KU-55933

ATM ( IC50 = 12.9 nM ); DNA-PK ( IC50 = 2500 nM ); mTOR ( IC50 = 9300 nM ); PI3K ( IC50 = 16600 nM )

体外活性：KU-55933 抑制 DNA-PK 和 PI3K，IC50 分别为 2.5 μM 和 16.6 μM。此外，KU-55933 还可以抑制 mTOR 的活性，IC50 为 9.3 μM。 KU-55933 在细胞水平上活跃，可消除已充分表征的 ATM 依赖性磷酸化事件。 KU-55933 抑制这种 ATM 依赖性磷酸化事件具有剂量依赖性作用，IC50 为 300 nM。 KU-58050 在剂量为 30 μM 之前不会阻止 p53 丝氨酸 15 的 ATM 依赖性磷酸化。添加 KU-55933 对紫外线诱导的丝氨酸 139 上的 H2AX、丝氨酸 343 上的 NBS1、丝氨酸 345 上的 CHK1 和丝氨酸 966 上的 SMC1 磷酸化没有明显影响。与紫外线反应形成鲜明对比的是，KU-55933 消除了电离这些 ATM 底物的辐射诱导磷酸化。 KU-55933 使 HeLa 细胞对一系列电离辐射剂量敏感。 KU-55933 抑制癌细胞中生长因子诱导的 Akt 磷酸化。 KU-55933 抑制癌细胞的增殖。此外，KU-55933 抑制 ATM 可以提高生存率，这可能是通过阻止 TAp63α 下游激活来实现的。激酶测定：用于体外测定的 ATM 是通过用兔多克隆抗血清进行免疫沉淀从 HeLa 核提取物中获得的，该血清在含有 25 mM HEPES (pH 7.4)、2 mM MgCl2、250 的缓冲液中升至 ATM 的 COOH 末端 400 个氨基酸mM KCl、500 μM EDTA、100 μM Na3VO4、10% v/v 甘油和 0.1% v/v Igepal。通过与 Protein A-Sepharose 珠子一起孵育 1 小时，然后通过离心回收珠子，从核提取物中分离出 ATM-抗体复合物。在 96 孔板的孔中，将含有 ATM 的琼脂糖珠与 1 μg 底物谷胱甘肽 S-转移酶 -p53N66（p53 的 NH2 末端 66 个氨基酸与谷胱甘肽 S-转移酶融合）在 ATM 测定缓冲液中孵育 [25 mM HEPES (pH 7.4)、75 mM NaCl、3 mM MgCl2、2 mM MnCl2、50 μM Na3VO4、500 μM DTT 和 5% v/v 甘油]，37 °C，存在或不存在抑制剂。轻轻摇动 10 分钟后，添加 ATP 至终浓度 50 μM，并在 37 °C 下继续反应 1 小时。将板以 250 × g 离心 10 分钟（4 °C），除去含有 ATM 的珠子，取出上清液，转移至白色不透明 96 孔板中，室温孵育 1.5 小时，使谷胱甘肽S-转移酶-p53N66 结合。然后用 PBS 清洗该板，吸干，并使用磷酸丝氨酸 15 p53 抗体通过标准 ELISA 技术进行分析。磷酸化谷胱甘肽 S-转移酶-p53N66 底物的检测是与山羊抗小鼠辣根过氧化物酶缀合的二抗结合进行的。使用增强化学发光溶液产生信号并进行化学发光检测。 细胞测定：U2OS 细胞暴露于电离辐射（3、5 或 15 Gy）或紫外线（5 或 50 J/m2），ATM 响应由下式确定： p53 丝氨酸 15 磷酸化和野生型 p53 稳定性的蛋白质印迹分析。从每个时间点获得全细胞提取物，通过 SDS-PAGE 分离蛋白质，并使用 p53 磷酸丝氨酸 15 特异性抗体测量磷酸化丝氨酸 15 的 ATM 特异性增加。使用 p53 特异性抗体 (DO-1) 还可以观察到 p53 随着时间的推移总体稳定。同样，为了研究 H2AX、CHK1、NBS1 和 SMC1 上的 ATM 依赖性磷酸化，使用以下抗体：CHK1 磷酸丝氨酸 345 和 NBS1 磷酸丝氨酸 343 抗体。还使用组蛋白 H2A (H-124) 和 CHK1 抗体，以及 SMC1 和 SMC1 磷酸丝氨酸 966 抗体。为了测定 KU-55933 的细胞 IC50，使用 2 小时的 p53 丝氨酸 15 磷酸化峰值响应时间来监测 ATM 的抑制。在电离辐射之前，将 KU-55933 滴定到细胞上并预孵育 1 小时。使用扫描密度测定法，计算相对于载体对照的抑制百分比，并计算体外测定的IC50值。

