KU-0063794

mTORC1 (IC50 = 10 nM); mTORC2 (IC50 = 10 nM)
The primary targets of KU-0063794 are the mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) and mammalian target of rapamycin complex 2 (mTORC2). For purified mTOR kinase (in complex with GβL), the IC₅₀ value of KU-0063794 for inhibiting its kinase activity is approximately 10 nM. In HEK293 cells, the IC₅₀ for inhibiting mTORC1-mediated phosphorylation of p70S6K at Thr389 is about 11 nM, and the IC₅₀ for inhibiting mTORC2-mediated phosphorylation of Akt at Ser473 (in serum-starved and then stimulated HEK293 cells) is approximately 16 nM [1]
- KU-0063794 also targets the mTOR signaling pathway by suppressing both mTORC1 and mTORC2 activities in prostate cancer cell lines (e.g., PC-3 and LNCaP). In PC-3 cells, the IC₅₀ for inhibiting cell proliferation (a readout of mTOR pathway inhibition) is about 25 nM, and in LNCaP cells, the IC₅₀ is approximately 32 nM [2]

与 mTOR 抑制剂 PP242 相比，KU-0063794 对 mTOR 表现出更高的特异性，因为对 PI3K 或 76 种其他激酶没有活性。在 HEK-293 细胞中，30 nM 的 KU-0063794 足以通过阻断疏水基序 (Thr389) 的磷酸化以及随后的 T 环残基 (Thr229) 的磷酸化来快速消除 S6K1 活性。在 IGF1 刺激后，需要 300 nM 的 KU-0063794 才能完全抑制血清饥饿的 HEK-293 细胞中的 S6K1 活性。此外，浓度为 100–300 nM 的 KU-0063794 完全抑制氨基酸引起的 S6K1 和 S6 蛋白磷酸化。与 S6K1 类似，KU-0063794 以剂量和时间依赖性方式阻断 mTORC1 Ser2448 和 mTORC2 Ser2481。 KU-0063794 对 Akt Ser473 和意外 Thr308 的活性和磷酸化产生剂量依赖性抑制，以及 Akt 底物 PRAS40 在 Thr246、GSK3/GSK3 在 Ser21/Ser9 和 Foxo-1/3a 在 Thr24 的磷酸化/Thr32 在血清存在下或 IGF1 刺激后。 KU-0063794（而非雷帕霉素）以剂量依赖性方式抑制 SGK1 活性和 Ser422 磷酸化及其生理底物 NDGR1，其程度与 S6K1 和 Akt 磷酸化相同。然而，KU-0063794 不会抑制佛波酯诱导的 ERK 或 RSK 磷酸化或 RSK 激活。与雷帕霉素相比，KU-0063794 导致 4E-BP1 Thr37、Thr46 和 Ser65 完全去磷酸化的效力明显更高。 KU-0063794 比雷帕霉素更显着地抑制具有野生型和 mLST8 缺陷突变的 MEF 中的细胞生长，并导致 G1 细胞周期停滞。 [1]

