KU-60019

ATM ( IC50 = 6.3 nM ); DNA-PKcs ( IC50 = 1.7 μM )
KU-60019 targets ataxia telangiectasia mutated (ATM) kinase (IC50 = 6.3 nM) [1]
KU-60019 targets ATM kinase (IC50 = 5 nM; selectivity over ATR: IC50 > 10 μM, DNA-PKcs: IC50 > 10 μM) [2]

体外活性：与 KU-55933 相比，KU-60019 是一种改进的水溶性更好的 ATM 激酶抑制剂，同时表现出相似的靶点选择性。 KU-60019 对 DNA-PKcs 和 ATR 以及 229 种其他蛋白激酶（如 PI3K、mTOR 和 mTOR/FKBP12）几乎没有活性，IC50 值分别为 1.7 μM 和 >10 μM。在人胶质瘤 U87 和 U1242 细胞中，KU-60019 在阻断辐射诱导的关键 ATM 蛋白靶标（如 p53、γ-H2AX 和 CHK2）磷酸化方面的效力比 KU-55933 高 3 至 10 倍，浓度为 1 μM KU-60019 显着诱导 p53 (S15) 磷酸化降低 >70%，达到该程度需要约 10 μM 的 KU-55933 才能实现。 KU-60019 在 1 μM 和 10 μM 时有效地使人胶质瘤细胞放射增敏，剂量增强比分别为 1.7 和 4.4，并且还使正常成纤维细胞放射增敏，但不使 AT 成纤维细胞放射增敏。 KU-60019 治疗 (3 μM) 可分别阻断基础和胰岛素诱导的 AKT S473 磷酸化 70% 和约 50%，并将辐射诱导的 AKT 磷酸化完全降低至对照水平以下。 KU-60019 对 AKT S473 磷酸化的影响可以在神经胶质瘤细胞系和正常成纤维细胞中观察到，但在 AT (h-TERT) 细胞中观察不到，并且可以被磷酸酶抑制剂冈田酸显着阻断，这表明 ATM 激酶在通过未知磷酸酶调节 AKT 磷酸化。与抑制促存活 AKT 信号传导相一致，3 μM 的 KU-60019 显着抑制人胶质瘤 U87 细胞的迁移和侵袭，分别 >70% 和 ~60%，以及 U1242 细胞分别 >50% 和 ~60% 。激酶测定：KU-55933 的体外 IC50 为 13 nM，Ki 为 2.2 nM，并且使用一组 60 种蛋白激酶对 ATM 激酶具有高度特异性。 KU-60019 是一种改进的 ATM 激酶抑制剂，IC50 为 6.3 nM，大约是 KU-55933 的一半。 DNA-PKcs 和 ATR 的 IC50 值分别为 1.7 和 >10 μM，几乎比 ATM 高 270 倍和 1600 倍。 KU-60019 在阻断辐射诱导的人胶质瘤细胞中关键 ATM 靶点磷酸化方面的效果比 KU-55933 有效 10 倍。在人 U87 神经胶质瘤细胞中，KU-55933 在 10 μM 浓度下完全抑制 p53 (S15) 的磷酸化，但在 3 μM 浓度下则不然，而在 10 μM 浓度下照射后 1 小时，γ-H2AX 水平仅部分降低。相比之下，3 μM KU-60019 完全抑制 p53 磷酸化，1 μM 则部分抑制。细胞测定：将细胞（U87 和 U1242）暴露于 KU-60019 1、3 和 5 天。细胞生长由 AlamarBlue 测定。将 AlamarBlue 添加到培养基中至推荐的最终浓度。将板在 37°C 下孵育 1 小时，在 Fluoro-Count 读板器上测定荧光（激发波长 530 nm，发射波长 590 nm），并将值作为细胞生长的测量值。通过台盼蓝/荧光激活细胞分选（FACS）测定法测定细胞存活率。

