Lixivaptan   中文名称: 利昔伐坦

human V2 receptor ( IC50 = 1.2 nM ); rat V2 receptor ( IC50 = 2.3 nM )

Lixivaptan 在 V2 吸收上表现出竞争性的拮抗剂活性[1]。

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血管加压素V2受体（V2R）拮抗剂是新一代利尿剂。与传统利尿剂相比，当血浆抗利尿素浓度高于任何给定血浆渗透压时，vaptans可促进体内保留水分的排泄。在这种情况下，水溶药物比传统的利尿剂更可取。vaptans的临床疗效原则上是由于抗利尿激素调节的水通道AQP2 （aquaporin-2）的水重吸收受损。本研究在表达AQP2 （MCD4）和人V2R的小鼠肾集管细胞中研究了Lixivaptan/利西伐坦-一种新型选择性V2R拮抗剂对加压素- camp /PKA信号级联的影响。与tolvaptan（一种用于治疗临床显著高容性和低容性低钠血症的选择性V2R拮抗剂）相比，Lixivaptan被预测更不容易引起肝损伤。在MCD4细胞中，临床相关浓度Lixivaptan(100 nM, 1 h)可阻止ddavp诱导的胞浆cAMP水平升高和AQP2 ser-256磷酸化。与这一发现一致的是，实时荧光动力学测量表明，Lixivaptan阻止了ddavp诱导的渗透透水性增加。这些数据首次详细证明了AQP2阻断在利西瓦坦的疏水作用中的核心作用，并表明利西瓦坦有可能成为一种安全有效的治疗以血浆加压素高浓度和水潴留为特征的疾病的药物。[3]

在有意识的狗中，用 30 mL/kg (po) 和精氨酸加压素 (AVP) 处理的水 (0.4 μg/kg 在油中，皮下注射) lixivaptan (1、3 和 10 mg/kg po) )相对于AVP处理的载体组增加Uvol，分别增加了438、1018和1133%，而Uosm从1222 mOsm/kg(载水和AVP处理的载体)降低分别为307、221和175 mOsm/kg。缺乏 AVP 的纯合子 Brattleboro 中，lixivaptan 以 10 mg/kg po（即，产生 V2 多重抗剂活性的剂量的 10 倍） bid 持续 5 天，显示出持续的多重抗剂作用而没有激动剂作用的证据在随机双盲梯度对照递增单剂量研究中，患者(制剂前一夜禁食)小鼠30、75或150 mg lixivaptan。所有这些增加剂量都会增加尿流量和血清钠浓度，并产生显着的剂量相关性尿渗透压降低[1]。在其充血性心力衰竭、肝肿瘤腹水或抗利尿代谢不当综合征的患者中进行的II期临床试验表明，lixivaptan增加水清除率而不是影响肾钠排泄或激活神经激素系统[2]。

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常染色体显性多囊肾病（ADPKD）是由PKD1或PKD2基因突变引起的，其特征是囊肿的发育和生长导致进行性肾脏增大。静息时胞质钙的减少和与加压素的强补作用相关的cAMP水平的升高是ADPKD的两个主要生化缺陷。本研究表明，在两种人类PKD动物模型中，使用新型V2R拮抗剂利西伐坦联合拟钙化剂R-568，共同靶向抗利尿素V2受体（V2R）和钙敏感受体这两种gpcr，可减少囊肿的进展。根据计算模型结果和初步临床证据，与托尔伐坦相比，利西伐坦预计具有更安全的肝脏特征，托尔伐坦是唯一被批准延缓PKD进展的药物。PCK大鼠和Pkd1RC/RC小鼠同窝同伴分别单独或联合饲喂Lixivaptan（0.5%）和R-568（大鼠0.025%，小鼠0.04%），连续7周或13周。在PCK大鼠中，与未治疗的动物相比，联合治疗显著减少了肾脏重量、囊肿和纤维化体积，分别减少了20%、49%和73%。在Pkd1RC/RC小鼠中，相同的参数分别减少了20%、56%和69%。在这两种情况下，联合治疗在名义上似乎比单独使用药物更有效。这些数据指出了两种现有药物在PKD治疗中的有趣新应用。这些动物实验表明，这两种化合物之间的潜在协同作用，如果在适当的临床研究中得到证实，将代表着ADPKD治疗的一个可喜的进展.

