HCV NS5B 1a (IC50 = 0.94 μM); HCV NS5B 1b (IC50 = 1.2 μM)
Lomibuvir (VX-222) is a potent inhibitor of hepatitis C virus (HCV) NS5B RNA-dependent RNA polymerase (the viral enzyme responsible for viral genome replication), with an IC50 of 16 nM for HCV genotype 1a NS5B polymerase and 12 nM for genotype 1b NS5B polymerase in cell-free enzyme assays [1]
- Lomibuvir acts as a non-nucleoside inhibitor (NNI) of HCV NS5B, binding to the thumb domain of the enzyme; it shows no significant inhibition of human RNA polymerases (e.g., Pol I, Pol II) at concentrations up to 10 μM [1]

VX-222 与 HCV RNA 依赖性 RNA 聚合酶的拇指 II 变构袋结合。 VX-222 对基因型 1a 和 1b 的 HCV NS5B 表现出非竞争性和选择性抑制，IC50 分别为 0.94 和 1.2 μM。 VX-222 选择性抑制亚基因组 HCV 基因型 1a 和 1b 的复制，EC50 分别为 22.3 和 11.2 nM。同样，最近的一项研究表明，VX-222 抑制 1b/Con1 HCV 亚基因组复制子，EC50 为 5 nM。 VX-222 优先抑制引物依赖性 RNA 合成，对从头启动的 RNA 合成仅显示出适度的影响或没有影响。激酶测定：VX-222 对 HCV NS5B 活性的抑制作用是通过使用均聚物 RNA 模板/引物（即聚 rA）评估新合成的 RNA 中酶的 C 末端 Δ21 截短形式掺入的放射性标记 UTP 的量来测量的。 / 寡聚 dT。使用液体闪烁计数器对掺入的放射性进行定量检测。 VX-222 抑制基因型 1b 菌株 BK 的 HCV NS5B 的体外动力学是使用 NS5B 的 C 末端 Δ21 截短版本确定的。 VX-222（1 至 1.5 μM）在 10 至 75 μM 非放射性 UTP 与 0.89 至 6.70 μCi 的 [α-33P] 标记 UTP 混合的情况下进行测试。 RNA 依赖性 RNA 聚合酶反应可在 22 °C 下进行 18 分钟。细胞测定：将含有 HCV RNA 复制子的 Huh7.5 细胞用胰蛋白酶处理，并以 4 × 104 个细胞/孔的浓度接种到 48 孔板中。第二天更换培养基，并将 VX-222 添加到 200 μL 完全培养基中。 48 小时后，提取总 RNA，并通过实时逆转录 PCR (RT-PCR) 定量病毒 RNA。通过对数曲线拟合的非线性回归分析计算使 HCV RNA 复制子水平降低 50% 的有效药物浓度 (EC50)。

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在重组HCV基因型1a NS5B聚合酶的无细胞实验中，50 nM Lomibuvir 可抑制RNA合成约90%（通过检测放射性[³H]-UTP掺入新合成RNA的量衡量）；该抑制作用在去除药物后可逆转[1]
- 在HCV基因型1a（H77株）复制子细胞中，25 nM Lomibuvir 处理48小时可使HCV RNA水平减少约95%（qRT-PCR），病毒蛋白（NS5B）表达减少约90%（Western blot）；其对HCV基因型1a复制子的EC50为22 nM，对基因型1b（Con1株）复制子的EC50为18 nM [1]
- 在HCV 1a复制子细胞中，Lomibuvir（10 nM）与filibuvir（另一种HCV NS5B抑制剂，10 nM）联合使用时表现出协同抑制作用，HCV RNA减少约99%（单独使用相同浓度的两种药物时抑制率分别为~70%和~65%）[1]

在大鼠和狗中，VCH-222 显示出良好的药代动力学特征，包括较低的全身清除率和出色的口服生物利用度（大于 30%）以及良好的 ADME 特性。 VCH-222 可通过多种酶（CYP1A1、2A6、2B6、2C8、CYP 3A4、UGT1A3）进行生物转化，预计会在肝脏中主动转运，并在胆汁中或以葡萄糖醛酸加合物的形式主要完整地排泄。

