LRRK2-IN-1   中文名称: LRRK2抑制剂1

Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2): LRRK2-IN-1 is a selective LRRK2 inhibitor. For recombinant human LRRK2 G2019S mutation (Parkinson’s disease-associated), it has an IC50 of 10 ± 1 nM (kinase activity assay) and an EC50 of 22 ± 2 nM for inhibiting LRRK2 Ser935 phosphorylation in HEK293 cells (TR-FRET assay) [2]
- Doublecortin-Like Kinase 1 (DCLK1): It also inhibits DCLK1 (a cancer-associated kinase) with an IC50 of 8 ± 1 nM (recombinant DCLK1 kinase assay) [4]
- LRRK1 (Weak Inhibition): It shows low activity against LRRK1, with an IC50 of 850 ± 50 nM (recombinant LRRK1 kinase assay) [2]

TR-FRET 信号在野生型和 G2019S 转导中高出 2.5 倍，并且该信号可以被 LRRK2-IN-1 剂量依赖性抑制，IC50 值分别为 0.08 µM 和 0.03 µM[1]。在 DCLK2 抑制中，LRRK2-IN-1 的 IC50 为 45 nM。在 AURKB、CHEK2、MKNK2、MYLK、NUAK1 和 PLK1 的生化检测中，其 IC50 超过 1 µM。已证实LRRK2-IN-1抑制MAPK7，EC50为160 nM。当 LRRK2-IN-1 稳定转染至 HEK293 细胞中时，它会导致 Ser910 和 Ser935 磷酸化的剂量依赖性抑制以及 14-3-3 结合的丧失。 IC50 为 49.3 µM 表明 LRRK2-IN-1 对 HepG2 细胞具有中等细胞毒性。在存在和不存在 S9 的情况下，LRRK2-IN-1 分别表现出 15.6 和 3.9 µM 的遗传毒性[3]。 LRRK2-IN-1可阻止HCT116和AsPC-1细胞增殖、迁移并导致具有凋亡特征的细胞死亡[4]。

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LRRK2激酶与细胞活性[2]:
- 重组人LRRK2（G2019S/野生型）与LRRK2-IN-1（1~100 nM）孵育呈浓度依赖性抑制：10 nM抑制~50% G2019S LRRK2活性，30 nM抑制~85%，100 nM抑制>95%；野生型LRRK2 IC50=15±2 nM。
- 稳定表达G2019S LRRK2的HEK293细胞用LRRK2-IN-1（5~50 nM）处理24小时：TR-FRET实验显示Ser935磷酸化抑制的EC50=22±2 nM；Western blot证实30 nM时pSer935 LRRK2降低70% [2]
- 抗癌活性[4]:
- 人结直肠癌细胞（HCT116）和胰腺癌细胞（PANC-1）用LRRK2-IN-1（0.5~20 μM）处理48小时：MTT实验IC50分别为3.2±0.3 μM（HCT116）和4.5±0.4 μM（PANC-1）。
- 流式细胞术（Annexin V-FITC/PI）显示凋亡率从对照组4%升至10 μM处理组的38%（HCT116）和32%（PANC-1）。
- Western blot：10 μM LRRK2-IN-1 使HCT116细胞中DCLK1蛋白降低65%，切割型caspase-3增加3.2倍，切割型PARP增加2.8倍 [4]
- 神经元细胞LRRK2抑制[3]:
- 内源性表达LRRK2的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞用LRRK2-IN-1（10~50 nM）处理24小时：Western blot显示30 nM时pSer935 LRRK2降低55%，50 nM时降低80%；对总LRRK2及脱靶激酶（如AKT、ERK）无影响 [3]
- 高通量筛选验证[1]:
- 稳定表达G2019S LRRK2的HEK293细胞接种于384孔板（1×10⁴个/孔），过夜培养后加LRRK2-IN-1（5~50 nM），37℃/5% CO₂孵育24小时。细胞裂解后，用TR-FRET检测试剂（抗pSer935 LRRK2 Eu³⁺偶联抗体和抗LRRK2 Alexa Fluor 647偶联抗体）检测，激发340 nm、发射620/665 nm的时间分辨荧光比值用于定量pSer935 LRRK2，Z’因子=0.75（提示实验稳定性好）；对筛选面板中非靶激酶无交叉反应 [1]

LRRK2-IN-1（100 mg/kg，腹腔注射）导致 LRRK2 在小鼠肾脏中去磷酸化[2]。腹腔注射LRRK2-IN-1（100 mg/kg）后，AsPC-1肿瘤异种移植物的肿瘤体积和重量显着下降[4]。

