KU-0063794

mTORC1 (IC50 = 10 nM); mTORC2 (IC50 = 10 nM)
The primary targets of KU-0063794 are the mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) and mammalian target of rapamycin complex 2 (mTORC2). For purified mTOR kinase (in complex with GβL), the IC₅₀ value of KU-0063794 for inhibiting its kinase activity is approximately 10 nM. In HEK293 cells, the IC₅₀ for inhibiting mTORC1-mediated phosphorylation of p70S6K at Thr389 is about 11 nM, and the IC₅₀ for inhibiting mTORC2-mediated phosphorylation of Akt at Ser473 (in serum-starved and then stimulated HEK293 cells) is approximately 16 nM [1]
- KU-0063794 also targets the mTOR signaling pathway by suppressing both mTORC1 and mTORC2 activities in prostate cancer cell lines (e.g., PC-3 and LNCaP). In PC-3 cells, the IC₅₀ for inhibiting cell proliferation (a readout of mTOR pathway inhibition) is about 25 nM, and in LNCaP cells, the IC₅₀ is approximately 32 nM [2]

与 mTOR 抑制剂 PP242 相比，KU-0063794 对 mTOR 表现出更高的特异性，因为对 PI3K 或 76 种其他激酶没有活性。在 HEK-293 细胞中，30 nM 的 KU-0063794 足以通过阻断疏水基序 (Thr389) 的磷酸化以及随后的 T 环残基 (Thr229) 的磷酸化来快速消除 S6K1 活性。在 IGF1 刺激后，需要 300 nM 的 KU-0063794 才能完全抑制血清饥饿的 HEK-293 细胞中的 S6K1 活性。此外，浓度为 100–300 nM 的 KU-0063794 完全抑制氨基酸引起的 S6K1 和 S6 蛋白磷酸化。与 S6K1 类似，KU-0063794 以剂量和时间依赖性方式阻断 mTORC1 Ser2448 和 mTORC2 Ser2481。 KU-0063794 对 Akt Ser473 和意外 Thr308 的活性和磷酸化产生剂量依赖性抑制，以及 Akt 底物 PRAS40 在 Thr246、GSK3/GSK3 在 Ser21/Ser9 和 Foxo-1/3a 在 Thr24 的磷酸化/Thr32 在血清存在下或 IGF1 刺激后。 KU-0063794（而非雷帕霉素）以剂量依赖性方式抑制 SGK1 活性和 Ser422 磷酸化及其生理底物 NDGR1，其程度与 S6K1 和 Akt 磷酸化相同。然而，KU-0063794 不会抑制佛波酯诱导的 ERK 或 RSK 磷酸化或 RSK 激活。与雷帕霉素相比，KU-0063794 导致 4E-BP1 Thr37、Thr46 和 Ser65 完全去磷酸化的效力明显更高。 KU-0063794 比雷帕霉素更显着地抑制具有野生型和 mLST8 缺陷突变的 MEF 中的细胞生长，并导致 G1 细胞周期停滞。 [1]

