Lificiguat (YC 1)   中文名称: 利非西呱,YC-1

sGC ( Kd = 0.6-1.1 μM ); Hypoxia-inducible factor-1alpha (HIF-1alpha/HIF-1α)

可溶性鸟苷酸环化酶 (sGC) 是一种异二聚体血红素蛋白，也是主要的 NO 受体。 Liificiguat (YC-1) 靠近或直接结合到 β 亚基的含血红素结构域。在没有 CO 的情况下，Lificiguat (YC-1) 的结合 Kd=9-21 μM，具体取决于构建体。当存在 CO 时，这些值会降低至 0.6-1.1 μM。正如预期的那样，Lificiguat (YC-1) 大大增强了 CO 与异二聚体 sGC 的结合 (Kd=1 μM)。在没有 NO 的情况下，Lificiguat (YC-1) 可刺激 sGC 两到四倍，但与 CO 或 NO 协同作用可实现数百倍的激活。 Lificiguat(YC-1) 的结合也可以克服 sGC 的抑制性磷酸化[1]。 Lificiguat (YC-1) 是一种可溶性鸟苷酸环化酶 (sGC) 激活剂。 HCC 细胞系 HepG2、BEL-7402 和 HCCLM3 与索拉非尼和/或 Lificiguat (YC-1) 一起孵育 72 小时。索拉非尼或 Lificiguat (YC-1) 单独以剂量依赖性方式抑制 HCC 细胞增殖。此外，Sorafenib 和 Lificiguat (YC-1) 的组合以剂量依赖性方式显着抑制 HCC 细胞的增殖。此外，在索拉非尼和 Lificiguat (YC-1) 的 ED50 剂量下，HepG2 中的组合指数值 (CI)=0.93，BEL-7402 中为 0.95，HCCLM3 中为 0.72，表明索拉非尼和 Lificiguat (YC-1)协同抑制HCC细胞增殖[2]。

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YC-1[3-（5'-羟甲基-2'呋喃基）-1-苄基吲唑]是可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）的变构激活剂。YC-1提高了酶的催化速率，并使酶对其气态活化剂一氧化氮或一氧化碳敏感。在其他研究中，对实验动物施用YC-1导致富血小板血栓形成的抑制和平均动脉压的降低，这与cGMP水平的升高有关。然而，YC-1与sGC相互作用和酶激活的细节尚不完整。尽管文献中的证据表明YC-1对sGC的激活严格依赖于血红素，但本报告提供了YC-1对sGC的血红素依赖性和血红素非依赖性激活的证据。1H-（1,2,4）恶二唑（4,3-a）喹喔啉-1-酮对sGC血红素的氧化完全抑制了对NO的反应，但仅部分减弱了YC-1的激活。我们还观察到YC-1激活了缺乏血红素的突变体sGC。这些发现表明，sGC的YC-1激活可以独立于血红素发生，但当血红素部分存在于酶中时，激活会大大增加。[1]

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含有铁血红素的sGC被YC-1激活。[1]
接下来，我们研究了非还原条件下ODQ依赖性氧化对sGC活性的影响。正如预期的那样，基础sGC活性不受ODQ的影响（图2，虚线），而sGC的NO依赖性激活则受到ODQ的浓度依赖性抑制（图2）。然而，ODQ处理仅部分减弱了YC-1依赖性sGC的激活，并在约1-3μM ODQ处达到稳定状态。即使在10μM ODQ的浓度下，sGC酶仍被100μM YC-1激活，尽管只有未处理水平的30-40%（图2，实线）。光谱研究和对NO的无反应表明，在10μM ODQ下，sGC血红素被氧化了90%以上。ODQ对NO和YC-1刺激的sGC的抑制作用差异表明，sGC的YC-1激活有两个组成部分。一种成分是血红素依赖性的，而另一种成分则是血红素非依赖性的。