ATM激酶消融可改善小鼠[4]
的细胞周期紊乱和足细胞损伤[4]
为了进一步证实ATM在adr相关足细胞细胞周期再进入中的作用，研究人员使用一种特异性的ATM激酶抑制剂KU-55933抑制ATM的磷酸化和活性。值得注意的是，KU-55933缓解了ADR刺激引起的MAD2B升高（P<0.05）（图6A-B）。同时，ADR诱导的已知的MAD2B底物和细胞周期关键调节因子Skp2和p27的改变被KU-55933部分逆转（P<0.05）（图6C-D）。此外，流式细胞分析显示，ATM抑制剂增加了G2/ m期的足细胞（P<0.05）（图6E-F），避免了灾难性的分裂和细胞死亡。此外，KU-55933成功地阻止了adr引发的足细胞功能障碍，从nephrin （P<0.05）和CD2AP （P<0.05）表达的恢复可以看出（图6G-H）。同样，KU-55933有效抑制ADR注射引起的小鼠MAD2B过表达（P<0.05）（图7A-B）。经KU-55933预处理后，FSGS形态学异常减少（图7C-E），蛋白尿降低（P<0.05），血清白蛋白升高（P<0.05）（图7F-G）。因此，我们的观察表明，阻断ATM激活可以有效地预防或减轻足细胞损伤。

为了获得用于体外测定的 ATM，使用涉及用 25 mM HEPES (pH 7.4)、2 mM 缓冲混合物的方法，从 HeLa 核提取物中免疫沉淀 ATM 的 COOH 末端 400 个氨基酸的兔多克隆抗血清。 MgCl₂、250 mM KCl、500 μM EDTA、100 μM Na3VO4、10% v/v 甘油和 0.1% v/v Igepal。与 Protein A-Sepharose 珠子一起孵育一小时并随后离心回收珠子后，ATM-抗体复合物从核提取物中分离出来。 96 孔板的孔用于在 ATM 测定缓冲液 [25 mM HEPES ( pH 7.4)、75 mM NaCl、3 mM MgCl₂、2 mM MnCl₂、50 μM Na₃VO_{4、500 μM DTT 和 5% v/v 甘油]，37 °C，有或没有抑制剂。轻轻摇动 10 分钟后添加 ATP 至终浓度 50 μM，然后在 37 °C 下继续反应 1 小时。将板以 250 × g 离心 10 分钟 (4 °C)，以去除含有 ATM 的珠子，从而使谷胱甘肽 S-转移酶 -p53N66 结合发生。然后取出上清液并放入白色不透明96孔板中。该孵育过程在室温下需要 1.5 小时。该板的后续步骤是 PBS 清洗、干印迹和使用磷酸丝氨酸 15 p53 抗体的标准 ELISA 分析。当使用与山羊抗小鼠辣根过氧化物酶缀合的二抗时，可以检测到磷酸化谷胱甘肽 S-转移酶-p53N66 的底物。创建信号和化学发光检测的过程涉及使用增强的化学发光溶液。进行化学发光检测并使用增强的化学发光溶液产生信号。}

