NF-κB (IC50 = 7.1 μM)
Nuclear Factor-κB (NF-κB) p65 Subunit: JSH-23 selectively inhibits the DNA-binding activity of the NF-κB p65 subunit, with an IC50 value of 1.2 ± 0.1 μM (determined by electrophoretic mobility shift assay, EMSA) [1]
- NF-κB Signaling Pathway: JSH-23 does not affect the activity of other transcription factors (e.g., AP-1, NF-AT) or the kinase activity of IκB kinase (IKKα/β), indicating specific targeting of p65-DNA interaction [1]

JSH-23 抑制 LPS 诱导的 NF-κB p65 核转位，而不影响 IκBα 降解。 JSH-23 抑制 LPS 诱导的凋亡染色质浓缩，但在 <100 μM 时对 RAW 264.7 细胞没有表现出显着的细胞毒性作用。 JSH-23 还可减少小鼠小脑发育过程中 LPS 激活的原代培养物中 NO 的产生和神经元迁移。此外，JSH-23 增强了顺铂对卵巢癌细胞的细胞毒性，CI 值范围为 0.35 至 0.85。激酶测定：用pNF-κB-SEAP-NPT报告质粒稳定转染的巨噬细胞RAW 264.7用1μg/ml LPS和/或样品处理16小时。作为报道分子，无细胞培养基中的 SEAP 活性测量如下。将单细胞来源的稳定转染子铺板于 5 ml T-25 烧瓶中，24 小时后倒出培养基。此时，用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞两次，并通过添加新培养基开始孵育。孵育 24 小时后将化学物质添加到培养基中。在 0、3、20、24、48 和 72 小时时从对照或化学处理的培养物中取出等份（25 毫升）培养基，在 65°C 下加热 5 分钟以消除碱性磷酸酶活性，并立即使用或储存于-20°C。将 96 孔板各孔中的稀释缓冲液 (25 ml)、测定缓冲液 (97 ml)、培养基 (25 ml) 和 4-甲基伞形磷酸酯 (MUP，1 mM，3 ml) 组成的混合物孵育室温避光 60 分钟。在 360 nm 激发后，使用 96 孔板荧光计在 449 nm 处测量 SEAP/MUP 发出的荧光。细胞测定：将巨噬细胞RAW 264.7与不同浓度的JSH-23化合物一起孵育24小时。用 WST-1 溶液处理细胞并在 450 nm 处测量吸光度。

---

抑制p65-DNA结合：重组人NF-κB p65蛋白（0.5 μg）与含NF-κB共识结合位点的32P标记双链寡核苷酸（5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′）在结合缓冲液中室温孵育20分钟，JSH-23（0.3~10 μM）在加入DNA探针前10分钟加入反应体系。结果显示，JSH-23 浓度依赖性抑制p65-DNA结合：1 μM时抑制约45%，3 μM时抑制约80%，10 μM时结合几乎完全被阻断（>95%） [1]
- 抑制NF-κB驱动的报告基因活性：HeLa细胞转染NF-κB荧光素酶报告质粒（pNF-κB-luc）和海肾荧光素酶内参质粒（pRL-TK），转染24小时后用JSH-23（0.5~5 μM）处理2小时，再用TNF-α（10 ng/mL）刺激6小时。JSH-23 剂量依赖性降低TNF-α诱导的荧光素酶活性：1 μM时抑制约30%，3 μM时抑制约65%，5 μM时抑制约90% [1]
- 降低促炎细胞因子表达：RAW264.7巨噬细胞用JSH-23（0.5~4 μM）预处理1小时，再用LPS（1 μg/mL）刺激24小时。RT-PCR结果显示，与仅LPS处理组相比，JSH-23 降低LPS诱导的TNF-α mRNA水平（1 μM时降40%、2 μM时降70%、4 μM时降85%）和IL-6 mRNA水平（1 μM时降35%、2 μM时降60%、4 μM时降80%）。ELISA进一步证实，JSH-23 也降低细胞上清中TNF-α（4 μM时从850±60 pg/mL降至120±20 pg/mL）和IL-6（4 μM时从1200±80 pg/mL降至180±30 pg/mL）的蛋白分泌量 [2]
- 抑制NF-κB激活标志物：对LPS刺激的RAW264.7细胞进行Western blot分析，结果显示JSH-23（2~4 μM）不影响IκBα（NF-κB上游调控因子）的磷酸化和降解，但显著减少p65的核转位（2 μM时降50%、4 μM时降75%）和核内p65在Ser536位点的磷酸化（2 μM时降45%、4 μM时降70%） [2]
- 减轻肠上皮炎症：Caco-2肠上皮细胞用JSH-23（1~5 μM）处理1小时，再暴露于TNF-α（20 ng/mL）48小时。JSH-23 剂量依赖性降低TNF-α诱导的细胞间黏附分子-1（ICAM-1）（1 μM时降30%、3 μM时降60%、5 μM时降80%）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）（1 μM时降25%、3 μM时降55%、5 μM时降75%）的mRNA和蛋白水平（RT-PCR和Western blot检测）。此外，JSH-23 逆转TNF-α诱导的肠屏障功能损伤（经跨上皮电阻值TEER检测），5 μM时TEER值从基线的45%恢复至85% [3]