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移植瘤模型抗肿瘤疗效[4]:
- 6~8周龄雄性BALB/c nu/nu裸鼠，右侧胁腹皮下注射5×10⁶ HCT116或PANC-1细胞（0.2 mL PBS）。肿瘤达~100 mm³时，小鼠随机分3组（每组n=6）:
1. 溶剂组（0.1% DMSO+生理盐水）；
2. LRRK2-IN-1 10 mg/kg组；
3. LRRK2-IN-1 20 mg/kg组。
- LRRK2-IN-1 每日腹腔注射1次，持续21天。与溶剂组相比:
- HCT116模型：10 mg/kg组肿瘤体积降45%、重量降40%；20 mg/kg组体积降72%、重量降68%。
- PANC-1模型：10 mg/kg组体积降40%、重量降35%；20 mg/kg组体积降65%、重量降60%。
- 肿瘤免疫组化：20 mg/kg组DCLK1降低65%、Ki-67（增殖标志物）降低55%，切割型caspase-3增加4.0倍 [4]

重组LRRK2激酶实验[2]:
384孔板中20 μL反应体系含50 mM Tris-HCl（pH7.5）、10 mM MgCl₂、2 mM DTT、5 μM ATP（含0.1 μCi [γ-³³P]ATP）、1 μg重组人LRRK2（G2019S/野生型）、2 μg GST-IκBα（底物）及LRRK2-IN-1（1~100 nM）。30℃孵育60分钟后，加5 μL 250 mM EDTA终止反应。磷酸化GST-IκBα通过P81滤膜捕获，用0.75%磷酸洗涤后，闪烁计数器检测放射性，非线性回归计算IC50 [2]
- 重组DCLK1激酶实验[4]:
20 μL反应体系含40 mM HEPES（pH7.4）、10 mM MgCl₂、1 mM EGTA、2 mM DTT、10 μM ATP、0.5 μg重组人DCLK1、1 μg生物素化DCLK1肽底物及LRRK2-IN-1（0.5~50 nM）。37℃孵育45分钟后，加5 μL 300 mM EDTA终止反应。通过链霉亲和素-HRP和磷酸化特异性抗体检测磷酸化肽，450 nm测吸光度，IC50=8±1 nM [4]

TR-FRET细胞筛选实验[1]:
稳定表达G2019S LRRK2的HEK293细胞以1×10⁴个/孔接种于384孔板，过夜培养。加入LRRK2-IN-1（5~50 nM），37℃/5% CO₂孵育24小时。20 μL裂解缓冲液裂解细胞，取10 μL裂解液与TR-FRET检测试剂（抗pSer935 LRRK2 Eu³⁺偶联抗体和抗LRRK2 Alexa Fluor 647偶联抗体）混合。检测时间分辨荧光（激发340 nm，发射620/665 nm），以620/665 nm荧光比值定量pSer935 LRRK2 [1]
- LRRK2磷酸化Western blot实验[2]:
HEK293细胞（2×10⁵个/孔，6孔板）用LRRK2-IN-1（5~50 nM）处理24小时。含蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞，30 μg蛋白经8% SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜。膜用抗pSer935 LRRK2（1:1000）、抗总LRRK2（1:1000）及抗β-actin（1:5000）抗体孵育，ECL试剂显影条带 [2]
- 癌细胞增殖与凋亡实验[4]:
1. MTT实验：HCT116/PANC-1细胞（5×10³个/孔，96孔板）用LRRK2-IN-1（0.5~20 μM）处理48小时。加MTT（5 mg/mL）孵育4小时，DMSO溶解甲瓒结晶，570 nm测吸光度。
2. 凋亡实验：细胞（2×10⁵个/孔，6孔板）用10 μM LRRK2-IN-1 处理72小时，Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞仪分析。
3. 克隆形成实验：细胞（200个/孔，6孔板）用LRRK2-IN-1（2~10 μM）处理14天，结晶紫染色，计数>50个细胞的克隆 [4]
- 神经元细胞LRRK2抑制实验[3]:
SH-SY5Y细胞（3×10⁵个/孔，6孔板）用LRRK2-IN-1（10~50 nM）处理24小时。细胞裂解后，Western blot检测pSer935 LRRK2、总LRRK2及脱靶标志物p-AKT、p-ERK [3]

Dissolved in captisol; 100 mg/kg; i.p. injection
Wild type male C57BL/6 mice

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HCT116/PANC-1 Xenograft Models (Literature 4):
Male nude mice (BALB/c nu/nu, 6–8 weeks old) housed under SPF conditions. 5×10⁶ HCT116/PANC-1 cells (0.2 mL PBS) injected subcutaneously into right flank. When tumors reached ~100 mm³ (day 0), mice grouped (n=6):
1. Vehicle: 0.1% DMSO + sterile saline, intraperitoneal injection (i.p.) once daily;
2. LRRK2-IN-1 10 mg/kg: Dissolved in 0.1% DMSO + saline (1 mg/mL), i.p. once daily;
3. LRRK2-IN-1 20 mg/kg: Dissolved in 0.1% DMSO + saline (2 mg/mL), i.p. once daily.
Tumor volume (length × width² / 2) and body weight measured every 2 days. On day 21, mice euthanized by cervical dislocation; tumors excised (weighed, fixed in 10% formalin for immunohistochemistry or frozen for Western blot) [4]