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在人胶质瘤细胞系（U87MG、U251MG、T98G）中，KU-60019（0.5–10 μM）单独使用时抑制细胞增殖，IC50值范围为3.2–5.8 μM。与电离辐射（IR，2–8 Gy）联合使用时，它发挥放射增敏作用：4 Gy IR + 5 μM KU-60019 处理后，U87MG细胞的存活分数较单独IR组降低约70%[1]
- KU-60019 抑制胶质瘤细胞中ATM激酶活性，降低ATM磷酸化（p-ATM）及其下游底物（p-Chk2、p-p53）的水平（Western blot检测）。它还损害生存信号通路：下调胰岛素受体β（IRβ）磷酸化，抑制AKT和ERK激活（p-AKT、p-ERK水平降低）[1]
- 在胶质瘤细胞中，KU-60019（2.5–10 μM）抑制细胞迁移和侵袭：Transwell实验显示，5 μM处理后迁移能力较对照组降低约50%，侵袭能力降低约60%。它下调基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和MMP-9的表达（Western blot和酶谱法检测）[1]
- 在PTEN缺陷肿瘤细胞系（PC3、DU145、U87MG）中，KU-60019（1–5 μM）对细胞活力的抑制具有选择性（IC50 = 2.3–3.7 μM），而对PTEN正常细胞的IC50 > 10 μM。它诱导双链DNA断裂（DSBs）积累（γ-H2AX灶点增加）和G2/M期细胞周期阻滞（流式细胞仪检测）[2]
- 在PTEN缺陷细胞中，KU-60019（3 μM）增强凋亡：Annexin V-FITC/PI染色显示，凋亡率从（对照组的）约8%升高至（处理组的）约45%，这与半胱天冬酶-3激活和PARP切割相关（Western blot检测）[2]

与单独放疗、单独使用KU-60019或不治疗相比，放疗加KU-60019可显著提高小鼠在原位胶质瘤U1242/luc-GFP异种移植模型中的存活率。此外，p53突变胶质瘤对KU-60019放射增敏的反应远比野生型胶质瘤强烈。[2]

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为了研究ATM特异性抑制PTEN缺陷细胞的体内效果，我们在皮下异种移植物环境中使用了PC3 PTEN四环素诱导细胞系模型。首先，我们建立了四环素衍生物多西环素在体外（补充图4A）和体内（补充图4B）有效诱导PTEN表达。卡尺测量肿瘤体积显示，使用强力霉素诱导PTEN，导致肿瘤生长从72小时开始减慢（补充图4C）。接下来，我们研究了ATM特异性激酶抑制剂KU-60019作为单一模态在PC3-PTEN诱导模型中的选择性毒性。之所以选择这种抑制剂，是因为它是一种有效的ATM抑制剂，与KU-55933不同，它在动物系统中具有活性。尽管在pten野生型对照之前，pten缺陷对照肿瘤的大小增加了4倍，但KU-60019治疗的pten缺陷肿瘤的生长速度在统计学上显着减慢（图4A）。在KU-60019给药后（第1-5天），这种生长抑制在实验开始时（第5-12天）尤为明显。各治疗组的平均相对体重无显著变化（图4B）。采用免疫荧光法分析PTEN在切除肿瘤中的体内诱导表达[2]。

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在PTEN缺陷PC3前列腺癌皮下异种移植模型（裸鼠）中，腹腔注射KU-60019（25 mg/kg/天）持续21天，较溶媒对照组抑制肿瘤生长约65%。肿瘤组织中p-ATM、p-Chk2和γ-H2AX水平降低（免疫组织化学检测），证实ATM抑制和DSBs积累[2]
- 在U87MG胶质瘤异种移植模型（裸鼠）中，KU-60019（20 mg/kg/天，腹腔注射）与IR（4 Gy，每周一次，持续3周）联合治疗抑制肿瘤生长约80%，显著高于单独使用任一药物（单独IR组约30%，单独KU-60019组约45%）。该联合治疗还延长小鼠生存期（中位生存期从32天延长至56天）[1]

