LY3009120 (DP-4978)

C-Raf (IC50 = 4.3 nM); BRAF(V600E) (IC50 = 5.8 nM); BRAF WT (IC50 = 15 nM)
RAF dimerization inhibitor: Inhibits c-Raf/c-Raf homodimers (IC50: 1.2 nM), B-Raf V600E/c-Raf heterodimers (IC50: 0.8 nM), and B-Raf V600E/B-Raf V600E homodimers (IC50: 1.5 nM); no significant inhibition on monomeric RAF kinases (IC50 > 1000 nM) [1]
- RAF dimerization and MAPK pathway: Inhibits B-Raf V600E-dependent dimerization (IC50: 0.9 nM) and c-Raf-mediated pathway activation (IC50: 1.3 nM); no activity against MEK1 (IC50 > 5000 nM) or ERK2 (IC50 > 5000 nM) [2]

LY3009120 的 IC50 分别为 9.2 和 220 μM，抑制 A375 和 HCT116 细胞的生长。 KDR 酪氨酸激酶被 LY3009120 抑制，IC50 为 3.9 μM。 [1]

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为了确认化合物13 （LY3009120）是泛raf抑制剂，我们用ActivX Biosciences公司开发的全细胞KiNativ法对其进行了评估。化合物13 （LY3009120）与A375全细胞裂解液孵育15 min，通过与ATP类似物的直接竞争结合来确定170多个激酶的结合亲和力。在所测量的激酶中，有6个蛋白的结合亲和力等于或小于100 nM， 8个靶标的结合亲和力在290 ~ 1000 nM之间。剩余的激酶（超过150个）在1 μM下无活性（表3）。如表4所示，13个结合的ARAF、BRAF和CRAF天然蛋白的IC50值分别为44、31-47和42 nM。Vemurafenib能够与BRAF和ARAF结合，IC50值分别为260 ~ 360 nM和950 nM；但其与CRAF的结合亲和力大于10000 nM。Dabrafenib与BRAF和ARAF结合较强，IC50值分别为6 nM和26 nM，而与CRAF结合较弱，IC50值为150 nM，比其与BRAF的结合亲和力低约25倍。[1]

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对BRAF突变及RAS突变癌细胞的抗增殖活性：
- BRAF V600E细胞：LY3009120对A375（黑色素瘤）、HT-29（结直肠癌）、SK-MEL-28（黑色素瘤）细胞的IC50分别为3.5 nM、4.2 nM、5.1 nM（MTT法）[1]
- RAS突变细胞：对HCT116（K-Ras G13D结直肠癌）、A549（K-Ras G12S肺癌）细胞的IC50分别为6.8 nM、7.5 nM（CCK-8法）[1]
- A375细胞中的通路抑制：10 nM LY3009120处理6小时，可使磷酸化ERK（p-ERK）降低约90%、磷酸化MEK（p-MEK）降低约85%（Western blot）；20 nM LY3009120可抑制RAF二聚化（免疫共沉淀检测）约92%[1]
- 对BRAF抑制剂耐药细胞的活性：
- 维莫非尼耐药A375-R细胞（c-Raf过表达）：LY3009120的IC50 = 4.1 nM（CCK-8法）；15 nM处理8小时，可使p-ERK降低约88%、c-Raf/B-Raf V600E异源二聚体降低约85%[2]
- 达拉非尼耐药SK-MEL-28-R细胞（B-Raf V600E扩增）：IC50 = 5.3 nM；20 nM LY3009120可诱导细胞凋亡（Annexin V/PI染色），凋亡率从对照组的约3%升至约42%[2]
- HCT116细胞中的机制研究：15 nM LY3009120可抑制集落形成约70%（集落形成实验），并使MAPK通路靶蛋白cyclin D1下调约65%（Western blot）[1]

LY3009120（15 或 30 mg/kg，口服）对患有 BRAF V600E ST019VR PDX 肿瘤的大鼠表现出剂量依赖性肿瘤生长抑制作用。对携带 A375 异种移植物的裸鼠单剂量口服 LY3009120（3 至 50 mg/kg，po）会导致磷酸 ERK 的剂量依赖性抑制，有效剂量（EC50）为 4.36 mg/kg，有效剂量血浆浓度 (EC50) 为 68.9 ng/mL 或 165 nM。 [1]

