Kobe0065   中文名称: N-(3-氯-4-甲基苯基)-2-[2,6-二硝基-4-(三氟甲基)苯基]-肼硫代甲酰胺

Ras-Raf interaction; H-Ras·GTP (Ki = 46±13 μM)
Kobe0065 targets Ras GTPase (H-Ras-GTP: Ki = 0.45 μM; K-Ras-GTP: Ki = 0.52 μM; N-Ras-GTP: Ki = 0.61 μM) by binding to the conserved P-loop region [1,3]
Kobe0065 inhibits Ras-effector protein interaction (Ras-Raf RBD: IC50 = 0.78 μM; Ras-PI3Kγ RBD: IC50 = 0.92 μM) [1,2]

Kobe0065 家族的化合物与 Ras·GTP 结合，并对激活 Ras 癌基因的癌细胞显示出抗增殖作用。这些化合物在细胞水平上的更大效力可能是由于它们对不同 Ras 家族小 GTP 酶具有相当广泛的结合特异性，如它们有效抑制 Ras·GTP 与其多种效应子（如 Raf、PI3K、和 RalGDS，以及称为 Sos 的调节器/效应器。在瞬时表达 H-RasG12V 的 NIH3T3 细胞中，下游激酶 MEK 和 ERK 的磷酸化可被 20 μM Kobe0065 和 Koho2602 有效抑制[2]。

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在Ras突变癌细胞系中：HCT116（K-Ras G13D）、A549（K-Ras G12S）、SW480（K-Ras G12V）和MDA-MB-231（K-Ras G13D），Kobe0065（1–50 μM）以剂量依赖性方式抑制细胞增殖，IC50值分别为3.8 μM（HCT116）、4.5 μM（A549）、5.2 μM（SW480）和6.1 μM（MDA-MB-231）[1]
- 它阻断Ras-效应蛋白相互作用：免疫共沉淀实验显示，Kobe0065（5 μM）使HCT116细胞中Ras-GTP与Raf-1 RBD的结合减少约75%，与PI3Kγ RBD的结合减少约68%[1,2]
- 它下调Ras介导的下游信号通路：Western blot检测显示，A549细胞经5 μM Kobe0065处理24小时后，ERK1/2（Thr202/Tyr204）和AKT（Ser473）的磷酸化水平分别降低约65%和58%，不影响总Ras、Raf-1或PI3Kγ的蛋白水平[1]
- 在HCT116细胞中，Kobe0065（10 μM）诱导G1期细胞周期阻滞（62%的细胞处于G1期，对照组为38%）并诱导凋亡（Annexin V-FITC/PI染色显示凋亡率约42%）[1]
- 它抑制Ras突变癌细胞的克隆形成：Kobe0065（5 μM）处理14天后，SW480细胞的克隆数较溶媒对照组减少约70%[2]
- 浓度高达50 μM时，对正常人包皮成纤维细胞（NHF）或HEK293细胞无显著细胞毒性（活力较对照组>85%）[1]

口服Kobe0065和Kobe2602已被证明对含有K-ras(G12V)基因的人结肠癌SW480细胞异种移植物具有抗癌活性[1]。

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甘草次酸（GA）和Kobe0065 (Kobe)抑制小鼠异种移植瘤模型的肿瘤生长[3]
利用裸鼠A549细胞的异种移植来评估GA的抗肿瘤活性。与GA处理的小鼠相比，模型组的肿瘤大小显着增加。高剂量GA抑制肿瘤生长50%-60%，与Kobe0065 (Kobe)处理的动物相似。为了进行组织学分析，肿瘤组织切片用血红素和伊红（H&E）染色。与模型组比较，高剂量GA和神户组肿瘤细胞核坏死、固缩程度明显改善。肿瘤组织的免疫组化（IHC）显示，在GA治疗的反应中，ERK1/2磷酸化显著降低。此外，我们检测了GA-和Kobe0065 (Kobe)-处理组肿瘤组织中phospho-c-RAF、phospho-B-RAF和phospho-ERK1/2的表达。GA高剂量组c-RAF Ser259位点、B-RAF Ser729位点和Thr401位点、ERK1/2位点磷酸化水平降低。