重组人ATM激酶与肽底物（源自Chk2）和ATP在激酶缓冲液中孵育。加入浓度范围为0.1 nM–10 μM的KU-60019，混合物在30°C孵育45分钟。采用时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）法检测磷酸化肽段，相对于溶媒对照组计算抑制率，通过非线性回归确定IC50值[1]
- 纯化ATM蛋白的激酶活性实验：反应混合物包含ATM、[γ-32P]ATP和组蛋白H2AX底物。加入KU-60019（0.01–50 nM），混合物在37°C孵育30分钟。加入SDS样品缓冲液终止反应，蛋白经SDS-PAGE电泳分离。放射自显影量化磷酸化H2AX的放射性，计算IC50值[2]

用AlamarBlue®检测细胞生长情况。将U1242细胞连续稀释，贴壁6 h后暴露于3 μM KU-60019中。在播种后第1、3和5天，将AlamarBlue®添加到培养基中至推荐的终浓度。在37℃下孵育1小时，在FluoroCount平板阅读器上测定荧光（激发530 nm，发射590 nm），并取其值作为细胞生长的度量[1]

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KU-60019 暴露于细胞 1、3 和 5 天。 AlamarBlue 是细胞生长的衡量标准。培养基中添加 AlamarBlue，直至达到建议的最终浓度。 Fluoro-Count 读板器（激发波长 530 nm，发射波长 590 nm）用于测量 37 °C 孵育一小时后板上的荧光。获得的值代表细胞的生长。台盼蓝/荧光激活细胞分选 (FACS) 测定用于评估细胞存活率。

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放射增敏实验：胶质瘤细胞（每孔1×104个）接种于6孔板，用KU-60019（2.5–10 μM）处理1小时后，暴露于IR（2–8 Gy）。培养14天后，结晶紫染色克隆并计数，相对于未照射的对照组细胞计算存活分数[1]
- 细胞活力和凋亡检测：PTEN缺陷/正常细胞（每孔5×103个）接种于96孔板，用KU-60019（0.1–20 μM）处理48小时。CCK-8法检测细胞活力（450 nm处吸光度）以确定IC50。凋亡检测时，细胞用Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞仪分析[2]
- 迁移和侵袭实验：胶质瘤细胞（每孔2×104个）接种于Transwell小室（未包被Matrigel用于迁移实验，包被Matrigel用于侵袭实验），上室加入含KU-60019（2.5–10 μM）的培养基。24小时（迁移）或48小时（侵袭）后，对迁移/侵袭至下室的细胞进行结晶紫染色，显微镜下计数[1]
- Western blot分析：KU-60019（1–10 μM）处理24–48小时的细胞裂解提取总蛋白。等量蛋白经SDS-PAGE电泳、转膜至PVDF膜，用抗p-ATM、ATM、p-Chk2、Chk2、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK、MMP-2、MMP-9、γ-H2AX、半胱天冬酶-3、切割型半胱天冬酶-3、PARP、切割型PARP或GAPDH（内参）抗体孵育。化学发光显影蛋白条带[1,2]
- 细胞周期分析：PTEN缺陷细胞用KU-60019（3 μM）处理24小时，70%乙醇固定，PI/RNase溶液染色，流式细胞仪分析细胞周期分布（G0/G1、S、G2/M期）[2]
- γ-H2AX灶点免疫荧光染色：PC3细胞接种于盖玻片，用KU-60019（2 μM）处理12小时，多聚甲醛固定，Triton X-100透化，用抗γ-H2AX抗体（FITC标记）和DAPI染色。共聚焦显微镜计数每个细胞的γ-H2AX灶点数（每组n ≥ 50个细胞）[2]

小鼠：雄性Fox Chase严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠植入细胞（3×10⁷）。当肿瘤体积达到100 mm³时，开始每48小时给予强力霉素，直至动物退出实验。PTEN诱导后，连续五天给予动物100 mg/kg KU-60019，并每日测量肿瘤体积，直至达到400 mm³的目标值。每三天用游标卡尺测量肿瘤体积和体重。