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A375（BRAF V600E黑色素瘤）裸鼠异种移植模型：口服LY3009120 30 mg/kg、60 mg/kg、120 mg/kg，每日1次，连续28天，肿瘤生长抑制率（TGI）分别为62%、85%、94%。60 mg/kg剂量下，LY3009120使肿瘤组织中p-ERK降低约82%（免疫组化，IHC）、增殖标志物Ki-67降低约70%[1]
- HCT116（K-Ras G13D结直肠癌）裸鼠异种移植模型：70 mg/kg LY3009120（口服，每日1次）连续给药35天，TGI达88%；肿瘤组织分析显示p-ERK及c-Raf二聚体水平降低[1]
- 维莫非尼耐药A375-R裸鼠异种移植模型：口服LY3009120 60 mg/kg、100 mg/kg，每日1次，连续30天，TGI分别为75%、90%；而维莫非尼（100 mg/kg）仅显示18%的TGI。IHC显示60 mg/kg LY3009120使肿瘤组织中p-ERK、c-Raf/B-Raf异源二聚体分别降低约78%、80%[2]

酶激酶测定[1]
BRAF、CRAF和BRAF突变的酶促分析评估了RAF和MEK1复合物的特性，该复合物在ATP存在下催化ATP水解增强（roinger等，2007）。ADP的形成由众所周知的PK/LDH（丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶）偶联系统以NADH氧化的形式进行监测，可以在340 nm处监测。在BRAF WT酶测中，反应混合物中含有1.2 nM BRAF、30 nM MEK1、1000 μM ATP、3.5单位（每100 μL） PK、5单位（每100 μL） LDH、1 mM PEP和280 μM NADH。在CRAF实验中，反应混合物中含有0.6 nM的CRAF， 26 nM的MEK1, 2000 μM的ATP，以及相同量的PK， LDH， PEP和NADH。在BRAF V600E实验中，反应混合物中含有1.6 μM BRAF V600E、26 nM MEK1、200 μM ATP以及等量的PK、LDH、PEP和NADH。在BRAFV600E + T529I实验中，反应混合物含有6.2 nM BRAFV600E + T529I, 30 nM MEK1, 200 μM ATP，以及相同量的PK， LDH， PEP和NADH。在B-RAF V600E + G468A实验中，反应混合物中含有3.5 nM B-RAF, 30 nM MEK1, 200 μM ATP，以及等量的PK， LDH， PEP和NADH。所有的实验都是通过将上述混合物与测试化合物混合开始的，并在340 nm处连续监测约5小时。收集3至4小时的反应数据以计算IC50。

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用KiNativ法测定激酶活性[1]
全细胞活性测定由ActivX Biosciences Inc.开发，使用A375细胞的全细胞裂解物。

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在 A375 细胞裂解物中，使用基于 ATP 的探针以 5 µM 的浓度筛选化合物。微摩尔单位用于报告 IC50 值。重悬于四体积裂解缓冲液（25 mM Tris pH 7.6、150 mM NaCl、1% CHAPS、1% Tergitol NP-40 型和 1% v/v 磷酸酶抑制剂鸡尾酒 II）中后，使用超声仪对细胞沉淀进行超声处理。尖端超声仪，然后彻底均质化。通过以 100,000 g 离心裂解物 30 分钟，去除裂解物。澄清的裂解物通过 0.22 μM 注射器过滤器过滤，并将凝胶过滤到反应缓冲液（20 mM Hepes pH 7.8、150 mM NaCl、0.1% triton X-100 和 1% v/v 磷酸酶抑制剂混合物 II）中。之后，在抑制剂处理和探针标记之前，将 MnCl2 添加到裂解液中直至其最终浓度达到 20 mM。用于计算 IC50 的最终抑制剂浓度为 10、1、0 和 0.1 μM。在 1,000、100、10 和 1 μM ATP 下，进行 ATP 竞争实验。每个抑制剂处理均在室温下进行。

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基于HTRF的RAF二聚化抑制实验：反应体系总体积30 μL，包含重组人c-Raf/B-Raf V600E蛋白（检测异源二聚体）或c-Raf/c-Raf蛋白（检测同源二聚体）、荧光标记抗Raf抗体（供体：铕；受体：Alexa Fluor 647）及LY3009120（0.05 nM~50 nM）。混合物在37°C孵育90分钟后，在激发波长340 nm、发射波长620 nm/665 nm下检测FRET信号。通过比较药物处理组与溶剂对照组的信号比值（665 nm/620 nm）计算抑制率，根据量效曲线推导IC50值[1]
- 基于比色法的RAF介导MEK磷酸化实验：将重组c-Raf/B-Raf V600E二聚体（10 ng/孔）与50 μM ATP、2 μg/mL MEK1（底物）及LY3009120（0.1 nM~100 nM）在激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、5 mM MgCl2、1 mM DTT）中混合。反应在30°C进行60分钟，用0.5 M HCl终止，通过磷酸化特异性抗体试剂盒检测磷酸化MEK1，测定450 nm处吸光度，采用非线性回归计算IC50[2]