VX-222 对 HCV NS5B 活性的抑制作用是通过使用称为聚 rA / 寡聚 dT 的均聚物 RNA 模板/引物测量新鲜合成的 RNA 中酶的 C 末端 Δ21 截短形式掺入的放射性标记 UTP 的量来量化的。液体闪烁计数器用于定量检测掺入的放射性。通过使用 NS5B 的 C 末端 Δ21 截短形式，确定了 VX-222 诱导的对基因型 1b 菌株 BK 的 HCV NS5B 抑制的体外动力学。当VX-222（1至1.5μM）与0.89至6.70μCi的[α-33P]标记UTP和10至75μM非放射性UTP组合时，进行测试。 RNA 依赖性 RNA 聚合酶反应在 22 °C 下进行 18 分钟。

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大鼠和人肝微粒体的稳定性研究：[2]
孵育混合物中含有最终蛋白浓度为0.5 mg/mL的肝微粒体，1µM的试验品和2 mM的NADPH， 0.1 M的磷酸钾缓冲液（pH 7.4）含有1 mM的EDTA。在0、5、10、15和30分钟收集等分，通过加入含有内标的乙腈沉淀蛋白质来终止反应。采用LC/MS/MS对上清液进行定量分析。

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CYP抑制试验：[2]
对实验品抑制人肝微粒体中各种CYP酶的潜力进行了评价。含0.25 mg/mL混合性别人肝微粒体蛋白和2 mM NADPH的孵育混合物，在0.1 M磷酸钾缓冲液中加入1.0 mM EDTA, pH 7.4。测试品与酶特异性探针底物在0至75µM的浓度范围内孵育。在37°C摇晃培养箱中进行3次10分钟的培养。通过LC/MS/MS监测每个探针特异性代谢物的外观，并相对于载体对照测定其形成的抑制百分率，以确定IC50值。

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PXR试验（CYP诱导电位）：[2]
利用稳定转染PXR和荧光素酶报告基因的DPX2人肝癌细胞系，评估PXR受体的激活。底物浓度范围（0.1-100µM）与细胞孵育24小时，绘制PXR激活相对于载体对照的倍数，以确定EC50和Emax值。利福平作为阳性对照。

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快速平衡透析（RED）评估血浆蛋白结合：[2]
将试验品以终浓度为1和10 μ M（1%有机）加入血浆中。将血浆样品装入RED装置的血浆室，并将磷酸盐缓冲液装入缓冲室。在37℃、饱和湿度的CO2培养箱（5% CO2）中，密封并在振动平台上搅拌6小时。孵育后，将装置两侧的等分液与200µL内标溶液在乙腈中涡流混合，沉淀蛋白质。采用LC/MS/MS对上清液进行分析。通过比较缓冲液样品与等离子体样品的峰面积比来确定未结合的部分。

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表面等离子体共振。[1]
所有分析物结合实验均在Biacore T100仪器上进行，使用n -羟基琥珀酰亚胺酯和1-乙基-3（3-二氨基丙基）盐酸碳二亚胺活化的预处理CM5传感器芯片。1bΔ21 NS5B蛋白及其变体在注射5分钟后固定到约9,000反应单位的标称密度。将化合物注入含有25 mM HEPES （pH 7.4）、10 mM MgCl2、150 mM NaCl、0.01% Tween 20、0.05% β-巯基乙醇和5% DMSO的缓冲液中。所有化合物均表现出1:1的饱和结合行为。为了竞争结合，实验设计包括注射饱和浓度的第一种分析物（160 nM非布韦），然后立即注射等摩尔比例的分析物混合物（160 nM非布韦加160 nM VX-222或ANA-598）。

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HCV NS5B RNA聚合酶活性检测流程（基于[1]摘要描述）：从昆虫细胞（杆状病毒表达系统）中纯化重组HCV基因型1a/1b NS5B聚合酶。将该酶与合成HCV RNA模板（30聚体）及核糖核苷三磷酸（rNTPs，含[³H]-UTP作为示踪剂）混合于检测缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0，5 mM MgCl₂，1 mM DTT，0.1 mg/mL BSA）中。加入1 nM~100 nM的Lomibuvir，在30°C孵育2小时。加入20%三氯乙酸（TCA）终止反应，通过液体闪烁计数法检测沉淀RNA（掺入的[³H]-UTP）。相对于溶剂对照组计算酶活性抑制率，采用四参数逻辑回归确定IC50[1]

