KU-55933

ATM ( IC50 = 12.9 nM ); DNA-PK ( IC50 = 2500 nM ); mTOR ( IC50 = 9300 nM ); PI3K ( IC50 = 16600 nM )

体外活性：KU-55933 抑制 DNA-PK 和 PI3K，IC50 分别为 2.5 μM 和 16.6 μM。此外，KU-55933 还可以抑制 mTOR 的活性，IC50 为 9.3 μM。 KU-55933 在细胞水平上活跃，可消除已充分表征的 ATM 依赖性磷酸化事件。 KU-55933 抑制这种 ATM 依赖性磷酸化事件具有剂量依赖性作用，IC50 为 300 nM。 KU-58050 在剂量为 30 μM 之前不会阻止 p53 丝氨酸 15 的 ATM 依赖性磷酸化。添加 KU-55933 对紫外线诱导的丝氨酸 139 上的 H2AX、丝氨酸 343 上的 NBS1、丝氨酸 345 上的 CHK1 和丝氨酸 966 上的 SMC1 磷酸化没有明显影响。与紫外线反应形成鲜明对比的是，KU-55933 消除了电离这些 ATM 底物的辐射诱导磷酸化。 KU-55933 使 HeLa 细胞对一系列电离辐射剂量敏感。 KU-55933 抑制癌细胞中生长因子诱导的 Akt 磷酸化。 KU-55933 抑制癌细胞的增殖。此外，KU-55933 抑制 ATM 可以提高生存率，这可能是通过阻止 TAp63α 下游激活来实现的。激酶测定：用于体外测定的 ATM 是通过用兔多克隆抗血清进行免疫沉淀从 HeLa 核提取物中获得的，该血清在含有 25 mM HEPES (pH 7.4)、2 mM MgCl2、250 的缓冲液中升至 ATM 的 COOH 末端 400 个氨基酸mM KCl、500 μM EDTA、100 μM Na3VO4、10% v/v 甘油和 0.1% v/v Igepal。通过与 Protein A-Sepharose 珠子一起孵育 1 小时，然后通过离心回收珠子，从核提取物中分离出 ATM-抗体复合物。在 96 孔板的孔中，将含有 ATM 的琼脂糖珠与 1 μg 底物谷胱甘肽 S-转移酶 -p53N66（p53 的 NH2 末端 66 个氨基酸与谷胱甘肽 S-转移酶融合）在 ATM 测定缓冲液中孵育 [25 mM HEPES (pH 7.4)、75 mM NaCl、3 mM MgCl2、2 mM MnCl2、50 μM Na3VO4、500 μM DTT 和 5% v/v 甘油]，37 °C，存在或不存在抑制剂。轻轻摇动 10 分钟后，添加 ATP 至终浓度 50 μM，并在 37 °C 下继续反应 1 小时。将板以 250 × g 离心 10 分钟（4 °C），除去含有 ATM 的珠子，取出上清液，转移至白色不透明 96 孔板中，室温孵育 1.5 小时，使谷胱甘肽S-转移酶-p53N66 结合。然后用 PBS 清洗该板，吸干，并使用磷酸丝氨酸 15 p53 抗体通过标准 ELISA 技术进行分析。磷酸化谷胱甘肽 S-转移酶-p53N66 底物的检测是与山羊抗小鼠辣根过氧化物酶缀合的二抗结合进行的。使用增强化学发光溶液产生信号并进行化学发光检测。 细胞测定：U2OS 细胞暴露于电离辐射（3、5 或 15 Gy）或紫外线（5 或 50 J/m2），ATM 响应由下式确定： p53 丝氨酸 15 磷酸化和野生型 p53 稳定性的蛋白质印迹分析。从每个时间点获得全细胞提取物，通过 SDS-PAGE 分离蛋白质，并使用 p53 磷酸丝氨酸 15 特异性抗体测量磷酸化丝氨酸 15 的 ATM 特异性增加。使用 p53 特异性抗体 (DO-1) 还可以观察到 p53 随着时间的推移总体稳定。同样，为了研究 H2AX、CHK1、NBS1 和 SMC1 上的 ATM 依赖性磷酸化，使用以下抗体：CHK1 磷酸丝氨酸 345 和 NBS1 磷酸丝氨酸 343 抗体。还使用组蛋白 H2A (H-124) 和 CHK1 抗体，以及 SMC1 和 SMC1 磷酸丝氨酸 966 抗体。为了测定 KU-55933 的细胞 IC50，使用 2 小时的 p53 丝氨酸 15 磷酸化峰值响应时间来监测 ATM 的抑制。在电离辐射之前，将 KU-55933 滴定到细胞上并预孵育 1 小时。使用扫描密度测定法，计算相对于载体对照的抑制百分比，并计算体外测定的IC50值。

KU-55933 抑制 ATM 依赖性 STAT3 激活可通过上调表面 DR5 表达来增强 TRAIL 介导的细胞凋亡，而抑制 STAT3 和 NF-κB 似乎参与了 cFLIP 的下调，并伴随着 cFLIP 的额外增加。凋亡水平。 ATM 抑制剂 KU-55933 对 TRAIL 介导的细胞凋亡的影响比 JAK2 抑制剂 AG490 或 STAT3β 过表达更强。