---

激酶活性抑制：KU-0063794可强效抑制纯化mTOR激酶的活性。当与重组mTOR-GβL复合物孵育时，药物以剂量依赖性方式降低mTOR底物（如4E-BP1片段）的磷酸化水平，IC₅₀为10 nM。该药物对mTOR具有高选择性，即使在浓度高达1 μM时，也未显著抑制其他相关激酶（如PI3Kα、Akt1）的活性 [1]
- HEK293细胞中的信号通路调控：用KU-0063794处理HEK293细胞后，mTORC1和mTORC2下游信号通路被剂量依赖性抑制。在50 nM浓度下，药物使p70S6K（Thr389，mTORC1底物）的磷酸化水平较未处理对照组降低80%以上，使Akt（Ser473，mTORC2底物）的磷酸化水平降低约70%。单次处理后，磷酸化抑制效应至少可维持24小时 [1]
- 前列腺癌细胞中的抗增殖活性：在PC-3（雄激素非依赖性）和LNCaP（雄激素依赖性）前列腺癌细胞系中，KU-0063794表现出剂量依赖性抗增殖作用。采用MTT法检测，处理72小时后，其IC₅₀在PC-3细胞中为25 nM，在LNCaP细胞中为32 nM。在100 nM浓度下，药物对PC-3细胞的增殖抑制率达90%，对LNCaP细胞的增殖抑制率达85%（相较于溶剂对照组） [2]
- 前列腺癌细胞中的凋亡诱导：KU-0063794可诱导PC-3细胞凋亡。用100 nM药物处理48小时后，Annexin V-FITC阳性细胞（早期凋亡细胞）比例从对照组的5%升至25%，Annexin V-FITC/PI双阳性细胞（晚期凋亡/坏死细胞）比例从对照组的3%升至12%。Western blot分析显示，药物使凋亡标志物切割型caspase-3的表达水平较对照组上调3倍 [2]
- 细胞周期阻滞：在PC-3细胞中，KU-0063794可导致细胞周期阻滞于G₁期。流式细胞术分析显示，用50 nM药物处理24小时后，G₁期细胞比例从对照组的55%升至72%，而S期细胞比例从对照组的30%降至15% [2]

Ku0063794 在临床前肾细胞癌模型中抑制肿瘤生长和 mTOR 信号传导。然而，在动物研究中，Ku0063794 并不比替西罗莫司更有效。替西罗莫司对肿瘤微环境具有显着影响的事实可能是Ku0063794体内活性缺乏增加的原因。虽然 Ku0063794 对异种移植肿瘤的血管生成没有影响，但替西罗莫司却有影响。与用 Ku0063794 治疗的肿瘤相比，用替西罗莫司治疗的肿瘤表达的 VEGF 和 PDGF 水平较低，从而减少了血管生成[2]。

---

PC-3异种移植裸鼠的抗肿瘤活性：对携带皮下PC-3肿瘤的裸鼠进行KU-0063794处理。药物通过腹腔注射给药，剂量为15 mg/kg，每周2次，连续3周。与溶剂对照组相比，处理组肿瘤生长显著受抑：治疗结束时，平均肿瘤体积在处理组为320 mm³，对照组为910 mm³，肿瘤生长抑制率约为65%；药物还使肿瘤重量降低60%（平均肿瘤重量：处理组0.3 g vs 对照组0.75 g）。处理组小鼠未出现显著体重下降（体重变化<10%）或其他明显毒性症状 [2]
- 异种移植肿瘤中mTOR信号的调控：从KU-0063794处理组小鼠收集的肿瘤组织中，mTOR下游靶标的磷酸化水平降低。Western blot分析显示，肿瘤组织中p70S6K（Thr389）和Akt（Ser473）的磷酸化水平分别较对照组降低75%和65%。免疫组化染色也证实，处理组肿瘤中Ki-67（增殖标志物）阳性细胞比例降低（处理组20% vs 对照组60%） [2]

Specificity kinase panel/特异性激酶活性筛选[1]
\n所有检测均在国家蛋白激酶分析中心进行(http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/)如前所述。简而言之，所有检测都是在室温（21°C）下自动进行的，并且在所用条件下与时间和酶浓度呈线性关系。使用96孔形式的Multidrop Micro试剂分配器（Thermo Electron Corporation，Waltham，MA，U.S.A.）进行30分钟的分析。表1的图例中定义了每种激酶的缩写。测定中乙酸镁的浓度为10 mM，CK2α、DYRK3、EF2K、ERK1、ERK8、GSK3β、HIPK2、IGF1R、IRR、MARK3、MKK1、p38γMAPK（丝裂原活化蛋白激酶）、p38δMAPK、PAK4、PIM2、Akt1、PLK1、PKCζ和PRK2在5μm时使用[γ-33P]ATP（约800 c.p.m/pmol）；20μM用于CaMKKβ、CDK2/细胞周期蛋白A、CHK1、CHK2、CK1δ、CSK、EPH-B3、FGF-R1、IR、JNK1α1、JNK2α2、MAPKAP-K2、MSK1、MST2、MST4、p38βMAPK、PKA、PAK5、PAK6、PDK1、PIM1、PIM3、PKCα、ROCKII、PRAK、S6K1、SGK1、SYK、VEGFR和YES1；或AMPK、BRSK2、BTK、CaMK1、DYRK1a、DYRK2、EPH-A2、ERK2、IKKε、LCK、MELK、NEK2A、NEK6、p38α、PhKγ1、Akt2、PKD1、RSK1、RSK2、SRPK1和TBK1为50μM，以达到或低于每种酶的ATP Km

