额外取5只小鼠，分别于治疗第7天和第14天进行组织采集。小鼠笼内及治疗方案在肿瘤植入后第7天随机分配。

---

肿瘤攻毒及治疗实验[2]
实验第0天，将肿瘤细胞皮内注射（id）于小鼠右侧腹部。对于B16模型，将2.5×10⁵个B16-WT或B16-GMCSF细胞注射到C57BL/6J小鼠体内。对于4T1模型和CT26模型，将5×10⁵个细胞皮下注射到Balb/c小鼠体内。免疫缺陷小鼠研究中，CT26模型采用Balb/c nu/nu品系小鼠，B16-GMCSF模型采用C57BL/6 rag1−/−小鼠。小鼠购自Jackson Labs和Charles River Labs。治疗方案包括单药治疗和联合治疗，具体方案如下。 PI3K-γ抑制剂药物Eganelisib (IPI-549)溶解于5% 1-甲基-2-吡咯烷酮的聚乙二醇400溶液中，每日一次以15 mg/kg的剂量灌胃给药。治疗从肿瘤植入后第7天开始，至第21天结束。对照组接受载体（5% NMP，95% PEG）给药，不含活性药物。抗CTLA-4抗体（100 μg/只，克隆9H10，Bio X cell）和抗PD-1抗体（250 μg/只，克隆RPM1-14，Bio X cell）分别于第7、10、13和16天腹腔注射给B16、B16-GMCSF和4T1模型小鼠，以及于第10、13和16天腹腔注射给CT26模型小鼠。每隔两三天用游标卡尺测量肿瘤大小，并计算体积（长×宽×高）。连续测量日均未发现可见或可触及肿瘤的小鼠被认为肿瘤完全消退。若动物出现痛苦迹象或肿瘤总体积达到2500 mm³，则对其进行安乐死。在再次攻击研究中：将抗PD-1治疗组和抗PD-1联合Eganelisib (IPI-549)治疗组中获得完全缓解的小鼠，在首次肿瘤植入后第106天（研究期间）再次接种2.5 × 10⁵个CT26.WT肿瘤细胞。将来自另一组接受 Eganelisib (IPI-549) 和抗 PD-1 治疗且获得完全缓解的小鼠，植入 1×10⁵ 个 4T1 肿瘤细胞。

---

小鼠气囊模型：C57BL/6 小鼠于第 0 天和第 4 天皮下注射无菌空气。第 5 天，在气囊内注射 IL-8 (0.5 μg) 前 1 小时，口服 Eganelisib (IPI-549) (0.3-30 mg/kg) 或载体。 4小时后，对囊袋进行灌洗并计数中性粒细胞[1]。
同源肿瘤模型：将2.5×10⁵个B16-WT或B16-GMCSF细胞（皮内注射）、5×10⁵个4T1或CT26细胞（皮下注射）或LLC-Brei细胞植入C57BL/6或BALB/c小鼠体内。Eganelisib (IPI-549)配制于5% NMP/95% PEG400中，每日口服一次，剂量为15 mg/kg，从第7天（CT26细胞为第10天）开始，最多持续14天。在第 7、10、13 和 16 天（或 CT26 小鼠的第 10、13 和 16 天）腹腔注射抗 CTLA-4 抗体（100 μg/只小鼠，克隆 9H10）和抗 PD-1 抗体（250 μg/只小鼠，克隆 RPM1-14）。使用游标卡尺测量肿瘤体积。完全消退定义为无可触及的肿瘤[2]。
CD8+ T 细胞清除：在肿瘤植入前 3 天开始，每 3 天腹腔注射一次抗 CD8 抗体（克隆 169.4）[2]。
CD11b+ 细胞清除：将 LLC 肿瘤匀浆通过 CD11b 磁珠柱以清除 CD11b+ 细胞，然后再进行肿瘤移植[2]。

化合物 26/Eganelisib (IPI-549) 的体外吸收、分布、代谢和排泄 (ADME) 特性及药代动力学参数也进行了测定（汇总于表 5）。体外实验表明，26/Eganelisib (IPI-549) 在 Caco-2 细胞单层中具有中等至高的细胞渗透性，在培养的肝细胞中代谢缓慢（t1/2 > 360 min），且对所有测试的 CYP 同工酶（1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6 和 3A4）的 IC50 值均大于 20 μM。体内实验（小鼠、大鼠、犬和猴）表明，化合物 26 具有优异的口服生物利用度、低清除率和平均组织分布容积为 1.2 L/kg（表 5）。总之，化合物 26 具有良好的药代动力学特性，能够有效且选择性地抑制体内 PI3K-γ。[1]

---

体外 ADME：Caco-2 细胞渗透性 (A→B) = 13×10⁻⁶ cm/s (10 μM)。血浆蛋白结合率（游离分数）：小鼠 2.2%，大鼠 2.8%，犬 2.8%，猴 4.0%，人 1.1% (1 μM)。在培养的人肝细胞中的代谢稳定性：t₁/₂ >360 分钟。 CYP3A4 抑制 IC50 >20 μM（CYP 同工酶 1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、3A4 也 >20 μM）[1]。
体内药代动力学（口服剂量）：小鼠（5 mg/kg）：Cmax 3.6 μM，AUC₀‑∞ 2058 ng·h/mL，t₁/₂ 3.2 h，CL 3.6 mL/min/kg，Vss 0.8 L/kg，F% 88；大鼠（5 mg/kg）：Cmax 2.0 μM，AUC 880，t₁/₂ 4.4，CL 4.4，Vss 1.2，F% 57；犬（2.5 mg/kg）：Cmax 1.9 μM，AUC 491，t₁/₂ 6.7，CL 2.8，Vss 1.3，F% 65；猴（2.5 mg/kg）：Cmax 0.56 μM，AUC 664，t₁/₂ 4.3，CL 4.3，Vss 1.3，F% 31。制剂：口服制剂为 0.5% 羧甲基纤维素/0.05% Tween 80；静脉制剂为 5% NMP/40% PEG400/55% PBS [1]。