将含有 HCV RNA 复制子的胰蛋白酶处理的 Huh7.5 细胞以每孔 4 × 10 4 细胞的密度接种到 48 孔板中。第二天，将 200 μL 完整培养基与 VX-222 一起添加到新培养基中。 48 小时后，提取总 RNA，并使用实时逆转录 PCR (RT-PCR) 定量病毒 RNA。通过使用非线性回归分析和对数曲线拟合，确定了使 HCV RNA 复制子水平降低 50% 的有效药物浓度 (EC50)。

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肝细胞主动摄取：[2]
在37℃和4℃孵育15分钟的时间过程中，通过比较肝细胞中底物与培养基中底物的比例来评估试验品对人肝细胞的积极吸收。匹伐他汀作为阳性对照。用试验化合物孵育后，通过油层离心，在含内标的甲醇中裂解，将肝细胞从培养液中分离出来。采用LC/MS/MS对上清液进行分析，并在37℃和4℃下计算肝细胞中化合物与培养液中化合物的峰值比，以评估活性摄取。

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Caco2渗透性测定：[2]
简单地说，Caco-2细胞单层在12孔Costar Transwell®板上生长，融合在胶原包被的微孔聚碳酸酯膜上。渗透性试验缓冲液为Hank 's平衡盐溶液，含有10 mM HEPES和15 mM葡萄糖，pH值为7.4。给药液浓度为5µM。细胞在根尖侧（a -to- b）或基底侧（B-to-A）给药，在37℃、5% CO2的湿室中孵育。试验一式两份。在每个时间点（1和2小时），从接收腔中取出200µL的等分液，并用新鲜的实验缓冲液替换。通过无细胞（空白）膜进行渗透，以解释与设备的非特异性结合和测试品通过设备的自由扩散。经上皮电阻作为细胞单层完整性的定性测量。在测试品存在的情况下，通过每个单层测量路西法黄通量，以确保在分析过程中细胞的完整性。心得安作为阳性对照。定量分析采用LC-MS/MS，采用4点标准曲线。视渗透性（Papp）作为受试物在井内累积浓度随时间变化的函数计算。

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HCV复制子细胞实验流程（基于[1]摘要描述）：HCV基因型1a（H77）和1b（Con1）复制子细胞（稳定表达HCV非结构蛋白和新霉素抗性基因）在含10%胎牛血清和0.5 mg/mL G418的DMEM培养基中培养。将细胞以5×10³细胞/孔接种于96孔板，用Lomibuvir（5 nM、25 nM、100 nM）单独处理或与filibuvir（10 nM）联合处理48小时。从细胞中提取总RNA，通过qRT-PCR定量HCV RNA水平（归一化至GAPDH mRNA）。检测NS5B蛋白时，用RIPA缓冲液裂解细胞，通过Western blot（抗HCV NS5B抗体和抗GAPDH抗体（内参））分析[1]

大鼠或犬
大鼠剂量为 5 mg/kg，犬剂量为 10 mg/kg
灌胃给药

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体内研究[2]
大鼠静脉注射制剂配制成 10% DMI/15% EtOH/35% PPG/40% 葡萄糖/5% 水溶液。犬和猴的静脉注射制剂配制成生理盐水溶液。大鼠口服制剂配制成 0.5% MC/0.1% SLS/99.4% 水的混悬液。在口服研究中，雄性 Sprague-Dawley 大鼠植入颈动脉插管以方便采血和/或单根胆管插管以方便采胆汁。在静脉注射研究中，雄性 Sprague-Dawley 大鼠额外植入颈静脉导管用于给药。给药后每隔一段时间采集血样，直至 72 小时。 EDTA用作抗凝剂，血浆通过离心法制备。胆管插管大鼠口服15mg/kg剂量；每隔一段时间收集胆汁、尿液和粪便，持续72小时。在组织分布研究中，雄性Sprague-Dawley大鼠口服10mg/kg剂量，并在给药后1、2、4、7和24小时处死后收集特定组织。

在用浓度高达 1 μM 的洛米布韦处理 HCV 复制子细胞 72 小时后，未观察到明显的细胞毒性（细胞存活率 >90%，与载体组相比，通过 MTT 法测定）[1]

[1]. Biochemical study of the comparative inhibition of hepatitis C virus RNA polymerase by VX-222 and filibuvir. Antimicrob Agents Chemother. 2012;56(2):830-837.

[2]. Discovery of Novel Allosteric HCV NS5B Inhibitors. 2. Lactam-Containing Thiophene Carboxylates. ACS Med Chem Lett. 2017;8(2):251-255.