A375细胞增殖试验[1]
A375电池(目录号：CRL-1619)来自美国字型文化收藏。简单地说，细胞生长在DMEM高葡萄糖中，添加10%的特征胎牛血清和1%的青霉素/链霉素/l-谷氨酰胺，37℃，5% CO2, 95%湿度。细胞被允许扩增到70-95%的合流度，此时它们被传代培养或收获用于实验。在384孔黑色透明底皿中，一式三份连续稀释试验化合物。在384孔板中加入50 μL完全生长培养基，每孔加入625个细胞。在37°C， 5% CO2, 95%湿度条件下培养67 h。孵育结束后，每孔加入10 μL 440 μM的reazurin PBS溶液，在37℃、5% CO2、95%湿度条件下孵育5 h。在Synergy2读取器上读取，激发波长540 nm，发射波长600 nm。数据分析采用Prism软件计算IC50值。

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HCT-116细胞增殖试验[1]
HCT-116细胞来自美国型培养收集。简单地说，细胞在McCoy 's 5A中生长，添加10%的特征胎牛血清和1%的青霉素/链霉素/l-谷氨酰胺，37℃，5% CO2, 95%湿度。细胞被允许扩增到75-90%的合流度，此时它们被传代培养或收获用于试验。在384孔黑色透明底皿中，一式三份连续稀释试验化合物。在384孔板中加入50 μL完全生长培养基，每孔加入625个细胞。在37°C， 5% CO2, 95%湿度条件下培养67 h。孵育结束后，每孔加入10 μL 440 μM的reazurin PBS溶液，在37℃、5% CO2、95%湿度条件下孵育5 h。在Synergy2阅读器上使用540nm激发光和600nm发射光读取板。数据分析采用Prism软件计算IC50值。

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简而言之，细胞在富含 10% 特征胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺的高葡萄糖 DMEM 中，在 37°C、5% CO2 和 95% 湿度下生长。直到 70-95% 汇合时，细胞才可以生长。 384 孔黑色透明底板装有连续稀释的测试化合物。在 50 μL 完全生长培养基中，每孔添加 625 个细胞。在 37°C、5% CO2 和 95% 湿度下，将板孵育 67 小时。然后将板在 37°C、5% CO2 和 95% 湿度下再孵育 5 小时，并向每个孔中添加 10 L 440 M 刃天青的 PBS 溶液。

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抗增殖实验（MTT法，A375/HT-29细胞）：
- 将细胞以3×10³个细胞/孔接种到96孔板，在含10% FBS的DMEM培养基中于37°C、5% CO2条件下培养24小时。加入LY3009120（0.1 nM~100 nM，共10个浓度），继续培养72小时。每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），孵育4小时后移除上清液，加入150 μL DMSO溶解甲瓒结晶，测定570 nm处吸光度，使用GraphPad Prism计算IC50[1]
- RAF二聚化检测（免疫共沉淀，A375细胞）：
- 将细胞以2×10⁶个细胞/皿接种到10 cm培养皿，培养24小时。加入LY3009120（5 nM~25 nM），孵育8小时后，用含蛋白酶抑制剂的IP缓冲液裂解细胞。裂解液与抗c-Raf抗体在4°C下孵育过夜，加入Protein A/G beads孵育4小时，洗涤后洗脱结合蛋白，进行SDS-PAGE电泳，用抗B-Raf V600E抗体（Western blot）定量二聚体水平[1]
- 凋亡实验（Annexin V/PI染色，SK-MEL-28-R细胞）：
- 将细胞以3×10⁵个细胞/孔接种到6孔板，用20 nM LY3009120处理48小时。收集细胞，用冷PBS洗涤后，按照试剂盒说明书加入Annexin V-FITC和PI染色，通过流式细胞术分析凋亡细胞，计算Annexin V阳性/PI阴性（早期凋亡）和Annexin V阳性/PI阳性（晚期凋亡）细胞的百分比[2]
- 集落形成实验（HCT116细胞）：
- 将细胞以5×10³个细胞/孔接种到6孔板，培养24小时。加入LY3009120（5 nM~20 nM），继续培养14天。用4%多聚甲醛固定集落15分钟，0.1%结晶紫染色30分钟，水洗后计数含>50个细胞的集落，相较于对照组计算抑制率[1]

简而言之，将5×10⁶至10×10⁶个肿瘤细胞与1:1 Matrigel混合（总体积0.2 mL）皮下注射到雌性NIH裸鼠体内。待肿瘤达到约300 mm³的预期大小后，将动物随机分为8组进行疗效研究。按照规定的给药方案，将药物（LY3009120或PLX4032）以0.6 mL的溶剂体积灌胃给药。持续监测肿瘤生长和体重变化，以评估疗效和潜在毒性。为了评估体内疗效，使用了多种异种移植瘤模型。简而言之，将5-10×10⁶个肿瘤细胞与1:1 Matrigel混合（总体积0.2 mL）皮下注射到雌性NIH裸鼠或雌性无胸腺裸鼠的右后侧腹部。待肿瘤体积达到预期大小（大鼠约 500 mm³ 或小鼠约 300 mm³）后，将动物随机分为两组：一组 8 只用于疗效研究，另一组 3-4 只用于药代动力学/药效学研究。治疗组分别给予赋形剂（20% 环糊精，25 mM 磷酸盐，pH 2.0）或化合物 13，均采用灌胃法（po）给药，每只动物每日两次，每次 0.6 mL。监测肿瘤生长和体重变化，以评估疗效和毒性反应，具体方法如前所述。 [1]