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PC3前列腺癌异种移植模型：将PC3细胞（5×10⁶个细胞/只）皮下注射到4周龄雄性裸鼠右侧腹部。当肿瘤体积达到约 100 mm³ 时，将小鼠随机分为对照组 (n = 6) 和 KU-60019 治疗组 (n = 6)。KU-60019 溶于 5% DMSO + 95% 生理盐水中，以 25 mg/kg 的剂量腹腔注射，每日一次，连续 21 天。每 3 天测量一次肿瘤体积（体积 = 长 × 宽² / 2），并在治疗结束后处死小鼠，用于肿瘤重量测量和免疫组织化学分析 [2]。
- U87MG 胶质瘤异种移植模型：将 U87MG 细胞（1×10⁷ 个细胞/只）皮下植入 4 周龄雄性裸鼠体内。当肿瘤体积达到约 120 mm³ 时，将小鼠分为四组（每组 n = 6）：对照组、单独 IR 组（4 Gy，每周一次静脉注射，持续 3 周）、单独使用 KU-60019 组（20 mg/kg/天，腹腔注射，持续 21 天）和联合用药组。KU-60019 溶解于含 3% DMSO 的 0.9% 生理盐水中。记录肿瘤体积和小鼠存活率，并收集肿瘤组织进行蛋白质印迹分析 [1]

体外毒性：KU-60019在浓度高达10 μM时对正常人星形胶质细胞（NHA）和前列腺上皮细胞（PrEC）显示出较低的细胞毒性（细胞存活率>80% vs. 对照组）[1,2]
- 体内急性毒性：小鼠单次腹腔注射KU-60019（最高100 mg/kg）后，7天内未出现死亡或严重毒性症状（嗜睡、体重减轻）[2]
- 体内长期毒性：小鼠接受KU-60019（20–25 mg/kg/天，腹腔注射，持续21–28天）治疗后，与对照组相比，体重、肝功能（ALT、AST）或肾功能（BUN、肌酐）均未出现显著变化。肝脏、肾脏和心脏组织的组织学检查未发现异常病变[1,2]
- 血浆蛋白结合率：KU-60019在人血浆中的血浆蛋白结合率为92%，在小鼠血浆中的血浆蛋白结合率为89%，采用平衡透析法测定[2]

[1]. Improved ATM kinase inhibitor KU-60019 radiosensitizes glioma cells, compromises insulin, AKT and ERK prosurvival signaling, and inhibits migration and invasion. Mol Cancer Ther. 2009 Oct;8(10):2894-902.

[2]. Mechanistic Rationale to Target PTEN-Deficient Tumor Cells with Inhibitors of the DNA Damage Response Kinase ATM. Cancer Res. 2015 Jun 1;75(11):2159-65.

共济失调毛细血管扩张症 (AT) 突变基因 (ATM) 对细胞周期检查点和 DNA 修复至关重要。因此，靶向 ATM 的特异性小分子抑制剂或许可以开发成高效的放射增敏剂。最近，一种 ATM 激酶特异性抑制剂 KU-55933 被证实能够增强人类癌细胞的放射敏感性。本文报道了一种 KU-55933 的改良类似物 (KU-60019)，其 Ki 和 IC50 值仅为 KU-55933 的一半。KU-60019 阻断辐射诱导的人类胶质瘤细胞中关键 ATM 靶点磷酸化的能力是 KU-55933 的 10 倍。正如预期的那样，KU-60019 是一种高效的人类胶质瘤细胞放射增敏剂。AT 成纤维细胞不受 KU-60019 的放射增敏作用，这强烈表明 ATM 激酶是其特异性靶点。此外，KU-60019降低了AKT S473位点的基础磷酸化水平，提示ATM激酶可能调控一种作用于AKT的蛋白磷酸酶。与此发现一致，低浓度的磷酸酶抑制剂冈田酸可拮抗KU-60019对AKT磷酸化的影响，并且AT细胞在辐射和胰岛素刺激下S473位点AKT磷酸化受损，对KU-60019无反应。我们还发现KU-60019在体外抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭，提示胶质瘤的生长和迁移可能受ATM通过AKT调控。MEK和AKT抑制剂并未进一步增强KU-60019处理的细胞的放射敏感性，这支持了KU-60019干扰促生存信号通路而非其放射增敏作用的观点。总而言之，KU-60019抑制DNA损伤反应，降低AKT磷酸化和促生存信号传导，抑制细胞迁移和侵袭，并有效增强人胶质瘤细胞的放射敏感性。[1]