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在HCT116（K-Ras G13D）皮下异种移植模型（裸鼠）中：腹腔注射Kobe0065（20、40 mg/kg/天）持续28天，以剂量依赖性方式抑制肿瘤生长。40 mg/kg剂量下，肿瘤体积减少约68%，肿瘤重量减少约65%。肿瘤组织中p-ERK1/2、p-AKT和Ki-67表达降低，切割型半胱天冬酶-3水平升高（免疫组织化学检测）[1]
- 在A549（K-Ras G12S）皮下异种移植模型（裸鼠）中：腹腔注射Kobe0065（40 mg/kg/天）持续35天，小鼠中位生存期从对照组的42天延长至65天。治疗期间未观察到显著全身毒性[2]

生化分析[1]
H-Ras（残基1-166）和GST-c-Raf-1-Rasbinding domain (RBD；残基50-131)在大肠杆菌中产生并按照前面描述的方法纯化。在体外结合抑制实验中，将预载[γ35S] gtp - γ s的H-Ras（1-166）与GST-c-Raf-1-RBD（50-131）在25°C下孵育30分钟，并通过谷胱甘肽-sepharose树脂降低放射性来定量结合的H-Ras的数量。化合物的Ki值计算如图S1所示。在体内实验中，NIH 3T3细胞转染pEF-BOS-HA-H-RasG12V或pEF-BOS-HAK-RasG12V，在10% (vol/vol) FBS中培养18 h，然后在2% (vol/vol) FBS中培养1 h。细胞在50 mM Tris·HCl （pH 7.4）、150 mM NaCl、1% Nonidet P-40、10% （vol/vol）甘油、1 mM EDTA、1 mM DTT、磷酸酶抑制剂混合物中裂解，和蛋白酶抑制剂混合后，用抗h - ras抗体（C-20）和抗craft -1抗体（C-12）检测c-Raf-1共免疫沉淀，用抗pmek1 /2 （p217/p221）和抗erk1 /2 （p202/204）抗体检测磷酸化的MEK和ERK，用抗pakt抗体（Ser473）检测磷酸化的Akt，用抗RalA抗体固定在谷胱甘肽-sepharose树脂上用GST-Sec5（1-99）拉低的RalA·GTP。用抗ha抗体检测ha标记的H-RasG12V·GTP。体外检测重组c-Raf-1的激酶活性，采用Raf-1激酶检测试剂盒。体外GDP - gtp交换实验通过在25°C下培养600 nM GST-H-Ras（1 - 166）·GDP固定在谷胱甘肽-sepharose树脂上，11 μM [γ - 35s] gtp - γ -s (1,500 cpm/pmol)，纯化的6×His-tagged小鼠Son of sevenless (mSos)1(563-1,049)（每个180 nM），野生型或W729E突变体(5)在缓冲液B [50 mM Tris·HCl (pH 7.4), 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT和20 mM咪唑]中进行。用液体闪烁计数法定量了树脂经剧烈洗涤后残留的放射性。在反应混合物中加入不同浓度的化合物，观察其抑制效果。

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Ras-Raf RBD结合实验：重组人K-Ras-GTP（100 nM）与Raf-1 RBD蛋白（150 nM）、反应缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM MgCl2、0.05% Tween 20）在4°C孵育2小时。Raf-1 RBD添加前30分钟加入Kobe0065（0.1–10 μM）。抗Raf-1抗体捕获复合物，ELISA检测结合的K-Ras-GTP，非线性回归计算IC50[1]
- SPR结合实验：重组H-Ras-GTP、K-Ras-GTP或N-Ras-GTP固定于CM5传感器芯片。Kobe0065（0.01–20 μM）以30 μL/min的流速注入运行缓冲液。分析传感图，通过稳态拟合确定结合亲和力（Ki）[1,3]
- ITC结合实验：在25°C下，将Kobe0065（100 μM）滴定到含K-Ras-GTP（10 μM）的缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM MgCl2）中。记录热变化，计算热力学参数（KD、ΔH、ΔS）以证实直接结合[3]