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激酶活性抑制：KU-0063794可强效抑制纯化mTOR激酶的活性。当与重组mTOR-GβL复合物孵育时，药物以剂量依赖性方式降低mTOR底物（如4E-BP1片段）的磷酸化水平，IC₅₀为10 nM。该药物对mTOR具有高选择性，即使在浓度高达1 μM时，也未显著抑制其他相关激酶（如PI3Kα、Akt1）的活性 [1]
- HEK293细胞中的信号通路调控：用KU-0063794处理HEK293细胞后，mTORC1和mTORC2下游信号通路被剂量依赖性抑制。在50 nM浓度下，药物使p70S6K（Thr389，mTORC1底物）的磷酸化水平较未处理对照组降低80%以上，使Akt（Ser473，mTORC2底物）的磷酸化水平降低约70%。单次处理后，磷酸化抑制效应至少可维持24小时 [1]
- 前列腺癌细胞中的抗增殖活性：在PC-3（雄激素非依赖性）和LNCaP（雄激素依赖性）前列腺癌细胞系中，KU-0063794表现出剂量依赖性抗增殖作用。采用MTT法检测，处理72小时后，其IC₅₀在PC-3细胞中为25 nM，在LNCaP细胞中为32 nM。在100 nM浓度下，药物对PC-3细胞的增殖抑制率达90%，对LNCaP细胞的增殖抑制率达85%（相较于溶剂对照组） [2]
- 前列腺癌细胞中的凋亡诱导：KU-0063794可诱导PC-3细胞凋亡。用100 nM药物处理48小时后，Annexin V-FITC阳性细胞（早期凋亡细胞）比例从对照组的5%升至25%，Annexin V-FITC/PI双阳性细胞（晚期凋亡/坏死细胞）比例从对照组的3%升至12%。Western blot分析显示，药物使凋亡标志物切割型caspase-3的表达水平较对照组上调3倍 [2]
- 细胞周期阻滞：在PC-3细胞中，KU-0063794可导致细胞周期阻滞于G₁期。流式细胞术分析显示，用50 nM药物处理24小时后，G₁期细胞比例从对照组的55%升至72%，而S期细胞比例从对照组的30%降至15% [2]

Ku0063794 在临床前肾细胞癌模型中抑制肿瘤生长和 mTOR 信号传导。然而，在动物研究中，Ku0063794 并不比替西罗莫司更有效。替西罗莫司对肿瘤微环境具有显着影响的事实可能是Ku0063794体内活性缺乏增加的原因。虽然 Ku0063794 对异种移植肿瘤的血管生成没有影响，但替西罗莫司却有影响。与用 Ku0063794 治疗的肿瘤相比，用替西罗莫司治疗的肿瘤表达的 VEGF 和 PDGF 水平较低，从而减少了血管生成[2]。

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PC-3异种移植裸鼠的抗肿瘤活性：对携带皮下PC-3肿瘤的裸鼠进行KU-0063794处理。药物通过腹腔注射给药，剂量为15 mg/kg，每周2次，连续3周。与溶剂对照组相比，处理组肿瘤生长显著受抑：治疗结束时，平均肿瘤体积在处理组为320 mm³，对照组为910 mm³，肿瘤生长抑制率约为65%；药物还使肿瘤重量降低60%（平均肿瘤重量：处理组0.3 g vs 对照组0.75 g）。处理组小鼠未出现显著体重下降（体重变化<10%）或其他明显毒性症状 [2]
- 异种移植肿瘤中mTOR信号的调控：从KU-0063794处理组小鼠收集的肿瘤组织中，mTOR下游靶标的磷酸化水平降低。Western blot分析显示，肿瘤组织中p70S6K（Thr389）和Akt（Ser473）的磷酸化水平分别较对照组降低75%和65%。免疫组化染色也证实，处理组肿瘤中Ki-67（增殖标志物）阳性细胞比例降低（处理组20% vs 对照组60%） [2]