---

\nLipid kinase pane/脂质激酶活性筛选[1]
\nSPHK1（鞘氨醇激酶1）的测定如下：在含有50 mM Tris/HCl、pH 7.5、150 mM NaCl、5 mM MgCl2、1 mM EGTA和1 mM DTT（二硫苏糖醇）的50μl终体积中，对SPHK1[稀释于50 mM Tris-HCl中，pH 7.5、150mM NaCl、5 mmol MgCl2、1mM EGTA、10μM鞘氨醇、10μM ATP和1 mM DT中]进行鞘氨醇测定，并在室温下孵育30分钟
\nSPHK2的测定如下：SPHK2（在50 mM Tris/HCl、pH 7.5、200 mM KCl、5 mM MgCl2、1 mM EGTA和1 mM DTT中稀释）在最终体积为50μl的鞘氨醇中进行了测定，其中含有50 mM Tris-HCl、pH 7.5200 mM KCl、5 mM氯化镁、1 mM EGFA、10μM鞘氨醇、1μM ATP和1 mM DT，并在室温下孵育30分钟
\n\n\n\n

\n

View More

\n\n胆碱激酶的测定如下：胆碱激酶（在25 mM甘氨酸/NaOH、pH 8.5、67 mM KCl和5 mM MgCl2中稀释）在最终体积为50μl的溶液中测定胆碱，该溶液含有25 mM甘氨酸/NaOH、pH8.5、67 mmol KCl、5 mM MgCl2、1 mM胆碱、1μM ATP和1 mM DTT，并在室温下孵育30分钟。通过加入50μl激酶-Glo Plus试剂，在室温下孵育10分钟并读取1秒/孔的读数，停止了这三次测定
\n1类PI3Kα的测定如下：PI3Kα（在50 mM Hepes、pH 7.5、150 mM NaCl、0.02%胆酸钠和1 mM DTT中稀释）针对PtdIns（4,5）P2 diC8进行测定，最终体积为50μl，含有37 mM Hepes，pH 7.5、111 mM NaCl、0.02%胆酸钠、5 mM DTT、5 mM MgCl2、1 mM ATP和2μM PtdIns。通过加入5.5μl 50 mM EDTA和0.02%（w/v）胆酸钠溶液停止测定。将所得混合物的等分试样（25μl）转移到Lumitrac 200平板上。加入检测混合物1[41 mM Hepes，pH 7.5，123 mM NaCl，1.7μg GST-GRP1（鸟嘌呤核苷酸释放蛋白1），0.16μM PtdIns（3,4,5）P3-生物素，1.6μg链霉抗生物素蛋白-别藻蓝蛋白和0.96μg/ml铕螯合标记抗体]，使最终体积为50μl，在室温下孵育20分钟，然后读取
\n1类PI3Kβ的测定如下：PI3Kβ（在50 mM Hepes、pH 7.5、150 mM NaCl、0.02%胆酸钠和1 mM DTT中稀释）在最终体积为50μl的PtdIns（4,5）P2-diC8中进行了测定，其中含有37 mM Hepes，pH 7.5、111 mM NaCl、0.02%胆酸钠、5 mM DTT、5 mM MgCl2、1 mM ATP和2μM PtdNs（4.5）P2，并在室温下孵育70分钟。通过加入5.5μl 50 mM EDTA停止测定，并将25μl测定混合物转移到Lumitrac 200平板上。加入检测混合物1，使最终体积为50μl，在读取之前，将混合物在室温下孵育20分钟