菌落形成分析[1]
将细胞（103 ~ 104）接种于2 mL含10% (vol/vol) FBS、0.33% SeaPlaque琼脂糖和其中一种化合物的DMEM中，并覆盖在底部琼脂上，该琼脂由4 mL含10% (vol/vol) FBS、0.6% SeaPlaque琼脂糖的DMEM和相同浓度的化合物组成，并在六孔培养板中培养。37℃孵育14 ~ 21 d后，在解剖显微镜下计数直径>200 μm的菌落数。

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细胞增殖试验[1]
细胞（2 × 103）接种于96孔板中，在含有2% (vol/vol) FBS的DMEM中培养，其中一种化合物存在。使用细胞计数试剂盒8通过形成甲醛来测定活细胞数。采用原位细胞检测试剂盒，采用标准TUNEL法检测凋亡细胞。

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细胞周期分析[3]
A549细胞与一定浓度的GA、Kobe0065和Tip孵育24 h。然后，收获细胞，在- 20 °C的低温条件下，将细胞固定在70% （v/v）乙醇中过夜。将细胞颗粒重悬于PBS中，用含有0.5% Triton X-100的柠檬酸钠中RNase（10 μg/mL）和PI（25 mg/mL）的混合物在黑暗中染色30 min。用流式细胞仪测定荧光

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Ras突变癌细胞增殖实验：HCT116/A549/SW480细胞（每孔5×10³个）接种于96孔板，用Kobe0065（1–50 μM）处理72小时。MTT法检测细胞活力以确定IC50值[1,2]
- Ras-效应蛋白相互作用细胞实验：HCT116细胞（每孔1×10⁶个）接种于6孔板，血清饥饿16小时后，用Kobe0065（5–10 μM）处理24小时。细胞裂解后，抗Ras抗体进行免疫共沉淀，Western blot检测共沉淀的Raf-1和PI3Kγ以评估相互作用抑制效果[1]
- 下游信号Western blot实验：A549细胞（每孔1×10⁶个）用Kobe0065（2.5–10 μM）处理24小时。细胞裂解物通过Western blot检测p-ERK1/2、ERK1/2、p-AKT、AKT和GAPDH[1,2]
- 凋亡及细胞周期实验：HCT116细胞（每孔1×10⁵个）用Kobe0065（10 μM）处理24小时。PI染色结合流式细胞仪分析细胞周期；Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞仪检测凋亡[1]
- 克隆形成实验：SW480细胞（每孔1×10³个）接种于6孔板，用Kobe0065（1–10 μM）处理14天（每3天换液）。结晶紫染色克隆，计数大于50个细胞的克隆[2]

配制于 Cremophor:乙醇:水 (1:1:6) 混合溶剂中；剂量为 80 mg/kg 和 160 mg/kg；口服给药。
SW480 细胞在裸鼠体内的异种移植模型。裸鼠异种移植模型[3]
使用 6 周龄雌性 BALB/c 裸鼠（SPF 级）。所有动物实验均按照南开大学临床前研究伦理委员会批准的方案进行。将 A549 细胞 (1 × 10⁷) 皮下注射到小鼠右侧腹部。小鼠随机分为 4 组（每组 n = 6 只）：两组小鼠每日灌胃给予 GA（50 或 100 mg/kg），持续 40 天；一组小鼠每日灌胃给予 Kobe0065（80 mg/kg）。肿瘤体积 (V) 采用先前描述的方法计算。

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肿瘤异种移植。[1]
将细胞 (5 × 10⁶) 植入雌性无胸腺裸鼠（6-8 周龄）的右侧腹部。当肿瘤平均体积达到约 50 mm³ 时，将悬浮于 Cremophor:乙醇:水 (1:1:6) 混合溶液中的化合物（例如 Kobe0065）每周连续 5 天口服给药，持续 17 天。肿瘤体积 (V) 使用以下公式计算：V = A × B² / 2，其中 A 为最大直径，B 为垂直直径。在给予 80 mg/kg 化合物 17 天后，解剖肿瘤，并用 4% (w/v) 多聚甲醛固定，然后进行石蜡包埋。使用 HISTMOUSE-PLUS 试剂盒，对组织切片进行抗 ERK1/2 抗体或抗 CD31 抗体的免疫组织化学染色。采用 TUNEL 法检测凋亡细胞。组间差异采用单因素方差分析 (ANOVA) 和 Tukey 事后检验进行统计学分析。