细胞制备[3]
将MCD4细胞接种于60 mm培养皿中，在基础条件下或100 nM dDAVP刺激1h和/或100 nM 利西普坦处理1h。随后，细胞在细胞分离缓冲液（20 mM NaCl, 130 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.5）中均质，其中存在蛋白酶（1 mM PMSF， 2 mg/mL lepeptin和2 mg/mL pepstatin A）和磷酸酶（10 mM NaF和1 mM正钒酸钠）抑制剂。所得匀浆以80%振幅超声10 s。在4°C下，12,000× g离心10分钟，去除细胞碎片。收集上清液用于免疫印迹实验。

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荧光共振能量转移测量[3]
为了评估细胞内cAMP水平，荧光共振能量转移（FRET）实验进行。简单地说，将MCD4细胞在37℃、5% CO2条件下接种到20 mm玻璃盖上，用编码H96探针的质粒进行瞬时转染，该探针含有Epac1在青色荧光蛋白（CFP）和cp173Venus-Venus之间的cAMP结合序列。转染后48 h进行实验。将细胞置于基础条件下或100 nM dDAVP刺激1 h和/或100 nM Lixivaptan处理1 h。

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透水性测定[3]
通过视频成像实验测量渗透水的渗透性。MCD4细胞在40 mm玻璃罩上生长，并在37°C， 5% CO2的DMEM中加载10µM透膜钙素绿- am，培养45分钟。将细胞置于基础条件下或100 nM dDAVP刺激1h和/或100 nM Lixivaptan/利西普坦处理1h。载染细胞的盖片安装在灌注室中，使用倒置显微镜进行测量，配备单细胞荧光测量和成像分析。用40×油浸物镜（数值孔径NA = 1.30）照射样品。钙素绿- am负载样品在490 nm处被激发。发射的荧光通过一个二色镜，在515 nm处过滤，并由冷却的ECCD相机捕获。荧光测量，以下iso- 290 mOsm；140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM Hepes, 5 mM Glucose)或高渗(460 mOsm；等渗溶液加入135 mM甘露醇)溶液，使用Metafluor®软件v7.8.1.0进行。Calcein-AM是一种非荧光膜渗透染料，具有猝灭能力，在细胞内酯酶诱导乙酰氧基甲酯水解后转化为绿色荧光染料。暴露在高渗溶液中会导致水外流，导致细胞收缩，从而导致钙黄蛋白浓度增加、猝灭和荧光强度最终降低。荧光强度曲线的最佳拟合tau值与水的流出速度成正比，间接表明AQP2对水的渗透性。用时间常数（Ki, s−1）测量细胞收缩的时间过程。

The animals were fed ground rodent chow ad libitum. At the 4th week of age, they were divided into four groups on a control diet or a diet containing Lixivaptan and/or R568. Rats (n = 80, 10 animals per group and gender) received ground rodent chow containing 0.5% Lixivaptan, 0.025% R568, 0.5% Lixivaptan and 0.025% R568 together, or rodent chow without drugs (control group) for 7 weeks. Mice (n = 80, 10 animals per treatment group and gender) were fed with ground rodent chow containing 0.5% Lixivaptan, 0.04% R568, 0.5% Lixivaptan and 0.04% R568 together, or rodent chow without drugs (control group) for 13 weeks. One week before the scheduled sacrifice, animals were housed in metabolic cages to collect 24‐h urine outputs. At 10 weeks (rats) or 16 weeks (mice) of age, animals were weighed and anesthetized with ketamine (90 mg/kg) and xylazine (10 mg/kg) by intraperitoneal injection. Blood was obtained by cardiac puncture and was used for plasma calcium, creatinine and urea levels determination. The right kidney was placed into pre‐weighed vials containing 10% formaldehyde/phosphate buffer saline (pH 7.4). Tissues were embedded in paraffin for histological and histomorphometric analysis. The left kidneys were immediately frozen in liquid nitrogen for cAMP or PKA activity measurements. [4]

[1]. 5-Fluoro-2-methyl-N-[4-(5H-pyrrolo[2,1-c]-[1, 4]benzodiazepin-10(11H)-ylcarbonyl)-3-chlorophenyl]benzamide (VPA-985): an orally active arginine vasopressin antagonist with selectivity for V2 receptors. J Med Chem. 1998 Jul 2;41(14):2442-4.