Specificity kinase panel/特异性激酶活性筛选[1]
\n所有检测均在国家蛋白激酶分析中心进行(http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/)如前所述。简而言之，所有检测都是在室温（21°C）下自动进行的，并且在所用条件下与时间和酶浓度呈线性关系。使用96孔形式的Multidrop Micro试剂分配器（Thermo Electron Corporation，Waltham，MA，U.S.A.）进行30分钟的分析。表1的图例中定义了每种激酶的缩写。测定中乙酸镁的浓度为10 mM，CK2α、DYRK3、EF2K、ERK1、ERK8、GSK3β、HIPK2、IGF1R、IRR、MARK3、MKK1、p38γMAPK（丝裂原活化蛋白激酶）、p38δMAPK、PAK4、PIM2、Akt1、PLK1、PKCζ和PRK2在5μm时使用[γ-33P]ATP（约800 c.p.m/pmol）；20μM用于CaMKKβ、CDK2/细胞周期蛋白A、CHK1、CHK2、CK1δ、CSK、EPH-B3、FGF-R1、IR、JNK1α1、JNK2α2、MAPKAP-K2、MSK1、MST2、MST4、p38βMAPK、PKA、PAK5、PAK6、PDK1、PIM1、PIM3、PKCα、ROCKII、PRAK、S6K1、SGK1、SYK、VEGFR和YES1；或AMPK、BRSK2、BTK、CaMK1、DYRK1a、DYRK2、EPH-A2、ERK2、IKKε、LCK、MELK、NEK2A、NEK6、p38α、PhKγ1、Akt2、PKD1、RSK1、RSK2、SRPK1和TBK1为50μM，以达到或低于每种酶的ATP Km

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\nLipid kinase pane/脂质激酶活性筛选[1]
\nSPHK1（鞘氨醇激酶1）的测定如下：在含有50 mM Tris/HCl、pH 7.5、150 mM NaCl、5 mM MgCl2、1 mM EGTA和1 mM DTT（二硫苏糖醇）的50μl终体积中，对SPHK1[稀释于50 mM Tris-HCl中，pH 7.5、150mM NaCl、5 mmol MgCl2、1mM EGTA、10μM鞘氨醇、10μM ATP和1 mM DT中]进行鞘氨醇测定，并在室温下孵育30分钟
\nSPHK2的测定如下：SPHK2（在50 mM Tris/HCl、pH 7.5、200 mM KCl、5 mM MgCl2、1 mM EGTA和1 mM DTT中稀释）在最终体积为50μl的鞘氨醇中进行了测定，其中含有50 mM Tris-HCl、pH 7.5200 mM KCl、5 mM氯化镁、1 mM EGFA、10μM鞘氨醇、1μM ATP和1 mM DT，并在室温下孵育30分钟
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\n\n胆碱激酶的测定如下：胆碱激酶（在25 mM甘氨酸/NaOH、pH 8.5、67 mM KCl和5 mM MgCl2中稀释）在最终体积为50μl的溶液中测定胆碱，该溶液含有25 mM甘氨酸/NaOH、pH8.5、67 mmol KCl、5 mM MgCl2、1 mM胆碱、1μM ATP和1 mM DTT，并在室温下孵育30分钟。通过加入50μl激酶-Glo Plus试剂，在室温下孵育10分钟并读取1秒/孔的读数，停止了这三次测定
\n1类PI3Kα的测定如下：PI3Kα（在50 mM Hepes、pH 7.5、150 mM NaCl、0.02%胆酸钠和1 mM DTT中稀释）针对PtdIns（4,5）P2 diC8进行测定，最终体积为50μl，含有37 mM Hepes，pH 7.5、111 mM NaCl、0.02%胆酸钠、5 mM DTT、5 mM MgCl2、1 mM ATP和2μM PtdIns。通过加入5.5μl 50 mM EDTA和0.02%（w/v）胆酸钠溶液停止测定。将所得混合物的等分试样（25μl）转移到Lumitrac 200平板上。加入检测混合物1[41 mM Hepes，pH 7.5，123 mM NaCl，1.7μg GST-GRP1（鸟嘌呤核苷酸释放蛋白1），0.16μM PtdIns（3,4,5）P3-生物素，1.6μg链霉抗生物素蛋白-别藻蓝蛋白和0.96μg/ml铕螯合标记抗体]，使最终体积为50μl，在室温下孵育20分钟，然后读取
\n1类PI3Kβ的测定如下：PI3Kβ（在50 mM Hepes、pH 7.5、150 mM NaCl、0.02%胆酸钠和1 mM DTT中稀释）在最终体积为50μl的PtdIns（4,5）P2-diC8中进行了测定，其中含有37 mM Hepes，pH 7.5、111 mM NaCl、0.02%胆酸钠、5 mM DTT、5 mM MgCl2、1 mM ATP和2μM PtdNs（4.5）P2，并在室温下孵育70分钟。通过加入5.5μl 50 mM EDTA停止测定，并将25μl测定混合物转移到Lumitrac 200平板上。加入检测混合物1，使最终体积为50μl，在读取之前，将混合物在室温下孵育20分钟
\n第2类PI3KC2β的测定如下：在最终体积为50μl的含有19mM Tris/HCl、pH 7.5、143mM NaCl、0.96mM EDTA、0.96 mM DTT、0.96 mmol DTT、0.48mM EGTA、0.02%CHAPS、20μM磷脂酰肌醇、0.2mM ATP和2mM MgCl2的磷酸肌醇底物中，对PI3KClβ（在20mM Tris/HCl中稀释，pH 7.5、150mM NaCl、1mM DTT、0.5mM EGTA和0.02%CHAPS中）进行测定，并在室温下孵育30分钟。通过加入5.5μl 50 mM EDTA和2%CHAPS停止测定，并将25μl转移到Lumitrac 200平板上。加入检测混合物2（18.6 mM Tris/HCl，pH 7.5，140 mM NaCl，0.9 mM DTT，0.02%CHAPS，1.4μg SGK PX，0.06μM PtdIns3P–生物素，1.6μg链霉抗生物素蛋白–别藻蓝蛋白和0.64μg/ml Eu螯合物标记抗体），使最终体积为50 ml，在室温下孵育30分钟，然后读取
\n3类VPS34的测定如下：VPS34（在20 mM Tris/HCl、pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT、0.5 mM EGTA和0.02%CHAPS中稀释）在最终体积为50μl的磷酸肌醇底物中进行测定，该底物含有19 mM Tris/HCl、pH 7.5，143 mM NaCl、0.96 mM EDTA、0.96 mmol DTT、0.48 mM EGTA、0.02%CHAPS、20μM磷脂酰肌醇、0.2 mM ATP和2 mM MnCl2，并在室温下孵育60分钟。通过加入5.5μl 50 mM EDTA和2%CHAPS停止测定，并将25μl转移到Lumitrac 200平板上。加入检测混合物2，使最终体积为50ml，在室温下孵育30分钟，然后读取