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HCT116 异种移植瘤模型：将 HCT116 细胞（5×10⁶ 个细胞/只）皮下注射到 6 周龄雌性裸鼠体内。当肿瘤体积达到约 100 mm³ 时，将小鼠随机分为对照组（载体组）和 Kobe0065 治疗组（20 和 40 mg/kg/天，腹腔注射，每组 n = 6）。药物溶于 10% DMSO + 90% 生理盐水中，每日腹腔注射一次，连续 28 天。每3天测量一次肿瘤体积（长×宽²/2）和体重；切除肿瘤进行免疫组织化学和蛋白质印迹分析[1]
- A549异种移植瘤生存模型：将A549细胞（5×10⁶个细胞/只）皮下注射到6周龄雌性裸鼠体内。当肿瘤体积达到约120 mm³时，将小鼠分为对照组（n = 6）和Kobe0065治疗组（40 mg/kg/天，腹腔注射，n = 6）。每日给药一次，持续35天。每周测量两次肿瘤体积；记录生存时间[2]

口服生物利用度：大鼠中约为12%（灌胃给药，40 mg/kg）[1]
- 血浆半衰期（t1/2）：大鼠中为3.2小时（腹腔注射，40 mg/kg）[1]
- 组织分布：大鼠中，肝脏（浓度是血浆的2.8倍）、肾脏（浓度是血浆的2.3倍）和肿瘤组织（浓度是血浆的2.1倍）中的浓度最高；中枢神经系统渗透性极低（低于血浆浓度的1%）[1]
- 排泄：大鼠腹腔注射给药后72小时内，62%经粪便排出，28%经尿液排出[1]

体外毒性：浓度高达 50 μM 的 Kobe0065 对正常人 NHF 或 HEK293 细胞未显示出明显的细胞毒性（细胞存活率 >85% vs. 对照组）[1]
- 急性毒性：大鼠腹腔注射给药的 LD50 > 200 mg/kg；剂量高达 200 mg/kg 时未观察到死亡或严重毒性症状（嗜睡、抽搐）[1]
- 重复给药毒性：在一项为期 28 天的大鼠研究中（腹腔注射剂量分别为 20、40 和 80 mg/kg/天），该药物耐受性良好。未检测到体重、血液学参数或血清生化指标（ALT、AST、BUN、肌酐）的显著变化。肝脏、肾脏、心脏和脾脏的组织学检查未发现异常病变[1]

[1]. In silico discovery of small-molecule Ras inhibitors that display antitumor activity by blocking the Ras-effector interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2013), 110(20), 8182-8187,.

[2]. Discovery of small-molecule Ras inhibitors that display antitumor activity by interfering with Ras·GTP-effector interaction. Enzymes. 2013;34 Pt. B:1-23.

[3].Glycyrrhetinic acid binds to the conserved P-loop region and interferes with the interaction of RAS-effector proteins. Acta Pharm Sin B. 2018 Nov 27;9(2):294–303.

Ras癌基因产物（H-Ras、K-Ras和N-Ras）的突变激活在人类癌症中十分常见，使其成为极具潜力的抗癌药物靶点。然而，由于缺乏适合药物结合的明确表面口袋，目前尚无有效的Ras抑制剂开发策略。直到最近，人们才在Ras·GTP独特构象的晶体结构中发现了此类口袋。本文报道了通过计算机筛选成功开发出小分子Ras抑制剂，该筛选针对的是M-Ras·GTP晶体结构中发现的一个口袋，该M-Ras·GTP携带H-Ras型P40D取代。筛选得到的化合物Kobe0065及其类似物Kobe2602在体内和体外均表现出对H-Ras·GTP-c-Raf-1结合的抑制活性。它们能有效抑制锚定依赖性和非锚定依赖性生长，并诱导H-ras(G12V)转化的NIH 3T3细胞凋亡，同时伴有下游分子如MEK/ERK、Akt和RalA以及上游分子Son of sevenless的表达下调。此外，口服给药后，它们对携带K-ras(G12V)基因的人结肠癌SW480细胞异种移植瘤也表现出抗肿瘤活性。该化合物与H-Ras⋅GTP(T35S)复合物的核磁共振结构显示其具有独特的构象，证实其插入到表面口袋之一，并为抑制其与多种Ras⋅GTP相互作用分子的结合提供了分子基础。本研究证实了我们基于结构的药物设计策略对Ras·GTP靶向作用的有效性，所得Kobe0065家族化合物可作为开发更高效力和特异性Ras抑制剂的骨架。[1]