\n第2类PI3KC2β的测定如下：在最终体积为50μl的含有19mM Tris/HCl、pH 7.5、143mM NaCl、0.96mM EDTA、0.96 mM DTT、0.96 mmol DTT、0.48mM EGTA、0.02%CHAPS、20μM磷脂酰肌醇、0.2mM ATP和2mM MgCl2的磷酸肌醇底物中，对PI3KClβ（在20mM Tris/HCl中稀释，pH 7.5、150mM NaCl、1mM DTT、0.5mM EGTA和0.02%CHAPS中）进行测定，并在室温下孵育30分钟。通过加入5.5μl 50 mM EDTA和2%CHAPS停止测定，并将25μl转移到Lumitrac 200平板上。加入检测混合物2（18.6 mM Tris/HCl，pH 7.5，140 mM NaCl，0.9 mM DTT，0.02%CHAPS，1.4μg SGK PX，0.06μM PtdIns3P–生物素，1.6μg链霉抗生物素蛋白–别藻蓝蛋白和0.64μg/ml Eu螯合物标记抗体），使最终体积为50 ml，在室温下孵育30分钟，然后读取
\n3类VPS34的测定如下：VPS34（在20 mM Tris/HCl、pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT、0.5 mM EGTA和0.02%CHAPS中稀释）在最终体积为50μl的磷酸肌醇底物中进行测定，该底物含有19 mM Tris/HCl、pH 7.5，143 mM NaCl、0.96 mM EDTA、0.96 mmol DTT、0.48 mM EGTA、0.02%CHAPS、20μM磷脂酰肌醇、0.2 mM ATP和2 mM MnCl2，并在室温下孵育60分钟。通过加入5.5μl 50 mM EDTA和2%CHAPS停止测定，并将25μl转移到Lumitrac 200平板上。加入检测混合物2，使最终体积为50ml，在室温下孵育30分钟，然后读取

---

\nmTOR复合物激酶测定[1]
\nHEK-293细胞在Hepes裂解缓冲液中新鲜裂解。赖氨酸盐（1-4mg）通过与5-20μl与免疫前IgG结合的G蛋白琼脂糖孵育进行预清除。然后将裂解物提取物与5-20μl的G蛋白琼脂糖结合，该G蛋白琼脂糖与5-二十μG的抗Rictor或抗Raptor抗体或免疫前IgG结合。所有抗体均与G蛋白琼脂糖共价结合。在振动平台上于4°C下进行免疫沉淀1小时。用Hepes裂解缓冲液洗涤免疫沉淀物四次，然后用Hepes激酶缓冲液洗涤两次。对于用于磷酸化S6K1的Raptor免疫沉淀物，在最初的两个洗涤步骤中，缓冲液中含有0.5 M NaCl，以确保最佳的激酶活性[7]。GST-Akt1是从用PI-103（1μM）孵育1小时的无血清HEK-293细胞中分离出来的[24]。GST-S6K1从用雷帕霉素（0.1μM，1小时）孵育的无血清HEK-293细胞中纯化[25]。在有或没有Ku-0063794和GST-Akt1（0.5μg）或GST-S6K1（0.5μg）的情况下，通过添加0.1 mM ATP和10 mM MgCl2引发mTOR反应。在30°C的振动平台上进行反应30分钟，并通过加入SDS样品缓冲液停止反应。然后将反应混合物通过0.22-μm孔径的Spin-X过滤器过滤，并对样品进行电泳和免疫印迹分析