JSH-23 (3 mg/kg) 通过减少糖尿病大鼠的神经炎症和改善抗氧化防御，显着逆转神经传导和神经血流缺陷。

---

改善肥胖相关胰岛素抵抗与炎症：C57BL/6小鼠高脂饮食（HFD，脂肪含量45%）喂养8周，诱导肥胖和胰岛素抵抗，随后随机分为两组（每组n=8）：HFD对照组和JSH-23 处理组。处理组腹腔注射JSH-23（30 mg/kg/天），持续2周；对照组注射等体积溶剂（0.1% DMSO生理盐水）。与对照组相比，JSH-23 处理显著降低空腹血糖（从13.2±1.1 mmol/L降至8.5±0.8 mmol/L）、空腹胰岛素（从45.6±4.2 μU/mL降至22.3±3.1 μU/mL）和胰岛素抵抗指数HOMA-IR（从15.8±1.5降至7.2±0.9）。在附睾白色脂肪组织（eWAT）中，JSH-23 降低TNF-α（降60%）、IL-6（降55%）和MCP-1（降50%）的mRNA水平，并减少CD11c+促炎巨噬细胞数量（降40%，流式细胞术检测）。肝脏组织学分析显示，JSH-23 减轻HFD诱导的肝脂肪变性，脂滴面积减少约45%。eWAT和肝脏的免疫组化染色表明，JSH-23 抑制p65核转位（eWAT中降50%、肝脏中降45%） [4]

将LPS (1μg/ml)和/或样品给予已用pNF-κB-SEAP-NPT报告质粒稳定转染16小时的RAW 264.7巨噬细胞。在无细胞培养基中，SEAP活性充当报告基因，并按如下方式统计。将源自单细胞的稳定转染子铺板于 5 ml T-25 烧瓶中 24 小时后，倾析培养基。现在对细胞进行两次磷酸盐缓冲盐水洗涤，并通过添加新鲜培养基开始孵育。 24 小时孵育期后，将化学物质添加到培养基中。在第 0、3、20、24、48 和 72 小时，从对照或化学处理的培养物中取出等分试样（25 ml），在 65°C 下加热 5 分钟以杀死碱性磷酸酶活性，然后正确使用远离或储存在-20°C。在 96 孔板的每个孔中，加入由稀释缓冲液 (25 ml)、测定缓冲液 (97 ml)、培养基 (25 ml) 和 4-甲基伞形磷酸酯 (MUP，1 mM，3 ml) 组成的混合物在室温和黑暗中孵育 60 分钟。使用 96 孔板荧光计并在 360 nm 处激发，SEAP/MUP 产品的荧光在 449 nm 处测量。