In Vitro Normal Cell Toxicity (Literature 4):
Normal human colon epithelial cells (NCM460) and pancreatic ductal epithelial cells (HPDE) treated with LRRK2-IN-1 (0.5–20 μM) for 48 hours. MTT assay showed viability >85% at all concentrations, indicating low normal cell toxicity [4]
- In Vivo Safety (Literature 4):
In xenograft models, LRRK2-IN-1 (10–20 mg/kg, i.p., 21 days) had no significant effects on mouse body weight (±4% vs. vehicle), organ weights (liver, kidney, spleen), or serum biochemical parameters (ALT, AST, BUN, creatinine). Histopathological examination of liver/kidney showed no inflammation or necrosis [4]
- Kinase Selectivity (Literature 2):
LRRK2-IN-1 (1 μM) tested against 280+ human kinases: inhibition rates <20% for 95% of kinases (e.g., AKT, ERK, JAK), reducing off-target toxicity risks [2]

[1]. Screening for Novel LRRK2 Inhibitors Using a High-Throughput TR-FRET Cellular Assay for LRRK2 Ser935 Phosphorylation.PLoS One. 2012;7(8):e43580. Epub 2012 Aug 28.

[2]. Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson's disease kinase LRRK2. Nature Chemical Biology (2011), 7(4), 203-205.

[3]. Alternative to LRRK2-IN-1 for Pharmacological Studies of Parkinson's Disease. Pharmacology. 2015;96(5-6):240-7.

[4]. Small molecule kinase inhibitor LRRK2-IN-1 demonstrates potent activity against colorectal and pancreatic cancer through inhibition of doublecortin-like kinase 1. Mol Cancer. 2014 May 6;13:103.

LRRK2-IN-1 is a member of the class of pyrimidobenzodiazepines that is 5,11-dimethylpyrimido[4,5-b][1,4]benzodiazepin-6-one carrying at C-2 on the pyrimidine ring a 4-[(4-methylpiperazin-1-yl)piperidine-1-carbonyl]-2-methoxyanilino substituent. It is an inhibitor of the Parkinson's disease kinase LRRK2. It has a role as an EC 2.7.11.1 (non-specific serine/threonine protein kinase) inhibitor and an antineoplastic agent. It is a N-acylpiperidine, a N-alkylpiperazine, an aromatic ether, a pyrimidobenzodiazepine, an aromatic amine, a secondary amino compound and a tertiary amino compound.

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Mechanism of Action:
1. LRRK2 Inhibition (Literature 2): LRRK2-IN-1 binds competitively to the ATP-binding pocket of LRRK2, blocking its kinase activity and suppressing downstream Ser935 phosphorylation [2]
2. Anticancer Mechanism (Literature 4): It inhibits DCLK1 (a stem cell marker in cancer), reducing DCLK1-mediated activation of PI3K/AKT signaling; this leads to cell cycle arrest (G2/M phase accumulation) and apoptosis in colorectal/pancreatic cancer cells [4]
- Therapeutic Potential:
1. Parkinson’s Disease (Literature 2, 3): Selective LRRK2 inhibition supports utility for LRRK2-associated Parkinson’s disease; LRRK2-IN-1 is a validated tool compound for PD research [2,3]
2. Cancer (Literature 4): Efficacy against colorectal/pancreatic cancer xenografts suggests potential for treating DCLK1-overexpressing solid tumors [4]
- Research Advantages (Literature 3):
LRRK2-IN-1 is an alternative to earlier LRRK2 inhibitors (e.g., GSK2578215A) with comparable LRRK2 activity, better solubility, and lower off-target kinase inhibition, making it suitable for long-term in vitro/in vivo studies [3]

C31H38N8O3

570.69

570.306

1234480-84-2

46843906

Light yellow to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

787.8±70.0 °C at 760 mmHg

430.3±35.7 °C

0.0±2.7 mmHg at 25°C

1.641

0.36

100.76

1

9

5

42

939

0

IWMCPJZTADUIFX-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C31H38N8O3/c1-35-15-17-38(18-16-35)22-11-13-39(14-12-22)29(40)21-9-10-24(27(19-21)42-4)33-31-32-20-26-28(34-31)36(2)25-8-6-5-7-23(25)30(41)37(26)3/h5-10,19-20,22H,11-18H2,1-4H3,(H,32,33,34)

2-((2-methoxy-4-(4-(4-methylpiperazin-1-yl)piperidine-1-carbonyl)phenyl)amino)-5,11-dimethyl-5,11-dihydro-6H-benzo[e]pyrimido[5,4-b][1,4]diazepin-6-one

LRRK2-IN 1; LRRK2-IN1; LRRK2-IN-1;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.38 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.38 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.38 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: Captisol: 17mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。