为了获得用于体外测定的 ATM，使用涉及用 25 mM HEPES (pH 7.4)、2 mM 缓冲混合物的方法，从 HeLa 核提取物中免疫沉淀 ATM 的 COOH 末端 400 个氨基酸的兔多克隆抗血清。 MgCl₂、250 mM KCl、500 μM EDTA、100 μM Na3VO4、10% v/v 甘油和 0.1% v/v Igepal。与 Protein A-Sepharose 珠子一起孵育一小时并随后离心回收珠子后，ATM-抗体复合物从核提取物中分离出来。 96 孔板的孔用于在 ATM 测定缓冲液 [25 mM HEPES ( pH 7.4)、75 mM NaCl、3 mM MgCl₂、2 mM MnCl₂、50 μM Na₃VO_{4、500 μM DTT 和 5% v/v 甘油]，37 °C，有或没有抑制剂。轻轻摇动 10 分钟后添加 ATP 至终浓度 50 μM，然后在 37 °C 下继续反应 1 小时。将板以 250 × g 离心 10 分钟 (4 °C)，以去除含有 ATM 的珠子，从而使谷胱甘肽 S-转移酶 -p53N66 结合发生。然后取出上清液并放入白色不透明96孔板中。该孵育过程在室温下需要 1.5 小时。该板的后续步骤是 PBS 清洗、干印迹和使用磷酸丝氨酸 15 p53 抗体的标准 ELISA 分析。当使用与山羊抗小鼠辣根过氧化物酶缀合的二抗时，可以检测到磷酸化谷胱甘肽 S-转移酶-p53N66 的底物。创建信号和化学发光检测的过程涉及使用增强的化学发光溶液。进行化学发光检测并使用增强的化学发光溶液产生信号。}

ATM 反应通过对暴露于电离辐射（3、5 或 15 Gy）或 UV（5 或 50 J/m< sup>2）。提取每个时间点的全细胞提取物，使用 SDS-PAGE 分离蛋白质，并使用 p53 磷酸化丝氨酸 15 特异性抗体来测量磷酸化丝氨酸 15 的 ATM 特异性增加。当使用 p53 特异性抗体 (DO- 1)，随着时间的推移，p53 总体稳定。同样，以下抗体用于研究 H2AX、CHK1、NBS1 和 SMC1 上的 ATM 依赖性磷酸化：NBS1 磷酸丝氨酸 343 和 CHK1 磷酸丝氨酸 345 抗体。还使用 SMC1 和 SMC1 磷酸丝氨酸 966 抗体，以及抗组蛋白 H2A (H-124) 和 CHK1 的抗体。 p53 丝氨酸 15 磷酸化的两小时峰值响应时间用于追踪 ATM 抑制，以确定 KU-55933 的细胞 IC50。在应用电离辐射之前，将 KU-55933 滴定到细胞上并预孵育一小时。 IC 50 值的测定与体外测定类似，并且使用扫描密度测定法计算相对于媒介物对照的抑制百分比。

BALB/c nu/nu nude mice bearing LU1205 cells
10 μM

[1]. Discovery of 2-[1-(4,4-Difluorocyclohexyl)piperidin-4-yl]-6-fluoro-3-oxo-2,3-dihydro-1H-isoindole-4-carboxamide (NMS-P118): A Potent, Orally Available, and Highly Selective PARP-1 Inhibitor for Cancer Therapy. J Med Chem. 2015 Sep 10;58(17):6875-98.

">[1]. Cancer Res . 2004 Dec 15;64(24):9152-9.

[2]. Aging (Albany NY) . 2011 Aug;3(8):782-93.

[3]. Cancer Res . 2009 Apr 15;69(8):3510-9.

C21H17NO3S2

395.49

395.06

C, 63.77; H, 4.33; N, 3.54; O, 12.14; S, 16.22

587871-26-9

White to off-white solid powder

C1COCCN1C2=CC(=O)C=C(O2)C3=C4C(=CC=C3)SC5=CC=CC=C5S4

XRKYMMUGXMWDAO-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C21H17NO3S2/c23-14-12-16(25-20(13-14)22-8-10-24-11-9-22)15-4-3-7-19-21(15)27-18-6-2-1-5-17(18)26-19/h1-7,12-13H,8-11H2

2-morpholin-4-yl-6-thianthren-1-ylpyran-4-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

Solubility in Formulation 1: ≥ 2.5 mg/mL (6.32 mM) (saturation unknown) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (add these co-solvents sequentially from left to right, and one by one), clear solution.
For example, if 1 mL of working solution is to be prepared, you can add 100 μL of 25.0 mg/mL clear DMSO stock solution to 400 μL PEG300 and mix evenly; then add 50 μL Tween-80 to the above solution and mix evenly; then add 450 μL normal saline to adjust the volume to 1 mL.
Preparation of saline: Dissolve 0.9 g of sodium chloride in 100 mL ddH₂ O to obtain a clear solution.

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Solubility in Formulation 2: ≥ 2.5 mg/mL (6.32 mM) (saturation unknown) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (add these co-solvents sequentially from left to right, and one by one), clear solution.
For example, if 1 mL of working solution is to be prepared, you can add 100 μL of 25.0 mg/mL clear DMSO stock solution to 900 μL of 20% SBE-β-CD physiological saline solution and mix evenly.
Preparation of 20% SBE-β-CD in Saline (4°C，1 week): Dissolve 2 g SBE-β-CD in 10 mL saline to obtain a clear solution.

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Solubility in Formulation 3: ≥ 2.5 mg/mL (6.32 mM) (saturation unknown) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (add these co-solvents sequentially from left to right, and one by one), clear solution.
For example, if 1 mL of working solution is to be prepared, you can add 100 μL of 25.0 mg/mL clear DMSO stock solution to 900 μL of corn oil and mix evenly.

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Solubility in Formulation 4: 5% DMSO and 47.5% PEG300: 10mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。