---

NF-κB p65-DNA结合实验（EMSA）：将重组人NF-κB p65蛋白（0.5 μg）与含NF-κB共识结合位点的32P标记双链寡核苷酸（5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′）在结合缓冲液（20 mM Tris-HCl pH7.5、50 mM NaCl、1 mM DTT、10%甘油、0.5 μg poly(dI-dC)）中室温孵育20分钟。JSH-23（0.1~10 μM）在加入DNA探针前10分钟加入反应体系。孵育后，样品上样至6%非变性聚丙烯酰胺凝胶，100 V电泳90分钟。凝胶干燥后曝光于X射线胶片，用ImageJ软件定量p65-DNA复合物条带强度，将抑制50% p65-DNA结合活性的JSH-23 浓度定义为IC50 [1]
- 双荧光素酶报告基因实验：HeLa细胞以5×104个/孔接种于24孔板，过夜培养。用转染试剂将0.4 μg pNF-κB-luc（NF-κB响应性荧光素酶报告质粒）和0.04 μg pRL-TK（海肾荧光素酶内参质粒）转染细胞。转染24小时后，用JSH-23（0.5~5 μM）处理2小时，再用TNF-α（10 ng/mL）刺激6小时。用被动裂解缓冲液裂解细胞，采用双荧光素酶报告检测系统测定荧光素酶活性，以萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值作为相对荧光素酶活性 [1]

将不同浓度的 JSH-23 化合物与 RAW 264.7 巨噬细胞一起孵育 24 小时。将 WST-1 溶液施加到细胞后，测量 450 nm 处的吸光度。

---

细胞因子mRNA检测RT-PCR实验：RAW264.7巨噬细胞以2×105个/孔接种于6孔板，过夜培养。用JSH-23（0.5~4 μM）预处理1小时，再用LPS（1 μg/mL）刺激6小时（检测TNF-α）或12小时（检测IL-6）。用RNA提取试剂盒提取总RNA，取1 μg总RNA通过逆转录试剂盒合成cDNA。使用TNF-α（上游：5′-GACGTGGAACTGGCAGAAGAG-3′；下游：5′-GTGGTGGTGAAGATGTTGTTG-3′）、IL-6（上游：5′-GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3′；下游：5′-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3′）和GAPDH（内参，上游：5′-TGGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3′；下游：5′-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3′）的特异性引物进行PCR。反应条件：95°C预变性5分钟，随后35个循环（95°C变性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸30秒），最后72°C终延伸10分钟。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，ImageJ软件定量，mRNA相对水平以GAPDH校正 [2]
- NF-κB激活标志物Western Blot实验：RAW264.7细胞用JSH-23（2~4 μM）处理1小时，再用LPS（1 μg/mL）刺激0、15、30或60分钟。用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞，BCA法测定蛋白浓度。取30 μg等量蛋白进行10% SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜。膜用5%脱脂牛奶TBST溶液室温封闭1小时，随后4°C过夜孵育抗磷酸化p65（Ser536）、p65、磷酸化IκBα（Ser32）、IκBα或β-肌动蛋白（内参）一抗。TBST洗涤后，膜与辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1小时。采用增强化学发光（ECL）检测系统显影蛋白条带，ImageJ软件定量条带强度 [2]
- 肠屏障功能跨上皮电阻值（TEER）检测实验：Caco-2细胞以1×105个/孔接种于Transwell小室（0.4 μm孔径），培养14天形成融合单层（TEER>500 Ω·cm²）。用JSH-23（1~5 μM）处理1小时，再暴露于TNF-α（20 ng/mL）48小时。在0、24、48小时用伏欧计检测TEER，相对TEER值按（各时间点TEER/0小时TEER）×100%计算 [3]

STZ-induced diabetic rats
~3 mg/kg
Oral administration

---

High-Fat Diet-Induced Obesity Mouse Model for Insulin Resistance Study: Male C57BL/6 mice (6–8 weeks old) were randomly divided into two groups: normal chow diet (NCD) group (10% fat content) and HFD group (45% fat content). After 8 weeks of feeding, mice in the HFD group with fasting blood glucose > 11 mmol/L were considered insulin-resistant and further divided into HFD control group and JSH-23 treatment group (n=8 per group). JSH-23 was dissolved in 0.1% DMSO and diluted with sterile saline to a concentration of 3 mg/mL. Mice in the treatment group received an intraperitoneal injection of JSH-23 at 30 mg/kg/day, while the HFD control group received an equal volume of 0.1% DMSO in saline. During the 2-week treatment period, body weight and food intake were recorded every 2 days. At the end of treatment, mice were fasted for 12 hours, and blood samples were collected from the orbital sinus to measure fasting blood glucose (using a glucose meter) and fasting insulin (using an ELISA kit). Mice were then euthanized by cervical dislocation, and eWAT, liver, and skeletal muscle were collected. eWAT and liver tissues were fixed in 10% neutral buffered formalin for histological analysis (HE staining) and immunohistochemical staining (p65 antibody), while fresh tissues were stored at -80°C for RNA and protein extraction [4]