5-(3,3-二甲基丁-1-炔基)-3-[(4-羟基环己基)-[(4-甲基环己基)-氧甲基]氨基]-2-噻吩羧酸是一种噻吩羧酸。
洛米布韦已用于治疗慢性丙型肝炎病毒和慢性丙型肝炎病毒感染的临床试验。

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菲利布韦和VX-222是非核苷类抑制剂（NNI），它们与丙型肝炎病毒（HCV）RNA依赖性RNA聚合酶的拇指II变构口袋结合。这两种化合物在临床试验中均显示出显著的疗效，因此，深入了解它们的抑制机制至关重要。在本研究中，菲利布韦和VX-222分别以70 nM和5 nM的半数有效浓度（EC50）抑制了HCV 1b/Con1亚基因组复制子。利用多种RNA模板进行生化分析，我们发现这两种化合物均优先抑制引物依赖性RNA合成，而对从头起始的RNA合成几乎没有影响或仅有轻微影响。菲利布韦和VX-222与HCV聚合酶的解离常数分别为29 nM和17 nM。我们分析了拇指II口袋中三种潜在的耐药突变对这两种化合物抑制作用的影响。在亚基因组复制子和酶活性分析中，RNA聚合酶中的M423T突变对菲利布韦的耐药性至少提高了100倍。这种耐药性是由于突变酶与菲利布韦的结合亲和力(K_d)降低了250倍所致。相比之下，VX-222 的抑制活性仅受 M423T 取代的轻微影响，但受 I482L 取代的影响则更为显著。[1]

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洛米布韦 (1) 是一种非核苷类丙型肝炎病毒 NS5B 聚合酶变构抑制剂，已证实具有临床疗效。该类抑制剂的后续研发工作主要集中在提高其抗病毒活性以及理化和药代动力学性质。近期，我们报道了该系列化合物的研发进展，最终获得了化合物 2，其效力与化合物 1 相当，且理化性质有所改善。受相关噻吩羧酸酯抑制剂的 X 射线晶体结构启发，我们对氨基酰胺衍生的侧链进行了进一步研究，合成了一系列内酰胺衍生物。以化合物 12f 为例，该系列化合物在抗 HCV 复制活性方面提高了 3-5 倍（通过复制子检测测定）。本文讨论了该新型系列化合物的合成、构效关系、体外ADME表征和体内评价。[2]

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洛米布韦 (VX-222) 是一种非核苷类抑制剂 (NNI)，可抑制HCV NS5B RNA聚合酶，而NS5B是慢性HCV感染的关键治疗靶点（HCV NS5B对病毒基因组复制至关重要）[1]
- 与另一种HCV NS5B NNI——非利布韦相比，洛米布韦 对HCV基因1b型具有更高的活性（IC50：12 nM，而非利布韦为25 nM），并且与非利布韦联用时表现出协同抗病毒活性，这支持了其在HCV联合治疗中的应用潜力[1]

C25H35NO4S

445.61

445.228

C, 67.38; H, 7.92; N, 3.14; O, 14.36; S, 7.19

1026785-55-6

Lomibuvir;1026785-55-6; 1026785-59-0

24798764

White to off-white solid powder

1.2±0.1 g/cm3

640.5±55.0 °C at 760 mmHg

341.2±31.5 °C

0.0±2.0 mmHg at 25°C

1.589

5.15

106.08

2

5

6

31

717

0

O=C(C1=C(N([C@H]2CC[C@H](O)CC2)C([C@H]3CC[C@H](C)CC3)=O)C=C(C#CC(C)(C)C)S1)O

WPMJNLCLKAKMLA-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C25H35NO4S/c1-16-5-7-17(8-6-16)23(28)26(18-9-11-19(27)12-10-18)21-15-20(13-14-25(2,3)4)31-22(21)24(29)30/h15-19,27H,5-12H2,1-4H3,(H,29,30)

5-(3,3-dimethylbut-1-ynyl)-3-[(4-hydroxycyclohexyl)-(4-methylcyclohexanecarbonyl)amino]thiophene-2-carboxylic acid

TD-4208; TD4208; GSK-1160724; GSK-1160724; Lomibuvir; VX-222; 1026785-59-0; 1026785-55-6; VCH-222; VX-222 (VCH-222, Lomibuvir); cis-Lomibuvir; Lomibuvir (VX-222); TD 4208; GSK1160724; trade name: Yupelri; TD-4208; GSK 1160724

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

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