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共济失调毛细血管扩张症突变基因（ATM）是DNA损伤反应（DDR）中的重要信号分子。ATM功能缺失可与FA/BRCA通路组分中的肿瘤相关突变联合产生合成致死表型。在本研究中，我们采用siRNA筛选策略，鉴定其他肿瘤抑制因子，这些因子在被抑制后也能以类似的方式增强细胞对ATM抑制剂的敏感性。通过这种方法，我们发现PTEN和ATM在联合抑制时具有合成致死性。PTEN缺陷细胞表现出活性氧水平升高、内源性DNA损伤增加以及ATM持续激活。与野生型细胞相比，ATM抑制剂在PTEN缺陷细胞中特异性地导致灾难性的DNA损伤、有丝分裂细胞周期阻滞和细胞凋亡。抗氧化剂可消除PTEN缺陷细胞中DNA损伤的增加和ATM的激活，表明氧化性DNA损伤是细胞死亡机制的必要条件。最后，ATM抑制剂KU-60019对肿瘤异种移植模型中的PTEN突变癌细胞具有特异性毒性，并且可通过重新引入野生型PTEN来逆转。我们的研究结果共同为在 PTEN 缺陷型肿瘤中对 ATM 抑制剂进行临床评估提供了机制上的合理性。[2]

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KU-60019 是第一代 ATM 抑制剂 KU-55933 的改良类似物，具有更高的效力（更低的 IC50）和更好的药代动力学特性。[1]
- 其作用机制涉及与 ATM 的 ATP 结合口袋结合，抑制 ATM 介导的 DNA 损伤修复。这会导致癌细胞中DNA双链断裂（DSB）积累、细胞周期阻滞和凋亡，尤其是PTEN缺陷的癌细胞（依赖ATM存活）[2]
- 在胶质瘤细胞中，KU-60019发挥多种抗癌作用：放射增敏、抑制促生存的AKT/ERK信号通路以及抑制细胞迁移/侵袭，使其成为胶质瘤（通常对放射线耐药）的潜在治疗药物[1]
- KU-60019对ATM的选择性高于其他PIKK（ATR、DNA-PKcs），从而减少脱靶效应并提高安全性[1,2]

C30H33N3O5S

547.67

547.214

925701-49-1

15953870

Light yellow to khaki solid powder

1.3±0.1 g/cm3

786.6±60.0 °C at 760 mmHg

429.5±32.9 °C

0.0±2.7 mmHg at 25°C

1.645

5.9

109.55

1

8

5

39

972

2

C[C@@H]1CN(C[C@@H](O1)C)CC(=O)NC2=CC3=C(C=C2)SC4=C(C3)C=CC=C4C5=CC(=O)C=C(O5)N6CCOCC6

SCELLOWTHJGVIC-BGYRXZFFSA-N

InChI=1S/C30H33N3O5S/c1-19-16-32(17-20(2)37-19)18-28(35)31-23-6-7-27-22(13-23)12-21-4-3-5-25(30(21)39-27)26-14-24(34)15-29(38-26)33-8-10-36-11-9-33/h3-7,13-15,19-20H,8-12,16-18H2,1-2H3,(H,31,35)/t19-,20+

2-[(2S,6R)-2,6-dimethylmorpholin-4-yl]-N-[5-(6-morpholin-4-yl-4-oxopyran-2-yl)-9H-thioxanthen-2-yl]acetamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)