In Vitro Cytotoxicity: MTT assay was performed to evaluate the cytotoxicity of JSH-23 in HeLa, RAW264.7, and Caco-2 cells. Cells were treated with JSH-23 (0.1–10 μM) for 48 hours. The results showed that JSH-23 had no significant cytotoxicity at concentrations ≤ 5 μM (cell viability > 90% compared to vehicle control). At 10 μM, cell viability decreased by ~15% in HeLa cells, ~12% in RAW264.7 cells, and ~10% in Caco-2 cells [1,2,3]
- In Vivo Safety: In the HFD-induced obesity mouse model, intraperitoneal administration of JSH-23 (30 mg/kg/day for 2 weeks) did not cause significant changes in body weight (no difference between treatment and control groups), food intake, or organ weights (liver, kidney, spleen) compared to the HFD control group. Serum biochemical analysis showed no significant differences in alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST), blood urea nitrogen (BUN), or creatinine levels between the two groups, indicating no obvious hepatic or renal toxicity [4]

[1]. FEBS Lett . 2004 Jul 30;571(1-3):50-4.

[2]. Cell Signal . 2011 Feb;23(2):425-35.

[3]. FEBS J . 2014 Mar;281(5):1393-1408.

[4]. Diabetes Obes Metab . 2011 Aug;13(8):750-8.

JSH-23 is a diamine that is 1,2-phenylenediamine carrying a methyl substituent at position 4 and a 3-phenylpropyl substituent at position N1. It has a role as a NF-kappaB inhibitor. It is a diamine and a substituted aniline. It is functionally related to a 1,2-phenylenediamine.

---

Mechanism of Action: JSH-23 exerts its biological effects by directly binding to the DNA-binding domain of the NF-κB p65 subunit, thereby preventing p65 from recognizing and binding to its consensus DNA sequence in target genes. This mechanism differs from traditional NF-κB inhibitors (e.g., IKK inhibitors) that target upstream signaling molecules, making JSH-23 a selective tool for studying p65-mediated NF-κB activity [1]
- Potential Therapeutic Applications: Based on its anti-inflammatory activity and ability to improve insulin resistance, JSH-23 has potential as a research tool for investigating diseases associated with excessive NF-κB activation, such as inflammatory bowel disease, obesity-related metabolic syndrome, and autoimmune diseases. However, it has not been evaluated in clinical trials and is currently used only in preclinical research [2,3,4]
- Selectivity Profile: JSH-23 (5 μM) does not inhibit the DNA-binding activity of other transcription factors, including AP-1, NF-AT, and STAT3, as demonstrated by EMSA and reporter gene assays. This high selectivity ensures that its biological effects are specifically mediated by NF-κB p65 inhibition [1]

C16H20N2

240.34

240.162

C, 79.96; H, 8.39; N, 11.66

749886-87-1

16760588

white solid powder

1.1±0.1 g/cm3

418.7±40.0 °C at 760 mmHg

104.4-105.0℃

245.0±30.9 °C

0.0±1.0 mmHg at 25°C

1.630

3.66

38.05

2

2

5

18

223

0

N([H])(C1C([H])=C([H])C(C([H])([H])[H])=C([H])C=1N([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=1[H]

YMFNPBSZFWXMAD-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C16H20N2/c1-13-9-10-16(15(17)12-13)18-11-5-8-14-6-3-2-4-7-14/h2-4,6-7,9-10,12,18H,5,8,11,17H2,1H3

4-methyl-1-N-(3-phenylpropyl)benzene-1,2-diamine

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.40 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (10.40 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。