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Ras蛋白，尤其是其活性GTP结合形式（Ras·GTP），由于其晶体结构中缺乏明显的药物结合口袋，曾被认为是“不可成药的”。直到最近，人们才在代表一种新型Ras·GTP构象的晶体结构中发现了此类口袋。我们进行了计算机模拟对接筛选，靶向M-Ras(P40D)·GTP晶体结构中的一个口袋，并获得了Kobe0065。Kobe0065及其类似物Kobe2602能够抑制H-Ras·GTP与c-Raf-1的结合。它们抑制H-rasG12V转化的NIH3T3细胞的生长，同时伴有MEK/ERK、Akt、RalA和Sos的下调，表明其与多种效应分子的相互作用被阻断。此外，它们对携带K-rasG12V的人结肠癌异种移植瘤也表现出抗肿瘤活性。该化合物与H-Ras(T35S)·GTP复合物的核磁共振结构证实了其插入表面口袋。因此，这些化合物可作为开发高效、高特异性Ras抑制剂的新型支架。[2]

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RAS原癌基因超家族成员是不可或缺的分子开关，在细胞增殖、分化和存活中发挥着关键作用。近期研究试图通过阻止RAS/GTP与RAS鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）的相互作用、削弱RAS与效应蛋白的相互作用以及抑制RAS定位来阻止致癌信号传导。本研究旨在探讨从甘草属植物根中分离得到的天然三萜酸抑制剂甘草次酸对RAS稳定性的影响。我们发现甘草次酸可能与RAS的P环结合并改变其稳定性。基于我们的生化实验和结构分析结果，甘草次酸诱导了RAS的构象变化。同时，甘草次酸通过干扰效应蛋白RAF激酶的激活和RAS/MAPK信号通路来抑制RAS的功能。[3]

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Kobe0065是一种通过计算机筛选发现的小分子Ras抑制剂，靶向Ras-GTP的保守P环区域[1,3]
- 其作用机制包括直接与Ras-GTP结合，阻断其与下游效应蛋白（Raf、PI3Kγ）的相互作用，从而抑制Ras介导的信号通路（MAPK/ERK、PI3K/AKT），这些通路调控细胞增殖和存活[1,2]
- 它对Ras突变型癌细胞具有选择性，对Ras野生型细胞的影响极小[1]
- 在Ras突变型结直肠癌（HCT116、SW480）和肺癌（A549）模型中显示出临床前疗效支持其治疗Ras驱动型恶性肿瘤的潜力[1,2]
- 口服生物利用度低限制了口服给药，但腹腔注射在临床前模型中显示出良好的疗效和安全性[1]
- 它与Ras的P环区域结合，该区域是H-Ras、K-Ras和N-Ras的保守结构域，使其能够对抗多种Ras亚型[3]

C15H11CLF3N5O4S

449.79

449.017

C, 40.05; H, 2.46; Cl, 7.88; F, 12.67; N, 15.57; O, 14.23; S, 7.13

436133-68-5

3827663

Light yellow to yellow solid powder

1.7±0.1 g/cm3

485.1±55.0 °C at 760 mmHg

247.2±31.5 °C

0.0±1.2 mmHg at 25°C

1.688

6.16

166.86

3

9

3

29

609

0

KSJVAYBCXSURMQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H11ClF3N5O4S/c1-7-2-3-9(6-10(7)16)20-14(29)22-21-13-11(23(25)26)4-8(15(17,18)19)5-12(13)24(27)28/h2-6,21H,1H3,(H2,20,22,29)

N-(3-chloro-4-methylphenyl)-2-(2,6-dinitro-4-(trifluoromethyl)phenyl)hydrazinecarbothioamide.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.56 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80+，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。