---

\n激酶测定[1]
\nHEK-293在Tris裂解缓冲液中裂解。为了进行Akt和S6K检测，将500μg裂解物与5μg与g蛋白琼脂糖偶联的相应抗体一起孵育。为了进行SGK1活性测定，将50μg转染的裂解物与5μg谷胱甘肽琼脂糖孵育。所有培养均在振动平台上在4°C下进行1小时。使用Crosstide肽（GRPRTSSFAEG）在30μM下精确测定激酶活性，如前所述[35]。通过将反应混合物施加到P81磷酸纤维素纸上，并在磷酸中洗涤纸张后进行放射性液体闪烁计数，确定[32P]磷酸盐掺入肽底物中的情况。一个活性单位被定义为催化1 nmol[32P]磷酸盐掺入底物的单位。[1]

---

\nHEK-293细胞在Hepes裂解缓冲液中新鲜裂解。通过将溶胞产物（1-4mg）与5-20L与免疫前IgG结合的G-糖蛋白孵育，溶胞产物被预先清除。之后，将5-20L的G-Sepharose蛋白与5-20g的抗Rictor或抗Raptor抗体或免疫前IgG偶联，与裂解物提取物一起孵育。G-琼脂糖蛋白与每种抗体共价偶联。免疫沉淀在4°C的振动平台上进行1小时。用Hepes裂解缓冲液洗涤免疫沉淀物四次，然后用Hepes激酶缓冲液洗涤两次。为了确保最佳的激酶活性，用于磷酸化S6K1的Raptor免疫沉淀物的前两个洗涤步骤的缓冲液含有0.5 M NaCl。在PI-103（1μM，1小时）孵育一小时后，从血清饥饿的HEK-293细胞中纯化GST-Akt1。GST-S6K1是从血清和雷帕霉素（0.1μM，1小时）耗尽的HEK-293细胞中分离出来的。为了启动mTOR反应，加入0.1 mM ATP和10 mM MgCl2，同时加入不同浓度的Ku-0063794和GST-Akt1（0.5μg）或GST-S6K1（0.5μg）。在振动平台上于30°C下运行30分钟后，加入SDS样品缓冲液会停止反应。之后，将反应混合物通过孔径为0.22米的Spin-X过滤器过滤，并使用指定的抗体对样品进行电泳和免疫印迹分析。\n

\n

\n\n

---

mTOR激酶活性测定：首先将重组mTOR蛋白与GβL（mTOR结合蛋白）在含Tris-HCl（pH 7.5）、MgCl₂和DTT的反应缓冲液中形成复合物。将不同浓度的KU-0063794（0.1 nM至1 μM）加入mTOR-GβL复合物中，混合物在30°C预孵育15分钟。随后，加入含4E-BP1片段（特异性mTOR底物）和[γ-³²P]ATP的底物混合物启动反应，30°C孵育30分钟后，加入SDS上样缓冲液终止反应。通过SDS-PAGE分离磷酸化的4E-BP1片段，使用磷屏成像仪检测磷酸化底物条带的放射性。相较于溶剂对照组计算激酶活性抑制百分比，通过拟合剂量-反应曲线确定IC₅₀值 [1]
- 激酶选择性测定：使用一组重组激酶（包括PI3Kα、Akt1、ERK1和JNK1）评估KU-0063794对mTOR的选择性。每种激酶在各自优化的反应缓冲液中，与特异性底物、ATP（含用于放射性检测的[γ-³²P]ATP）以及1 μM KU-0063794（或溶剂）共同孵育，反应温度和时间针对每种激酶进行优化。反应终止后，采用与mTOR激酶测定相同的方法检测磷酸化底物，通过比较药物存在与否时各激酶的活性评估选择性 [1]