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\nmTOR复合物激酶测定[1]
\nHEK-293细胞在Hepes裂解缓冲液中新鲜裂解。赖氨酸盐（1-4mg）通过与5-20μl与免疫前IgG结合的G蛋白琼脂糖孵育进行预清除。然后将裂解物提取物与5-20μl的G蛋白琼脂糖结合，该G蛋白琼脂糖与5-二十μG的抗Rictor或抗Raptor抗体或免疫前IgG结合。所有抗体均与G蛋白琼脂糖共价结合。在振动平台上于4°C下进行免疫沉淀1小时。用Hepes裂解缓冲液洗涤免疫沉淀物四次，然后用Hepes激酶缓冲液洗涤两次。对于用于磷酸化S6K1的Raptor免疫沉淀物，在最初的两个洗涤步骤中，缓冲液中含有0.5 M NaCl，以确保最佳的激酶活性[7]。GST-Akt1是从用PI-103（1μM）孵育1小时的无血清HEK-293细胞中分离出来的[24]。GST-S6K1从用雷帕霉素（0.1μM，1小时）孵育的无血清HEK-293细胞中纯化[25]。在有或没有Ku-0063794和GST-Akt1（0.5μg）或GST-S6K1（0.5μg）的情况下，通过添加0.1 mM ATP和10 mM MgCl2引发mTOR反应。在30°C的振动平台上进行反应30分钟，并通过加入SDS样品缓冲液停止反应。然后将反应混合物通过0.22-μm孔径的Spin-X过滤器过滤，并对样品进行电泳和免疫印迹分析