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血红素缺乏突变体His-105→ Cys由YC-1激活。[1]
为了证实YC-1激活仅部分取决于血红素辅基的结论，我们产生了一种血红素缺乏的sGC酶。我们将β亚基的血红素配位His-105替换为半胱氨酸残基，并将该突变β亚基与六组氨酸标记的α亚基共表达。正如预期的那样，纯化的α1β1Cys-105酶缺乏血红素，在431 nm处缺乏特征性的Soret带（图3）。突变酶未被SNP激活（图4B），而野生型酶在NO处理后cGMP产量显著增加（图4A）。YC-1对突变酶的影响分析表明，用100μM YC-1处理导致α1β1Cys-105酶活化3倍（图4B）。相比之下，野生型酶在类似条件下显示出7倍的活化（图4A）。α1β1Cys-105酶的YC-1激活支持了我们的结论，即YC-1结合和sGC激活可以在没有血红素基团的情况下发生。然而，血红素缺陷突变酶的激活量约为野生型含血红素酶的30%。添加SNP后，突变酶的YC-1激活没有增强（图4B），这支持了血红素缺乏的证据。

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YC-1对HIF-1介导的缺氧诱导基因表达的影响 以前，我们发现YC-1治疗抑制缺氧条件下培养的Hep3B细胞中HIF-1α蛋白的表达，降低促红细胞生成素和VEGF的mRNA水平。为了研究YC-1对HIF-1介导的缺氧反应的抑制作用，在缺氧条件下用YC-1处理Hep3B细胞。在这些条件下培养4小时而没有YC-1的细胞中，HIF-1α蛋白水平升高，但在用YC-1培养的细胞中呈剂量依赖性降低（图1，a）。在用YC-1培养16小时的细胞中，几个HIF-1调节基因（VEGF、醛缩酶A和烯醇化酶1）的表达呈剂量依赖性下降，而β-actin mRNA的表达不受影响（图1，B）。在用YC-1培养的细胞中，HIF-1αmRNA水平也相对不变，这表明YC-1介导的HIF-1α蛋白表达的减少发生在转录后水平。

为了评估VEGF mRNA水平的降低是否影响分泌到培养基中的VEGF蛋白水平，我们在Hep3B细胞条件培养基中测量了VEGF蛋白水平。24小时后，在缺氧条件下培养的细胞培养基中的VEGF蛋白水平（平均值=1208 pg/mL，95%置信区间=1112至1304 pg/mL；与常氧条件相比，P<0.001）是常氧条件下培养细胞培养基的两倍多（平均值=559 pg/mL、95%置信区间=392至726 pg/mL）（图1，C）。与缺氧条件下生长的未经处理的细胞培养基中的VEGF蛋白水平相比，用YC-1培养的细胞培养的培养基中VEGF蛋白水平呈剂量依赖性降低（P<0.001）（图1，C）。

接下来，我们通过评估缺氧条件下培养的其他肿瘤细胞系（NCI-H87、SiHa、SK-N-MC和Caki-1）在YC-1存在或不存在的情况下HIF-1α蛋白和VEGF mRNA的表达，研究了YC-1的作用是否仅限于Hep3B细胞。在缺氧条件下，在没有YC-1的情况下，所有细胞系都诱导了HIF-1α蛋白和VEGF mRNA的表达（图2）。在YC-1存在的缺氧条件下培养的细胞中，HIF-1α蛋白和VEGF mRNA的水平呈剂量依赖性降低（图2）。这些结果证实，无论肿瘤细胞类型如何，YC-1都能抑制HIF-1介导的缺氧诱导基因的诱导。

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体外用YC-1孵育的脾淋巴细胞对NK细胞敏感的YAC-1细胞具有细胞溶解活性，与没有YC-1孵育的脾脏淋巴细胞的细胞溶解活性相当（图7，A）。此外，用YC-1治疗2周的小鼠脾淋巴细胞具有与赋形剂治疗小鼠相当的细胞溶解活性[2]。

Lificiguat (YC-1)（30 或 60 mg/kg，腹腔注射）以剂量依赖性方式抑制 MDA-MB-468 肿瘤生长。还研究了 Lificiguat (YC-1) 的前药制剂 YC-1-S 在 MDA-MB-468 荷瘤小鼠中的作用。体内药代动力学分析表明，YC-1-S 很快转化为其活性形式。小鼠以 20、40 或 80 mg/kg YC-1-S po 给药，YC-1-S 还表现出对 MDA-MB468 肿瘤生长的剂量依赖性抑制。 Lificiguat (YC-1) 和 YC-1-S 均可剂量依赖性地降低肿瘤重量。此外，与载体治疗组相比，小鼠的平均体重不受 Liificiguat (YC-1) 或 YC-1-S 的影响[3]。 Liificiguat (YC-1) 是一种有效的 NO-GC 激活剂，据报道在莫里斯水迷宫 (MWM) 和回避测试中可以改善啮齿动物的学习行为。 Lificiguat (YC-1) 通过 NO-cGMP-PKG 依赖性途径增强海马 Schafer 侧支 CA1 突触的长时程增强 (LTP)，并增强杏仁核中的 LTP 诱导，增加 ERK 的激活，并增强脑源性神经营养因子（BDNF）cAMP反应元件结合蛋白（CREB）对恐惧记忆测试的反应[4]。