Eganelisib (IPI-549) 在 Ames 诱变性试验中呈阴性，且 hERG 结合 IC50 >10 μM（这些论文中未报告进一步的毒性数据）[1]。

[1]. Discovery of a Selective Phosphoinositide-3-Kinase (PI3K)-γ Inhibitor (IPI-549) as an Immuno-Oncology Clinical Candidate. ACS Med Chem Lett. 2016 Jul 22;7(9):862-7.

[2]. Overcoming resistance to checkpoint blockade therapy by targeting PI3Kγ in myeloid cells. Nature. 2016 Nov 17;539(7629):443-447.

IPI-549目前正在临床试验NCT03795610中进行研究（一项针对局部晚期HPV阳性和HPV阴性头颈部鳞状细胞癌患者的IPI-549窗口期研究）。Eganelisib是一种高生物利用度、选择性的小分子磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K-γ）γ亚型抑制剂，具有潜在的免疫调节和抗肿瘤活性。给药后，eganelisib抑制PI3K-γ介导的信号通路激活，可能导致表达PI3K-γ的肿瘤细胞增殖减少。此外，该药物还能调节抗肿瘤免疫反应并抑制肿瘤介导的免疫抑制。与其他PI3K亚型不同，γ亚型在某些肿瘤细胞类型和免疫细胞中过度表达；其表达促进肿瘤细胞增殖和存活。通过选择性靶向γ亚型，正常非肿瘤细胞中的PI3K信号通路受到的影响极小或不受影响，从而减少了副作用。

---

异喹啉酮类PI3K抑制剂的优化已产生了一种强效的PI3K-γ抑制剂（26或IPI-549），其对其他脂质和蛋白激酶的选择性超过100倍。IPI-549具有良好的药代动力学特性，可有效抑制体内PI3K-γ介导的中性粒细胞迁移，目前正在进行针对晚期实体瘤患者的I期临床试验。[1]

---

近期免疫疗法的临床试验表明，其具有通过解除免疫系统抑制来控制癌症的潜力。针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4或程序性细胞死亡蛋白1/程序性死亡配体1的免疫检查点阻断（ICB）抗体已在多种癌症中显示出持久的临床疗效。尽管这些新型免疫疗法对癌症治疗产生了显著影响，但肿瘤中仍然存在多种免疫耐药机制。其中，髓系细胞在限制有效肿瘤免疫方面发挥着重要作用。越来越多的证据表明，免疫抑制性髓系细胞的高浸润与预后不良和免疫检查点阻断（ICB）耐药相关。这些观察结果提示，需要采用精准医疗方法，根据肿瘤免疫微环境调整免疫治疗方案，以克服此类耐药机制。本研究利用临床前小鼠模型系统证实，浸润性髓系细胞的抑制活性可直接介导多种肿瘤对ICB的耐药性。此外，选择性靶向在髓系细胞中高表达的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Kγ）γ亚型，可以恢复肿瘤对ICB的敏感性。我们证实，使用选择性抑制剂靶向PI3Kγ（目前正在进行I期临床试验(NCT02637531)）可以重塑肿瘤免疫微环境，并在不直接靶向癌细胞的情况下促进细胞毒性T细胞介导的肿瘤消退。我们的发现为使用选择性小分子PI3Kγ抑制剂（例如IPI-549）的新型联合治疗策略提供了契机，以克服肿瘤中存在高水平抑制性髓系细胞浸润的患者对免疫检查点阻断疗法(ICB)的耐药性。[2]

---

Eganelisib (IPI-549)（化合物26）是一种首创的口服生物利用度高的选择性PI3K-γ抑制剂。该化合物是通过优化异喹啉酮骨架上的8位炔基取代基而发现的，最终得到N-甲基吡唑类似物26。它并不直接抑制肿瘤细胞增殖，而是作用于肿瘤相关的髓系细胞，使其从免疫抑制性的M2样表型重新极化为炎症性的M1样状态。这可以解除对CD8+ T细胞的抑制，并增强有效的抗肿瘤免疫，尤其是在与免疫检查点阻断剂联合使用时。IPI-549目前正在进行I期临床试验（NCT02637531），作为单药疗法以及与抗PD-1抗体（纳武利尤单抗）联合用于治疗晚期实体瘤患者[1,2]。

C30H24N8O2

528.58

528.202

C, 68.17; H, 4.58; N, 21.20; O, 6.05

1693758-51-8

91933883

Yellow solid powder

3.2

123Ų

2

6

6

40

1060

1

O=C1C2C(C#CC3C=NN(C)C=3)=CC=CC=2C=C(C(C)NC(C2C(N)=NN3C=CC=NC3=2)=O)N1C1C=CC=CC=1

XUMALORDVCFWKV-IBGZPJMESA-N

InChI=1S/C30H24N8O2/c1-19(34-29(39)26-27(31)35-37-15-7-14-32-28(26)37)24-16-22-9-6-8-21(13-12-20-17-33-36(2)18-20)25(22)30(40)38(24)23-10-4-3-5-11-23/h3-11,14-19H,1-2H3,(H2,31,35)(H,34,39)/t19-/m0/s1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。