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\n激酶测定[1]
\nHEK-293在Tris裂解缓冲液中裂解。为了进行Akt和S6K检测，将500μg裂解物与5μg与g蛋白琼脂糖偶联的相应抗体一起孵育。为了进行SGK1活性测定，将50μg转染的裂解物与5μg谷胱甘肽琼脂糖孵育。所有培养均在振动平台上在4°C下进行1小时。使用Crosstide肽（GRPRTSSFAEG）在30μM下精确测定激酶活性，如前所述[35]。通过将反应混合物施加到P81磷酸纤维素纸上，并在磷酸中洗涤纸张后进行放射性液体闪烁计数，确定[32P]磷酸盐掺入肽底物中的情况。一个活性单位被定义为催化1 nmol[32P]磷酸盐掺入底物的单位。[1]

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\nHEK-293细胞在Hepes裂解缓冲液中新鲜裂解。通过将溶胞产物（1-4mg）与5-20L与免疫前IgG结合的G-糖蛋白孵育，溶胞产物被预先清除。之后，将5-20L的G-Sepharose蛋白与5-20g的抗Rictor或抗Raptor抗体或免疫前IgG偶联，与裂解物提取物一起孵育。G-琼脂糖蛋白与每种抗体共价偶联。免疫沉淀在4°C的振动平台上进行1小时。用Hepes裂解缓冲液洗涤免疫沉淀物四次，然后用Hepes激酶缓冲液洗涤两次。为了确保最佳的激酶活性，用于磷酸化S6K1的Raptor免疫沉淀物的前两个洗涤步骤的缓冲液含有0.5 M NaCl。在PI-103（1μM，1小时）孵育一小时后，从血清饥饿的HEK-293细胞中纯化GST-Akt1。GST-S6K1是从血清和雷帕霉素（0.1μM，1小时）耗尽的HEK-293细胞中分离出来的。为了启动mTOR反应，加入0.1 mM ATP和10 mM MgCl2，同时加入不同浓度的Ku-0063794和GST-Akt1（0.5μg）或GST-S6K1（0.5μg）。在振动平台上于30°C下运行30分钟后，加入SDS样品缓冲液会停止反应。之后，将反应混合物通过孔径为0.22米的Spin-X过滤器过滤，并使用指定的抗体对样品进行电泳和免疫印迹分析。\n

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mTOR激酶活性测定：首先将重组mTOR蛋白与GβL（mTOR结合蛋白）在含Tris-HCl（pH 7.5）、MgCl₂和DTT的反应缓冲液中形成复合物。将不同浓度的KU-0063794（0.1 nM至1 μM）加入mTOR-GβL复合物中，混合物在30°C预孵育15分钟。随后，加入含4E-BP1片段（特异性mTOR底物）和[γ-³²P]ATP的底物混合物启动反应，30°C孵育30分钟后，加入SDS上样缓冲液终止反应。通过SDS-PAGE分离磷酸化的4E-BP1片段，使用磷屏成像仪检测磷酸化底物条带的放射性。相较于溶剂对照组计算激酶活性抑制百分比，通过拟合剂量-反应曲线确定IC₅₀值 [1]
- 激酶选择性测定：使用一组重组激酶（包括PI3Kα、Akt1、ERK1和JNK1）评估KU-0063794对mTOR的选择性。每种激酶在各自优化的反应缓冲液中，与特异性底物、ATP（含用于放射性检测的[γ-³²P]ATP）以及1 μM KU-0063794（或溶剂）共同孵育，反应温度和时间针对每种激酶进行优化。反应终止后，采用与mTOR激酶测定相同的方法检测磷酸化底物，通过比较药物存在与否时各激酶的活性评估选择性 [1]