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YC-1对体内肿瘤生长的影响[2]
由于观察到YC-1的体外作用，我们研究了YC-1是否通过抑制HIF-1的活性来抑制实体瘤中的血管生成，以及YC-1是否在体内抑制肿瘤生长。每天用YC-1治疗注射有人肿瘤细胞的小鼠2周。YC-1治疗的小鼠的肿瘤明显小于赋形剂治疗的小鼠（图3，A）。测量肿瘤大小的变化，并将其绘制为平均肿瘤大小与时间的关系图（图3，B）。在注射肿瘤细胞后的第二天，用YC-1治疗的小鼠肿瘤生长最小（实验的最后一天：平均值=422 mm3，95%CI=283至561 mm3；与赋形剂治疗组相比，P<.001，平均值=1082 mm3，95%CI=880至1284 mm3），在肿瘤形成后，用YC.1治疗的小鼠的肿瘤生长停止（平均值=126 mm3，95%CI=97至155 mm3；相对于赋形剂治疗组，P<.01）。用YC-1治疗的小鼠的NCI-H87（图3，C）、SiHa（图3、D）、SK-N-MC（图3和E）和Caki-1（图3）异种移植物肿瘤在统计学上也明显小于用载体治疗的小鼠（所有比较均P<0.01）。这些结果表明，YC-1有效地抑制了荷瘤小鼠的肿瘤生长。

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YC-1对血管生成、HIF-1α蛋白和VEGF表达的影响[2]
为了确定YC-1抑制肿瘤生长的机制，我们对Hep3B肿瘤进行了形态学和生化检查。经载体处理的小鼠的H&E染色肿瘤切片显示，血管发育良好，含有红细胞和几个有丝分裂象（图4，A）。相比之下，YC-1治疗小鼠的肿瘤切片显示，腺泡形成频繁，血管不发达（图4，A）。

为了确定YC-1对肿瘤生长的抑制作用是否与抑制肿瘤血管生成有关，我们检查了内皮标志物CD31的分布。在经YC-1处理的小鼠的肿瘤切片中，很少观察到CD31免疫阳性血管，而在经载体处理的小鼠肿瘤切片中观察到许多血管（图4，B）。

由于HIF-1在血管生成中很重要，我们接下来评估了载体和YC-1治疗小鼠肿瘤切片中HIF-1α的表达（图4，C）。来自载体治疗小鼠的Hep3B肿瘤在细胞核和核周区域都显示出HIF-1α蛋白，但仅在远离血管的相对缺氧区域（图4，C）。相比之下，YC-1治疗小鼠的肿瘤切片显示没有HIF-1α免疫反应细胞（图4，C）。

我们量化了载体和YC-1治疗小鼠肿瘤切片中HIF-1α阳性细胞和CD31阳性血管的数量（图5）。无论肿瘤细胞来源如何，用YC-1治疗2周的小鼠HIF-1α蛋白表达和血管形成在统计学上均显著低于赋形剂治疗的小鼠（所有比较均P<0.01）（图5）。

我们还测量了用H&E染色的Hep3B肿瘤切片的坏死程度。在载体处理的小鼠肿瘤（检查了40处病变；平均值=16.3%，95%置信区间=12.2%至20.4%）和YC-1处理的小鼠的肿瘤（检查6处病变；平均值=18.3%，95%置信范围=10.2%至26.4%；P=0.17）之间，坏死百分比没有统计学上的显著差异。同样，对于其他肿瘤类型，载体和YC-1治疗的小鼠肿瘤坏死程度的差异没有统计学意义（数据未显示）。