每 24 小时，将新一批新鲜溶解的 KU-0063794 添加到培养基中，并用其处理细胞 24、48 和 72 小时。将细胞固定在含 4% (v/v) 多聚甲醛的 PBS 中 15 分钟，以测量细胞生长。将细胞用水洗涤一次，用0.1%结晶紫的10%乙醇溶液染色20分钟，然后用水洗涤3次。使用 0.5 mL 10% (v/v) 乙酸 20 分钟从细胞中提取结晶紫。然后，将洗脱液以1:10的比例用水稀释，并测量590 nm处的吸光度。

---

细胞活力测定[2]
按照制造商的建议，使用CellTiter Glo®发光细胞活力测定试剂盒在96孔透明底部组织培养板中进行细胞活力测定。Caki-1、786-O或HUVEC细胞以足够低的密度铺板，以确保细胞永远不会达到完全融合。在细胞接种后一天，以指定浓度在三个孔中加入药物（Ku-0063794或坦西罗莫司）或赋形剂（DMSO）。在处理24、48、72和96小时后测量细胞存活率。使用Wallac 1420 VICTOR2™读板器测量发光。细胞活力以每个时间点对应阴性对照的百分比表示。使用Graphpad Prism（6.0版）计算抑制浓度（如IC50、IC30和IC20）。 细胞周期分布的流式细胞术分析[2]
将Caki-1和786-O细胞铺在10cm的细胞培养皿中，以使未经处理的对照在实验结束时达到50%的融合。在细胞接种后一天，将药物（Ku-0063794或坦西罗莫司）或载体（DMSO）以指定浓度加入三个重复孔中。处理72小时后，对每个培养皿中的活细胞进行计数。为了评估细胞周期分布，将细胞重新悬浮在70%乙醇（v/v）中。细胞在黑暗中用含有50µg/ml碘化丙啶和50µg/ml RNase A的PBS染色1小时。用FACS Calibur流式细胞仪和CellQuest软件测量细胞的DNA含量。使用Modfit LT软件确定细胞周期分布。

---

MTT细胞增殖测定：将PC-3和LNCaP细胞以每孔2×10³个细胞的密度接种于96孔板，在37°C、5% CO₂条件下培养过夜。次日，向孔中加入不同浓度的KU-0063794（1 nM至1 μM），每个浓度设3个复孔，同时设置溶剂对照组（含与药物组等量的DMSO）。细胞培养72小时后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL，溶于PBS），37°C继续孵育4小时。小心吸弃上清液，每孔加入150 μL DMSO溶解甲瓒结晶，使用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度。细胞存活率按（药物组吸光度/对照组吸光度）×100%计算，通过绘制剂量-反应曲线获得IC₅₀值 [2]
- 信号蛋白Western blot分析：将HEK293、PC-3或LNCaP细胞以每孔5×10⁵个细胞的密度接种于6孔板，培养过夜。随后用不同浓度的KU-0063794（0、10、50、100 nM）处理细胞24小时。处理后，用冰预冷的PBS洗涤细胞2次，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞。细胞裂解液在4°C、12,000 × g条件下离心15分钟，收集上清液（总蛋白）。采用BCA法测定蛋白浓度，每泳道上样30 μg蛋白，经10% SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜。膜用含5%脱脂牛奶的TBST封闭1小时（室温），随后加入一抗（抗磷酸化p70S6K Thr389、抗p70S6K、抗磷酸化Akt Ser473、抗Akt、抗切割型caspase-3或抗GAPDH），4°C孵育过夜。次日，用TBST洗涤膜3次，加入HRP标记的二抗，室温孵育1小时。再次洗涤后，使用ECL化学发光试剂盒显影蛋白条带，用ImageJ软件定量条带强度 [1,2]
- Annexin V-FITC/PI凋亡测定：将PC-3细胞以每孔5×10⁵个细胞接种于6孔板，用100 nM KU-0063794（或溶剂）处理48小时。胰酶消化收集细胞，用冰预冷的PBS洗涤2次，重悬于1×结合缓冲液中，细胞浓度调整为1×10⁶个/mL。向100 μL细胞悬液中加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色液，室温避光孵育15分钟后，加入400 μL 1×结合缓冲液。1小时内用流式细胞仪分析凋亡细胞，细胞分为四个象限：活细胞（Annexin V⁻/PI⁻）、早期凋亡细胞（Annexin V⁺/PI⁻）、晚期凋亡/坏死细胞（Annexin V⁺/PI⁺）和坏死细胞（Annexin V⁻/PI⁺） [2]
- 细胞周期分析：用50 nM KU-0063794（或溶剂）处理PC-3细胞24小时。收集细胞，用PBS洗涤后，加入70%冰预冷乙醇，4°C固定过夜。固定后的细胞用PBS洗涤2次，重悬于含RNase A（100 μg/mL）的PBS中，37°C孵育30分钟。随后加入PI染色液（50 μg/mL），室温避光孵育30分钟。用流式细胞仪分析细胞DNA含量，使用ModFit软件计算G₁、S、G₂/M期细胞比例 [2]