每 24 小时，将新一批新鲜溶解的 KU-0063794 添加到培养基中，并用其处理细胞 24、48 和 72 小时。将细胞固定在含 4% (v/v) 多聚甲醛的 PBS 中 15 分钟，以测量细胞生长。将细胞用水洗涤一次，用0.1%结晶紫的10%乙醇溶液染色20分钟，然后用水洗涤3次。使用 0.5 mL 10% (v/v) 乙酸 20 分钟从细胞中提取结晶紫。然后，将洗脱液以1:10的比例用水稀释，并测量590 nm处的吸光度。

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细胞活力测定[2]
按照制造商的建议，使用CellTiter Glo®发光细胞活力测定试剂盒在96孔透明底部组织培养板中进行细胞活力测定。Caki-1、786-O或HUVEC细胞以足够低的密度铺板，以确保细胞永远不会达到完全融合。在细胞接种后一天，以指定浓度在三个孔中加入药物（Ku-0063794或坦西罗莫司）或赋形剂（DMSO）。在处理24、48、72和96小时后测量细胞存活率。使用Wallac 1420 VICTOR2™读板器测量发光。细胞活力以每个时间点对应阴性对照的百分比表示。使用Graphpad Prism（6.0版）计算抑制浓度（如IC50、IC30和IC20）。 细胞周期分布的流式细胞术分析[2]
将Caki-1和786-O细胞铺在10cm的细胞培养皿中，以使未经处理的对照在实验结束时达到50%的融合。在细胞接种后一天，将药物（Ku-0063794或坦西罗莫司）或载体（DMSO）以指定浓度加入三个重复孔中。处理72小时后，对每个培养皿中的活细胞进行计数。为了评估细胞周期分布，将细胞重新悬浮在70%乙醇（v/v）中。细胞在黑暗中用含有50µg/ml碘化丙啶和50µg/ml RNase A的PBS染色1小时。用FACS Calibur流式细胞仪和CellQuest软件测量细胞的DNA含量。使用Modfit LT软件确定细胞周期分布。

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MTT细胞增殖测定：将PC-3和LNCaP细胞以每孔2×10³个细胞的密度接种于96孔板，在37°C、5% CO₂条件下培养过夜。次日，向孔中加入不同浓度的KU-0063794（1 nM至1 μM），每个浓度设3个复孔，同时设置溶剂对照组（含与药物组等量的DMSO）。细胞培养72小时后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL，溶于PBS），37°C继续孵育4小时。小心吸弃上清液，每孔加入150 μL DMSO溶解甲瓒结晶，使用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度。细胞存活率按（药物组吸光度/对照组吸光度）×100%计算，通过绘制剂量-反应曲线获得IC₅₀值 [2]
- 信号蛋白Western blot分析：将HEK293、PC-3或LNCaP细胞以每孔5×10⁵个细胞的密度接种于6孔板，培养过夜。随后用不同浓度的KU-0063794（0、10、50、100 nM）处理细胞24小时。处理后，用冰预冷的PBS洗涤细胞2次，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞。细胞裂解液在4°C、12,000 × g条件下离心15分钟，收集上清液（总蛋白）。采用BCA法测定蛋白浓度，每泳道上样30 μg蛋白，经10% SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜。膜用含5%脱脂牛奶的TBST封闭1小时（室温），随后加入一抗（抗磷酸化p70S6K Thr389、抗p70S6K、抗磷酸化Akt Ser473、抗Akt、抗切割型caspase-3或抗GAPDH），4°C孵育过夜。次日，用TBST洗涤膜3次，加入HRP标记的二抗，室温孵育1小时。再次洗涤后，使用ECL化学发光试剂盒显影蛋白条带，用ImageJ软件定量条带强度 [1,2]
- Annexin V-FITC/PI凋亡测定：将PC-3细胞以每孔5×10⁵个细胞接种于6孔板，用100 nM KU-0063794（或溶剂）处理48小时。胰酶消化收集细胞，用冰预冷的PBS洗涤2次，重悬于1×结合缓冲液中，细胞浓度调整为1×10⁶个/mL。向100 μL细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色液，室温避光孵育15分钟后，加入400 μL 1×结合缓冲液。1小时内用流式细胞仪分析凋亡细胞，细胞分为四个象限：活细胞（Annexin V⁻/PI⁻）、早期凋亡细胞（Annexin V⁺/PI⁻）、晚期凋亡/坏死细胞（Annexin V⁺/PI⁺）和坏死细胞（Annexin V⁻/PI⁺） [2]
- 细胞周期分析：用50 nM KU-0063794（或溶剂）处理PC-3细胞24小时。收集细胞，用PBS洗涤后，加入70%冰预冷乙醇，4°C固定过夜。固定后的细胞用PBS洗涤2次，重悬于含RNase A（100 μg/mL）的PBS中，37°C孵育30分钟。随后加入PI染色液（50 μg/mL），室温避光孵育30分钟。用流式细胞仪分析细胞DNA含量，使用ModFit软件计算G₁、S、G₂/M期细胞比例 [2]