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YC-1对NK细胞功能的影响 为了证实YC-1对Hep3B肿瘤中HIF-1α表达的影响，我们通过免疫沉淀和免疫印迹分离了HIF-1α蛋白。通过免疫沉淀在用抗HIF-1α抗体孵育的肿瘤裂解物中检测到HIF-1α，但在用免疫前血清孵育的那些裂解物中没有检测到（数据未显示）。在YC-1治疗的肿瘤中，HIF-1α蛋白表达水平明显低于载体治疗的肿瘤（图6，A）。此外，YC-1治疗的肿瘤中VEGF蛋白和mRNA以及醛缩酶和烯醇化酶mRNA的水平也低于载体治疗的肿瘤（图6，A和B）。VEGF、醛缩酶和烯醇化酶表达的降低可能反过来解释了YC-1治疗的肿瘤中观察到的血管生成受阻和生长迟缓。

PDGF是另一种血管活性因子，与VEGF一样，促进实体瘤的血管生成和生长。PDGF储存在血小板的α颗粒中，其分泌受到血小板聚集的刺激。由于YC-1抑制血小板聚集，因此YC-1的一些抗血管生成作用可能是由肿瘤中PDGF水平的降低介导的，尽管这种作用以前没有报道过。因此，为了测试YC-1抑制PDGF诱导的肿瘤血管生成的可能性，我们检测了Hep3B肿瘤中PDGF-A和PDGF-B蛋白的水平（图6，A）。在载体和YC-1治疗的小鼠的肿瘤中没有观察到PDGF-A或PDGF-B水平的实质性差异。这一结果表明，YC-1的抗血小板聚集作用似乎不会影响肿瘤生长。

为了检查体内浸润肿瘤的NK细胞数量是否存在差异，我们通过用抗asialo GM1抗体进行免疫染色来量化肿瘤切片中NK细胞的数量（补充图1，可在http://jncicancerspectrum.oupjournals.org/jnci/content/vol95/issue7/index.shtml).在载体和YC-1治疗的小鼠的Hep3B肿瘤切片中观察到NK细胞，尽管数量差异没有统计学意义（载体治疗的肿瘤[n=6]，平均值=8.8/mm2，95%CI=6.9至10.7/mm2；YC-1治疗的肿瘤[n=6]，平均数=8.4/mm2，95%CI=5.8~11.0/mm2，P=0.7）。这些结果表明，YC-1对NK细胞功能没有影响。

在将饱和溶液中的 CO 滴定到 sGC 蛋白中的同时，监测 CO 结合的 Soret 吸收带的出现，以确定 CO 解离常数。将过量的连二亚硫酸盐添加到已清除 Ar 的缓冲液中，以制备 Ms sGC β₁(1-380) 和 Bt sGC β₁(1-197) 样品。使用带有改进样品架的 Cary 50 分光光度计，在 10 cm 光程比色皿中对 Ms sGC-β₁(1-380) 和 Ms sGC-NT21 进行 CO 结合实验。 SigmaPlot 中的单位点饱和配体结合模型用于绘制存在和不存在 50 μM Liificiguat (YC-1) 的情况下的结合数据。

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sGC活性测定。[1]
sGC活性通过[32P]GTP形成[32P]cGMP来测量，如所述。100μl的反应体积含有50 mM TEA（pH 7.4）、1 mM EGTA、10 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1 mg/ml BSA、200μM GTP、磷酸肌酸、磷酸肌酸激酶、3 mM MgCl2、1 mM cGMP和≈1–2×105 cpm[32P]GTP。sGC酶（每次测定0.5μg）用于测量基础活性，0.1μg用于硝普钠（SNP）或YC-1刺激。必要时，加入终浓度为1mM的DTT。酶被SNP（100μM）或YC-1（100μM）激活，或被指定浓度的ODQ抑制。在DMSO中制备YC-1和ODQ储备溶液，但反应混合物中的DMSO浓度不超过0.1%。

测量细胞增殖的测定使用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)。简而言之，将3×10³/孔的细胞在96孔板中培养，孵育24小时，然后用Lificiguat (YC-1)或索拉非尼处理。每个孔在 72 小时处理后添加 CCK-8 试剂。 37°C 孵育 2.5 小时后，使用自动 ELISA 酶标仪在 450 nm 处测量吸光度。利用Microsoft Excel软件，测量由化合物组合产生的任何协同效应，以计算组合指数值(CI>1：拮抗效应，CI=1：相加效应，CT<1：协同效应)。