[2]. Lixivaptan, a non-peptide vasopressin V2 receptor antagonist for the potential oral treatment of hyponatremia. IDrugs. 2010 Nov;13(11):782-92.

[3]. Lixivaptan, a New Generation Diuretic, Counteracts Vasopressin-Induced Aquaporin-2 Trafficking and Function in Renal Collecting Duct Cells. Int J Mol Sci . 2019 Dec 26;21(1):183.

[4]. Pre-clinical evaluation of dual targeting of the GPCRs CaSR and V2R as therapeutic strategy for autosomal dominant polycystic kidney disease. FASEB J. 2021 Oct;35(10):e21874.

Drug Indication
Investigated for use/treatment in hyponatremia and congestive heart failure.
Treatment of hyponatraemia.

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Lixivaptan (VPA-985), being developed by Biogen Idec and Cardiokine, under license from Wyeth (now part of Pfizer), is a non-peptide, selective vasopressin V2 receptor antagonist for the potential oral treatment of hyponatremia associated with heart failure. Arginine vasopressin, the native V2 receptor ligand, stimulates water reabsorption via activation of V2 receptors that are expressed in the collecting ducts of the kidney. In preclinical studies, lixivaptan displayed competitive antagonist activity at V2 receptors in vitro, and increased urine volume and decreased urine osmolality in rats and dogs. The therapeutic benefits of lixivaptan are being evaluated in patients with conditions that are associated with water excess and hyponatremia. Phase II clinical trials in patients with congestive heart failure, liver cirrhosis with ascites or syndrome of inappropriate antidiuretic hormone have demonstrated that, unlike traditional diuretics, lixivaptan increases water clearance without affecting renal sodium excretion or activating the neurohormonal system. Administration of lixivaptan in combination with the diuretic furosemide has been tested in rats as well as in trials in healthy volunteers, in which the two agents were well tolerated. Ongoing phase III trials will determine the role of lixivaptan in the management of hyponatremia, especially when associated with heart failure.[2]

C27H21CLFN3O2

473.92594

473.13

C, 68.43; H, 4.47; Cl, 7.48; F, 4.01; N, 8.87; O, 6.75

168079-32-1

172997

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

626.5±55.0 °C at 760 mmHg

332.7±31.5 °C

0.0±1.8 mmHg at 25°C

1.658

7.23

57.83

1

3

3

34

753

0

O=C(C1=C(Cl)C=C(NC(C2=CC(F)=CC=C2C)=O)C=C1)N(C3)C4=CC=CC=C4CN5C3=CC=C5

PPHTXRNHTVLQED-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C27H21ClFN3O2/c1-17-8-9-19(29)13-23(17)26(33)30-20-10-11-22(24(28)14-20)27(34)32-16-21-6-4-12-31(21)15-18-5-2-3-7-25(18)32/h2-14H,15-16H2,1H3,(H,30,33)

N-[3-chloro-4-(6,11-dihydropyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepine-5-carbonyl)phenyl]-5-fluoro-2-methylbenzamide

VPA-985; VPA985; VPA 985; WAY-VPA-985; Lixivaptan; 168079-32-1; VPA-985; Lixar; WAY-VPA-985; VPA985; CRTX-080; Lixivaptan [USAN:INN]; WAY VPA-985; WAY-VPA 985; WAY VPA 985; CRTX-080; CRTX080; CRTX 080; Lixivaptan

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~95 mg/mL (~200.5 mM)
Ethanol: ~7 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.39 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.39 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。