Nu/Nu nude mice
8 mg/kg
i.p.

---

Xenograft Model[2]
Six-week-old female, Nu/Nu nude mice were purchased from Charles River Laboratories. Approximately 5×106 786-O cells were injected subcutaneously into the flank, and the tumors were allowed to reach 5 mm in diameter before starting treatment. The mice were randomly divided into three groups and treated once daily (five days a week) by intraperitoneal (IP) injection with DMSO (vehicle control), temsirolimus (0.6 mg/kg), or Ku0063794 (8 mg/kg). The tumor size and body weight were measured at least twice weekly. Tumor volume was estimated using the standard formula: (length×width2)/2. The mice were sacrificed after 46 days of treatment and the tumors were excised. Tumors were divided and either flash frozen in liquid nitrogen or placed in 10% buffered formalin and paraffin embedded (PE). The flash frozen tumors were homogenized in detergent lysis buffer with tissue homogenizer. The supernatant was used for western blotting. To prepare drugs for injection, temsirolimus was solubilized as a 5 mM stock solution in DMSO. Prior to IP injection, temsirolimus was diluted (15 µg/100 µl) in PEG1500 (50% (w/v) in 75 mM Hepes, pH 8.0). Ku0063794 was solubilized in one part DMSO and then diluted (200 µg/100 µl) with 4 parts PEG1500 (50% (w/v) in 75 mM Hepes, pH 8.0)[2].

---

PC-3 xenograft nude mouse model establishment and treatment: Male BALB/c nude mice (6-8 weeks old, SPF grade) were used. PC-3 cells in the logarithmic growth phase were harvested, washed with PBS, and resuspended at a concentration of 5×10⁷ cells/mL. A total of 0.2 mL of the cell suspension (1×10⁷ cells) was injected subcutaneously into the right flank of each mouse to establish the xenograft model. When the tumor volume reached approximately 100 mm³, the mice were randomly divided into two groups (n=6 per group): solvent control group and KU-0063794 treatment group.
- Drug preparation and administration: KU-0063794 was dissolved in a mixture of DMSO, polyethylene glycol 400, and normal saline (volume ratio 1:4:5) to prepare a stock solution with a concentration of 3 mg/mL. The treatment group received an intraperitoneal injection of KU-0063794 at a dose of 15 mg/kg, twice a week for 3 weeks. The control group received an equal volume of the solvent mixture via the same route and frequency.
- Data collection and sample processing: During the treatment period, the body weight of each mouse was measured twice a week, and the tumor volume was measured using a vernier caliper (tumor volume = length × width² / 2). At the end of the treatment, all mice were euthanized, and the tumors were excised, weighed, and photographed. Part of the tumor tissue was stored at -80°C for Western blot analysis, and the remaining part was fixed in 4% paraformaldehyde for immunohistochemical staining [2]