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条件培养基和VEGF酶联免疫吸附试验[2]
将Hep3B细胞以1×105个细胞/孔的密度铺在添加了10%热灭活FBS的α修饰Eagle培养基中的六孔板中，并孵育过夜。细胞用YC-1（0.01-10μM）或载体（DMSO）处理5分钟，然后在常氧或缺氧条件下处理24小时。根据制造商推荐的方案，使用Quantikine人VEGF免疫测定试剂盒（明尼苏达州明尼阿波利斯市R&D Systems）定量条件培养基中的VEGF水平。通过与检测试剂盒中包含的一系列VEGF标准样品进行比较来定量VEGF浓度。

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NK细胞活性[2]
使用12只裸鼠的脾淋巴细胞，在体外和体内测定YC-1对NK细胞活性的影响。通过使用柱塞将组织穿过钢网，将单个脾脏在PBS中均质化，并在室温下以400g的Ficoll-Paque（Amersham Biosciences）梯度离心30分钟，以分离淋巴细胞群。去除淋巴细胞并在PBS中洗涤三次。使用4小时51Cr释放试验评估总淋巴细胞群中的NK细胞活性，其中NK敏感的YAC-1细胞作为靶细胞群。如所述，在含有5%CO2的加湿气氛中，在37°C下用0.25 mCi/mL的铬酸钠（Na251CrO4）标记YAC-1细胞1.5小时。

为了检查YC-1对NK细胞活性的体外影响，将脾淋巴细胞（6.25×104至5×105）与YC-1（0.1-10μM）或DMSO一起孵育24小时，然后在37°C的96孔圆底板中，在含有5%CO2的加湿气氛中，以指定的效应器：靶细胞比与1×104 51Cr标记的YAC-1细胞一起孵育。4小时后，将平板在4°C下以200g离心10分钟，取出100-μL培养基样品，在γ计数器中计数1分钟。在每个实验中都使用了从一只小鼠身上提取的脾淋巴细胞。每次测定重复三次，平均值是一次实验的结果。结果表示为四个单独实验的平均值和95%置信区间（CI）的平均值。

为了检查YC-1对NK细胞活性的体内影响，小鼠每天接受DMSO（n=4）或YC-1（30μg/g；n=4）的腹腔注射，持续2周。从每只小鼠中分离脾脏淋巴细胞，并立即检测NK细胞活性。YAC-1细胞自发释放的51Cr通常低于总51Cr负载量的10%。NK细胞活性计算如下：（实验释放量减去自发释放量）/（总释放量减去自发性释放量）×100。每次测定重复三次，平均值是一次实验的结果。结果表示为四个单独实验的平均值和95%置信区间。

将YC-1以120mg/mL的储备浓度重新悬浮在二甲亚砜（DMSO）中，并储存在-30°C下。

小鼠：本研究使用的裸鼠（nu/nu）为58只4周龄雌性小鼠。将MDA-MB-468乳腺癌细胞（5×10⁶个细胞/只）悬浮于0.1 mL Matrigel溶液（50% v/v Matrigel溶于PBS）中，接种于裸鼠乳腺脂肪垫。待肿瘤体积达到100 mm³后，将荷瘤小鼠随机分为各治疗组。各组分别接受不同剂量的Lificiguat（YC-1）/YC-1-S治疗。小鼠接受YC-1注射（30或60 mg/kg）或YC-1-S口服给药。肿瘤体积（mm³）的计算公式为：长×宽²×0.5。每隔三天测量一次肿瘤大小和小鼠体重。实验结束后，取出肿瘤结节并称重，然后将小鼠处死。采用蛋白质印迹法检测肿瘤样本。
大鼠：使用4月龄（200-250克）和24月龄（550-600克）的雄性Wistar白化大鼠。使用前，配制利吉呱（YC-1），并以每100克体重0.1毫升的剂量腹腔注射（ip）。连续两周，每只大鼠每天接受1毫克/公斤体重的利吉呱（YC-1）。4月龄和24月龄的大鼠（每组n=10）接受DMSO处理。所有结果均经过测量，剂量选择旨在验证所选剂量对运动活性的影响。