Nu/Nu裸鼠
8 mg/kg
腹腔注射

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异种移植模型[2]
六周龄雌性Nu/Nu裸鼠购自Charles River Laboratories。将约5×10⁶个786-O细胞皮下注射至小鼠侧腹部，待肿瘤直径达到5 mm后开始治疗。小鼠随机分为三组，分别腹腔注射DMSO（溶剂对照）、替西罗莫司（0.6 mg/kg）或Ku0063794（8 mg/kg），每日一次（每周五天）。每周至少测量两次肿瘤大小和体重。肿瘤体积采用标准公式（长×宽²）/2计算。治疗46天后处死小鼠并切除肿瘤。将肿瘤组织分割后，一部分置于液氮中速冻，另一部分置于10%中性缓冲福尔马林溶液中固定，并进行石蜡包埋（PE）。速冻后的肿瘤组织用组织匀浆器在去污剂裂解缓冲液中匀浆。取上清液进行蛋白质印迹分析。为制备注射用药物，将替西罗莫司溶解于DMSO中，配制成5 mM的储备液。腹腔注射前，将替西罗莫司稀释至15 µg/100 µl，稀释液为PEG1500（50% (w/v)，溶于75 mM HEPES缓冲液，pH 8.0）。 Ku0063794 溶于一份 DMSO 中，然后用 4 份 PEG1500（50% (w/v)，溶于 75 mM Hepes，pH 8.0）稀释至 200 µg/100 µl[2]。

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PC-3 异种移植裸鼠模型建立及治疗：使用雄性 BALB/c 裸鼠（6-8 周龄，SPF 级）。收集对数生长期的 PC-3 细胞，用 PBS 洗涤，并重悬于浓度为 5×10⁷ 个细胞/mL 的细胞悬液中。将 0.2 mL 细胞悬液（1×10⁷ 个细胞）皮下注射到每只小鼠的右侧腹部，建立异种移植模型。当肿瘤体积达到约 100 mm³ 时，将小鼠随机分为两组（每组 n=6）：溶剂对照组和 KU-0063794 治疗组。
- 药物配制和给药：将 KU-0063794 溶解于 DMSO、聚乙二醇 400 和生理盐水（体积比 1:4:5）的混合溶液中，配制成浓度为 3 mg/mL 的储备液。治疗组小鼠腹腔注射 KU-0063794，剂量为 15 mg/kg，每周两次，持续 3 周。对照组小鼠以相同途径和频率注射等体积的溶剂混合物。
- 数据采集和样本处理：在治疗期间，每周测量每只小鼠的体重两次，并使用游标卡尺测量肿瘤体积（肿瘤体积 = 长 × 宽² / 2）。治疗结束后，所有小鼠均被安乐死，肿瘤被切除、称重并拍照。部分肿瘤组织保存在-80℃用于Western blot分析，剩余部分用4%多聚甲醛固定用于免疫组织化学染色[2]