In vivo toxicity in nude mice: During the 3-week treatment of nude mice with KU-0063794 (15 mg/kg, intraperitoneal injection, twice a week), no significant toxic symptoms were observed. The body weight of the treated mice remained stable, with a maximum weight loss of less than 5% compared to the initial weight (control group: weight gain of 3%, treatment group: weight gain of 1%). No deaths, abnormal behavior (e.g., reduced activity, loss of appetite), or organ damage (observed via gross anatomy after euthanasia) were found in the treatment group [2]
- No data on in vitro toxicity (e.g., cytotoxicity to normal cells), half-lethal dose (LD₅₀), hepatotoxicity, nephrotoxicity, drug-drug interactions, or plasma protein binding rate of KU-0063794 were reported in the two literatures [1,2]

[1]. Biochem J. 2009 Jun 12;421(1):29-42.

[2]. PLoS One. 2013;8(1):e54918.

Ku-0063794 is a member of the class of pyridopyrimidines that is an mTOR inhibitor and shows anti-tumour properties. It has a role as a mTOR inhibitor and an antineoplastic agent. It is a member of morpholines, a pyridopyrimidine, a monomethoxybenzene, a tertiary amino compound and a member of benzyl alcohols.

---

KU-0063794 is a small-molecule inhibitor that specifically targets both mTORC1 and mTORC2, distinguishing it from rapamycin and its analogs (which only inhibit mTORC1). This dual inhibition allows KU-0063794 to block both mTORC1-mediated cell proliferation and mTORC2-mediated Akt activation, thereby exerting more potent antitumor effects, especially in tumors with activated Akt signaling [1,2]
- In HEK293 cells, the inhibition of mTOR signaling by KU-0063794 was reversible. After removing the drug from the culture medium, the phosphorylation levels of p70S6K and Akt gradually recovered to the control level within 48 hours, indicating that the drug’s effect is dependent on its continuous presence [1]
- The antitumor activity of KU-0063794 in PC-3 xenograft mice was associated with both the inhibition of tumor cell proliferation (reduced Ki-67 expression) and the induction of apoptosis (upregulated cleaved caspase-3), suggesting a dual mechanism of action in vivo [2]

C25H31N5O4

465.5447

465.237

C, 64.50; H, 6.71; N, 15.04; O, 13.75

938440-64-3

938440-64-3

16736978

Light yellow to yellow solid powder

1.2±0.1 g/cm3

694.3±65.0 °C at 760 mmHg

373.7±34.3 °C

0.0±2.3 mmHg at 25°C

1.609

0.27

93.07

1

9

5

34

643

2

C[C@@H]1O[C@H](C)CN(C2N=C3N=C(C4C=CC(OC)=C(CO)C=4)C=CC3=C(N3CCOCC3)N=2)C1

RFSMUFRPPYDYRD-CALCHBBNSA-N

InChI=1S/C25H31N5O4/c1-16-13-30(14-17(2)34-16)25-27-23-20(24(28-25)29-8-10-33-11-9-29)5-6-21(26-23)18-4-7-22(32-3)19(12-18)15-31/h4-7,12,16-17,31H,8-11,13-15H2,1-3H3/t16-,17+

[5-[2-[(2R,6S)-2,6-dimethylmorpholin-4-yl]-4-morpholin-4-ylpyrido[2,3-d]pyrimidin-7-yl]-2-methoxyphenyl]methanol

Ku0063794; Ku 0063794; KU0063794; Ku-0063794; KU-0063794; KU 0063794; KU 63794; 81HJG228AB; CHEMBL1078983; KU-63794; KU63794

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~16 mg/mL (~34.4 mM)
Water: <1 mg/mL
Ethanol: <1 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (3.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 16.7 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (3.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 16.7mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: ≥ 1.67 mg/mL (3.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 16.7 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

---

配方 4 中的溶解度: 30% PEG400+0.5% Tween80+5% propylene glycol: 13mg/mL

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。