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人类肿瘤异种移植[2]
使用雄性裸鼠（BALB/cAnNCrj–nu/nu）。80只7-8周龄的小鼠被注射肿瘤细胞用于异种移植实验。其中69只荷瘤小鼠用于实验；其余11只小鼠因注射技术问题或肿瘤未生长而被排除。将5 × 10⁶个活的Hep3B细胞皮下注射到69只荷瘤小鼠中的25只小鼠的侧腹部。随后立即将小鼠随机分为三组。第一组（n = 12）为对照组，注射溶剂（DMSO）。第二组（n = 7）在注射Hep3B细胞后的第二天开始，每天腹腔注射YC-1（30 μg/g），持续2周。第三组（n = 6）在Hep3B肿瘤体积达到100–150 mm³（约40天后）后，每天腹腔注射YC-1（30 μg/g），持续2周。
将NCI-H87、SiHa、SK-N-MC或Caki-1肿瘤细胞（5 × 10⁶）皮下注射到另外44只小鼠的侧腹部。每组小鼠中分别有13、10、10和11只出现肿瘤。每组中荷瘤小鼠被随机分配到对照组或实验组。当肿瘤体积达到约 100–150 mm³ 时，实验组小鼠每日腹腔注射 YC-1（30 μg/g），持续 2 周。对照组小鼠每日腹腔注射 DMSO。

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肿瘤组织学及 HIF-1α、CD31 和 Asialo GM1 的免疫组织化学分析 [2]
在最后一次注射 YC-1 或载体后的第二天，处死小鼠并取出肿瘤。肿瘤组织用福尔马林固定，石蜡包埋。从每个石蜡块中切取连续切片（厚度 6 μm）。取一张切片进行苏木精-伊红 (H&E) 染色，用于组织学评估。其他切片分别进行HIF-1α、内皮细胞标志物CD31或NK细胞标志物asialo GM1的免疫化学染色。切片经脱蜡、梯度酒精复水后，在10 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中微波加热5分钟以进行抗原修复。用含2.5%牛血清白蛋白和2%正常山羊血清的PBS溶液（pH 7.4）封闭非特异性位点1小时，然后将切片与兔抗CD31多克隆抗体（用封闭液1:100稀释）、兔抗asialo GM1多克隆抗体（用封闭液1:100稀释）或大鼠抗HIF-1α抗体（用封闭液1:100稀释）于4℃孵育过夜，具体方法如前所述。阴性对照切片在不含任何一抗的情况下，用稀释液（封闭液）孵育。随后，切片经洗涤后，与相应的生物素标记二抗孵育，并使用亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物定位结合的抗体，以二氨基联苯胺作为最终显色剂。所有免疫染色切片均用苏木精进行轻度复染。

[1]. Proc Natl Acad Sci U S A . 2001 Nov 6;98(23):12938-42.

[2]. J Natl Cancer Inst . 2003 Apr 2;95(7):516-25.

利菲西呱/YC-1 属于吲唑类化合物，其结构为1H-吲唑，1位被苄基取代，3位被5-(羟甲基)-2-呋喃基取代。它是一种可溶性鸟苷酸环化酶激活剂，并能抑制血小板聚集。利菲西呱具有抗肿瘤、可溶性鸟苷酸环化酶激活、细胞凋亡诱导、血小板聚集抑制和血管扩张等多种药理作用。它属于吲唑类、呋喃类和芳香伯醇类化合物。我们的数据表明，血红素部分对于YC-1依赖的sGC激活至关重要，但并非必需。先前对YC-1与CO-sGC结合后拉曼光谱变化的研究表明，YC-1结合于sGC血红素结合区域附近。 ODQ对YC-1活化的部分抑制可能表明YC-1存在多个结合位点，并且至少其中一个位点受到血红素氧化的影响，进而导致血红素口袋构象的改变。然而，也有一些证据表明YC-1结合位点并非只有一个。最近，一种新的变构化合物BAY41-2272被报道，它以类似于YC-1的方式影响sGC的活性。该化合物本身即可刺激sGC，且不改变其Soret带特征，并以类似于YC-1的方式增强CO和NO的作用。此外，YC-1和BAY41-2272在结构上也存在一些相似之处（图5，方框所示）。 ODQ对血红素的氧化作用显著抑制了1 μM BAY 41–2272对sGC的激活，但在更高浓度的BAY 41–2272（100 μM；参考文献23）下观察到sGC活性增加。这些数据证实了我们的发现。BAY 41–2272的交联衍生物仅标记了sGC α亚基上两个位置相邻的残基238和245，表明BAY 41–2272只有一个结合位点。ODQ氧化的sGC或突变体无血红素sGC对YC-1的反应性得以保留，表明血红素部分或血红素结合口袋在sGC与YC-1的相互作用中起着重要的作用，但并非不可或缺。 YC-1的结合可能由血红素的原卟啉部分或稳定血红素在其口袋中的疏水残基促进。YC-1与血红素口袋的相互作用可能是sGC对一氧化氮和一氧化碳敏感化的原因，并解释了这些气态激活剂解离常数的变化。血红素铁的氧化以及血红素附近电荷的相应变化，或血红素基团的完全去除，都会导致血红素口袋的结构发生一些变化。这些变化会降低sGC与YC-1的亲和力，但不会完全破坏sGC/YC-1的相互作用。可以推测，至少存在一个不受血红素口袋变化影响的额外接触区域。α亚基的Cys-238和-245残基（已被鉴定为与BAY41-2272相互作用的残基）可能属于此类区域。对α亚基中这些残基及其附近残基进行诱变可以验证这一假设。[1]