裸鼠体内毒性：用KU-0063794（15 mg/kg，腹腔注射，每周两次）治疗裸鼠3周，未观察到明显的毒性症状。治疗组小鼠体重保持稳定，最大体重下降小于初始体重的5%（对照组：体重增加3%，治疗组：体重增加1%）。治疗组未发现死亡、异常行为（例如活动减少、食欲不振）或器官损伤（安乐死后通过大体解剖观察到）[2]
- 两篇文献[1,2]中均未报道KU-0063794的体外毒性（例如对正常细胞的细胞毒性）、半数致死剂量（LD₅₀）、肝毒性、肾毒性、药物相互作用或血浆蛋白结合率等数据。

[1]. Biochem J. 2009 Jun 12;421(1):29-42.

[2]. PLoS One. 2013;8(1):e54918.

Ku-0063794 属于吡啶并嘧啶类化合物，是一种 mTOR 抑制剂，具有抗肿瘤特性。它既是 mTOR 抑制剂，也是一种抗肿瘤药物。它属于吗啉类、吡啶并嘧啶类、单甲氧基苯类、叔胺类化合物和苄醇类化合物。

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KU-0063794 是一种小分子抑制剂，可特异性靶向 mTORC1 和 mTORC2，这与雷帕霉素及其类似物（仅抑制 mTORC1）不同。这种双重抑制作用使得KU-0063794能够同时阻断mTORC1介导的细胞增殖和mTORC2介导的Akt激活，从而发挥更强的抗肿瘤作用，尤其是在Akt信号激活的肿瘤中[1,2]
- 在HEK293细胞中，KU-0063794对mTOR信号的抑制是可逆的。从培养基中去除药物后，p70S6K 和 Akt 的磷酸化水平在 48 小时内逐渐恢复至对照水平，表明该药物的作用依赖于其持续存在 [1]
- KU-0063794 在 PC-3 异种移植小鼠中的抗肿瘤活性与肿瘤细胞增殖的抑制（Ki-67 表达降低）和细胞凋亡的诱导（cleaved caspase-3 上调）均相关，提示其在体内具有双重作用机制 [2]

C25H31N5O4

465.5447

465.237

C, 64.50; H, 6.71; N, 15.04; O, 13.75

938440-64-3

938440-64-3

16736978

Light yellow to yellow solid powder

1.2±0.1 g/cm3

694.3±65.0 °C at 760 mmHg

373.7±34.3 °C

0.0±2.3 mmHg at 25°C

1.609

0.27

93.07

1

9

5

34

643

2

C[C@@H]1O[C@H](C)CN(C2N=C3N=C(C4C=CC(OC)=C(CO)C=4)C=CC3=C(N3CCOCC3)N=2)C1

RFSMUFRPPYDYRD-CALCHBBNSA-N

InChI=1S/C25H31N5O4/c1-16-13-30(14-17(2)34-16)25-27-23-20(24(28-25)29-8-10-33-11-9-29)5-6-21(26-23)18-4-7-22(32-3)19(12-18)15-31/h4-7,12,16-17,31H,8-11,13-15H2,1-3H3/t16-,17+

[5-[2-[(2R,6S)-2,6-dimethylmorpholin-4-yl]-4-morpholin-4-ylpyrido[2,3-d]pyrimidin-7-yl]-2-methoxyphenyl]methanol

Ku0063794; Ku 0063794; KU0063794; Ku-0063794; KU-0063794; KU 0063794; KU 63794; 81HJG228AB; CHEMBL1078983; KU-63794; KU63794

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~16 mg/mL (~34.4 mM)
Water: <1 mg/mL
Ethanol: <1 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (3.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 16.7 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (3.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 16.7mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (3.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 16.7 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 30% PEG400+0.5% Tween80+5% propylene glycol: 13mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。