ATM 反应通过对暴露于电离辐射（3、5 或 15 Gy）或 UV（5 或 50 J/m< sup>2）。提取每个时间点的全细胞提取物，使用 SDS-PAGE 分离蛋白质，并使用 p53 磷酸化丝氨酸 15 特异性抗体来测量磷酸化丝氨酸 15 的 ATM 特异性增加。当使用 p53 特异性抗体 (DO- 1)，随着时间的推移，p53 总体稳定。同样，以下抗体用于研究 H2AX、CHK1、NBS1 和 SMC1 上的 ATM 依赖性磷酸化：NBS1 磷酸丝氨酸 343 和 CHK1 磷酸丝氨酸 345 抗体。还使用 SMC1 和 SMC1 磷酸丝氨酸 966 抗体，以及抗组蛋白 H2A (H-124) 和 CHK1 的抗体。 p53 丝氨酸 15 磷酸化的两小时峰值响应时间用于追踪 ATM 抑制，以确定 KU-55933 的细胞 IC50。在应用电离辐射之前，将 KU-55933 滴定到细胞上并预孵育一小时。 IC 50 值的测定与体外测定类似，并且使用扫描密度测定法计算相对于媒介物对照的抑制百分比。

ADR-induced FSGS murine model[4]
Adult male mice (8 wks of age with Balb/C background) weighing 21-24 g were raised in a specific pathogen-free environment with a 12 h light/dark cycle, and allowed access to food and water ad libitum. To establish the FSGS animal model, the mice were injected with a single dose of ADR (15 mg/kg) via the tail vein and sacrificed after 4 wks. Urine and serum samples were harvested prior to sacrifice, and the urine protein/creatinine, serum albumin, creatinine, and blood urea nitrogen were measured using an automated chemistry analyzer. After flushing with ice-cold Krebs-Henseleit-saline buffer via an aortal catheter, the kidneys were dissected on ice. The cortex tissues were snap frozen and stored at -80°C until use. To inhibit ATM kinase, KU-55933 (500 µg/kg), a specific ATM inhibitor, was dissolved in 0.15% DMSO and was administered intraperitoneally 24 h prior to ADR injection and repeated every 3 days until sacrifice.[4]

---

BALB/c nu/nu nude mice bearing LU1205 cells
10 μM

[1]. Discovery of 2-[1-(4,4-Difluorocyclohexyl)piperidin-4-yl]-6-fluoro-3-oxo-2,3-dihydro-1H-isoindole-4-carboxamide (NMS-P118): A Potent, Orally Available, and Highly Selective PARP-1 Inhibitor for Cancer Therapy. J Med Chem. 2015 Sep 10;58(17):6875-98.

[2]. Mechanisms of chemotherapy-induced human ovarian aging: double strand DNA breaks and microvascular compromise. Aging (Albany NY). 2011 Aug;3(8):782-93.

[3]. Inhibition of ataxia telangiectasia mutated kinase activity enhances TRAIL-mediated apoptosis in human melanoma cells. Cancer Res. 2009 Apr 15;69(8):3510-9.

[4]. MAD2B-mediated cell cycle reentry of podocytes is involved in the pathogenesis of FSGS. Int J Biol Sci . 2021 Oct 22;17(15):4396-4408.

ATM Kinase Inhibitor is any agent that inhibits ataxia telangiectasia mutated (ATM) kinase.

---

The mechanism of chemotherapy-induced acceleration of ovarian aging is not fully understood. We used doxorubicin, a widely used cancer chemotherapeutic, in a variety of in vivo xenograft, and in vitro models to investigate the impact of chemotherapy-induced aging on the human ovary. Doxorubicin caused massive double-strand-DNA-breaks in primordial follicles, oocytes, and granulosa cells in a dose dependent fashion as revealed by accumulating γH2AX foci. This damage was associated with apoptotic oocyte death and resulted in the activation of ATM. It appeared that the repair response enabled a minor proportion of oocytes (34.7%) and granulosa cells (12.1%) to survive while the majority succumbed to apoptotic death. Paradoxically, inhibition of ATM by KU-55933 resulted in improved survival, probably via prevention of downstream activation of TAp63α. Furthermore, doxorubicin caused vascular and stromal damage in the human ovary, which might impair ovarian function both pre- and post-menopausally. Chemotherapy-induced premature ovarian aging appears to result from a complex process involving both the germ- and non-germ cell components of the ovary. These effects may have clinical implications in aging both for premenopausal and postmenopausal cancer survivors.[2]