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背景：缺氧诱导因子1α (HIF-1α) 是HIF-1的组成部分，在人类肿瘤中表达，使细胞能够在缺氧（低氧）条件下存活和生长。YC-1，即3-(5'-羟甲基-2'-呋喃基)-1-苄基吲唑，是一种用于治疗循环系统疾病的药物，可抑制血小板聚集和血管收缩，并在体外抑制HIF-1活性。我们测试了YC-1是否在体内抑制HIF-1和肿瘤生长。
方法：将Hep3B肝癌细胞、NCI-H87胃癌细胞、Caki-1肾癌细胞、SiHa宫颈癌细胞和SK-N-MC神经母细胞瘤细胞作为异种移植瘤接种到免疫缺陷小鼠体内（共69只小鼠）。当肿瘤体积达到 100-150 mm³ 时，小鼠每天腹腔注射载体或 YC-1（30 μg/g），持续 2 周。采用免疫组织化学法评估肿瘤中 HIF-1α 蛋白水平和血管生成情况，并采用逆转录-聚合酶链式反应 (RT-PCR) 检测 HIF-1 诱导基因（血管内皮生长因子、醛缩酶和烯醇化酶）的表达。所有统计检验均为双侧检验。[2] 总之，我们检测了 YC-1 是否能够靶向 HIF-1 并抑制体内肿瘤血管生成。我们证实了 YC-1 对缺氧培养的癌细胞中 HIF-1α 表达以及 VEGF、醛缩酶 A 和烯醇化酶 1 诱导的抑制作用。体内实验表明，YC-1治疗可抑制源自Hep3B、Caki-1、NCI-H87、SiHa和SK-N-MC细胞的异种移植瘤的生长。与载体对照组相比，YC-1治疗组小鼠的肿瘤血管数量较少，HIF-1α蛋白及其调控基因的表达水平也较低。这些结果表明，YC-1是一种HIF-1抑制剂，它通过阻断肿瘤血管生成和抑制肿瘤对缺氧的适应来抑制肿瘤生长。[2]

C19H16N2O2

304.34

304.121

C, 74.98; H, 5.30; N, 9.20; O, 10.51

170632-47-0

170632-47-0

5712

White solid powder

1.2±0.1 g/cm3

522.2±50.0 °C at 760 mmHg

269.6±30.1 °C

0.0±1.4 mmHg at 25°C

1.653

3.55

51.19

1

3

4

23

386

0

O1C(C([H])([H])O[H])=C([H])C([H])=C1C1C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C2N(C([H])([H])C2C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=2[H])N=1

OQQVFCKUDYMWGV-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H16N2O2/c22-13-15-10-11-18(23-15)19-16-8-4-5-9-17(16)21(20-19)12-14-6-2-1-3-7-14/h1-11,22H,12-13H2

[5-(1-benzylindazol-3-yl)furan-2-yl]methanol

Lificiguat; YC1; YC 1; yc-1; Lificiguat; 170632-47-0; (5-(1-benzyl-1H-indazol-3-yl)furan-2-yl)methanol; 3-(5'-Hydroxymethyl-2'-furyl)-1-benzylindazole; 154453-18-6; Lificiguat [INN]; YC-1

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~61 mg/mL (~200.43 mM)
Ethanol: ~31 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.21 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (8.21 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (8.21 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。