---

The aim of the present study was to elucidate the effects of ataxia telangiectasia mutated (ATM) kinase on the regulation of the extrinsic tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) receptor 2/DR5-mediated death pathway in human melanoma cells. We revealed that total ATM protein levels were high in some human melanoma lines compared with normal cells. The basal levels of active form ATM phospho-Ser(1981) were also detectable in many melanoma lines and could be further up-regulated by gamma-irradiation. Pretreatment of several melanoma lines just before gamma-irradiation with the inhibitor of ATM kinase KU-55933 suppressed p53 and nuclear factor-kappaB (NF-kappaB) activation but notably increased radiation-induced DR5 surface expression, down-regulated cFLIP (caspase-8 inhibitor) levels, and substantially enhanced exogenous TRAIL-induced apoptosis. Furthermore, gamma-irradiation in the presence of KU-55933 rendered TRAIL-resistant HHMSX melanoma cells susceptible to TRAIL-mediated apoptosis. In addition, suppression of ATM expression by the specific short hairpin RNA also resulted in down-regulation of cFLIP levels, up-regulation of surface DR5 expression, and TRAIL-mediated apoptosis in melanoma cells. Besides p53 and NF-kappaB, crucial regulators of DR5 expression, transcription factor STAT3 is known to negatively regulate DR5 expression. Suppression of Ser(727) and Tyr(705) phosphorylation of STAT3 by KU-55933 reduced STAT3 transacting activity accompanied by elevation in DR5 expression. Dominant-negative STAT3beta also efficiently up-regulated the DR5 surface expression and down-regulated cFLIP levels in melanoma cells in culture and in vivo. Taken together, our data show the existence of an ATM-dependent STAT3-mediated antiapoptotic pathway, which on suppression sensitizes human melanoma cells to TRAIL-mediated apoptosis.[3]

---

Rationale: Focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) is characterized by the dysfunction of "post-mitotic" podocytes. The reentry of podocytes in the cell cycle will ultimately result in cell death. Mitotic arrest deficient 2-like protein 2 (MAD2B), an inhibitor of anaphase-promoting complex (APC)/cyclosome, precisely controls the metaphase to anaphase transition and ordered cell cycle progression. However, the role of MAD2B in FSGS podocyte injury remains unknown. Methods: To explore MAD2B function in podocyte cell cycle reentry, we used conditional mutant mice lacking MAD2B selectively in podocytes in ADR-induced FSGS murine model. Additionally, KU-55933, a specific inhibitor of ataxia-telangiectasia mutated (ATM) was utilized in vivo and in vitro to explore the role of ATM in regulating MAD2B. Results: The expression of MAD2B in podocytes was dramatically increased in patients with FSGS and ADR-treated mice along with podocyte cell cycle reentry. Podocyte-specific knockout of MAD2B effectively attenuated proteinuria, podocyte injury, and prevented the aberrant cell cycle reentry. By bioinformatics analysis we revealed that ATM kinase is a key upstream regulator of MAD2B. Furthermore, inhibition of ATM kinase abolished MAD2B-driven cell cycle reentry and alleviated podocyte impairment in FSGS murine model. In vitro studies by site-directed mutagenesis and immunoprecipitation we revealed ATM phosphorylated MAD2B and consequently hampered the ubiquitination of MAD2B in a phosphorylation-dependent manner. Conclusions: ATM kinase-MAD2B axis importantly contributes to the cell cycle reentry of podocytes, which is a novel pathogenic mechanism of FSGS, and may shed light on the development of its therapeutic approaches.[4]

C21H17NO3S2

395.49

395.064

C, 63.77; H, 4.33; N, 3.54; O, 12.14; S, 16.22

587871-26-9

5278396

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

628.0±55.0 °C at 760 mmHg

229.98° C

333.6±31.5 °C

0.0±1.8 mmHg at 25°C

1.714

6.13

93.28

0

6

2

27

643

0

S1C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C2SC2=C([H])C([H])=C([H])C(=C12)C1=C([H])C(C([H])=C(N2C([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])C2([H])[H])O1)=O

XRKYMMUGXMWDAO-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C21H17NO3S2/c23-14-12-16(25-20(13-14)22-8-10-24-11-9-22)15-4-3-7-19-21(15)27-18-6-2-1-5-17(18)26-19/h1-7,12-13H,8-11H2

2-morpholin-4-yl-6-thianthren-1-ylpyran-4-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

配方 4 中的溶解度: 5% DMSO and 47.5% PEG300: 10mg/mL

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。