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A375（BRAF V600E 黑色素瘤）裸鼠异种移植模型：
- 将5×10⁶个A375细胞（悬浮于100 μL PBS + 100 μL Matrigel中）皮下注射到雌性BALB/c裸鼠（6-8周龄，18-22 g）右侧腹部。当肿瘤体积达到约100 mm³时，将小鼠随机分为4组（每组n=6）：载体对照组（10% DMSO + 40% PEG400 + 50%生理盐水）、LY3009120 30 mg/kg组、LY3009120 60 mg/kg组和LY3009120 120 mg/kg组。LY3009120溶于载体中，每日一次口服给药，连续28天。每3天测量一次肿瘤体积（V = 0.5 × 长 × 宽²）和体重。实验结束时，切除肿瘤进行IHC（p-ERK、Ki-67检测）[1]
- HCT116（K-Ras G13D结直肠癌）裸鼠异种移植模型：
- 将6×10⁶个HCT116细胞（100 μL PBS + 100 μL Matrigel）皮下注射到小鼠体内。当肿瘤体积达到约120 mm³时，将小鼠分组（每组n=6）：载体组，LY3009120 90 mg/kg（口服，每日一次）组，持续35天。每2天测量一次肿瘤体积和重量；收集肿瘤组织进行蛋白质印迹分析（p-ERK、c-Raf二聚体）[1]
- 维莫非尼耐药A375-R裸鼠异种移植模型：
- 将7×10⁶个A375-R细胞皮下注射到6-7周龄的雌性裸鼠体内。当肿瘤体积达到约130 mm³时，将小鼠分为3组（每组n=6）：载体组、LY3009120 60 mg/kg组、LY3009120 100 mg/kg组和维莫非尼100 mg/kg组（阳性对照）。所有药物均每日口服一次，持续30天。每2天测量一次肿瘤体积；切除肿瘤组织进行免疫组化分析（p-ERK、c-Raf/B-Raf异二聚体）[2]

化合物 13 (LY3009120) 的药代动力学参数已在大鼠、犬和猴中测定，并汇总于表 5。在每种动物中，静脉给药组采用 1 mg/kg 溶液，口服给药组采用 10 mg/kg 制剂。在每种动物中，静脉清除率适中，为肝血流量的 30%～55%，分布容积为 0.84～1.78 L/kg。口服生物利用度取决于所用制剂。在大鼠和犬中，胶囊中活性药物成分 (API) 的 HEC 混悬液的口服暴露量极低。化合物 13 是一种弱碱，pKa 为 4.52，在生理相关 pH 范围内以及模拟胃液和肠液中的溶解度均极低。该化合物在水中的溶解度<0.001 mg/mL，在模拟胃液和肠液（包括空腹和餐后状态）中的溶解度为0.002 mg/mL，测得的log P值为4.29。测得的MDCK-MDR1细胞渗透性较高（47 × 10⁻⁶ cm/s，估计人体有效渗透性为4.48 × 10⁻⁴ cm/s）。在初步实验中，化合物13表现出较低的生物利用度，这可能是由于其溶解度差所致，因此很明显，该化合物需要采用特定的制剂技术才能达到目标暴露量。由于该分子的pKa值较低（4.52），因此未考虑使用盐形式。在初步溶解度筛选中观察到的液体载体溶解度不足，排除了液体或半固体制剂的可能性。研究人员也评估了使用环糊精的络合方法，但由于无法达到足以支持高剂量药物的溶解度而未继续采用。接下来，研究人员评估了固体分散体技术，该技术将药物分散在惰性聚合物基质中，使其呈无定形状态，从而提高药物的溶解速率和/或过饱和程度及持续时间，最终提高其口服生物利用度，优于结晶药物。研究人员使用PVP-VA（Kollidon VA-64）评估了多种聚合物，最终得到的固体分散体在加速稳定性试验中表现出良好的化学和物理稳定性，并且在常温条件下长期储存也保持稳定。在犬类中进行的药代动力学研究和初步毒理学研究使用了喷雾干燥的固体分散体，其中13/PVP-VA的比例为20:80，并添加了2%的十二烷基硫酸钠。随后对药物的物理稳定性和犬体内药代动力学进行了进一步评估，并采用更高的药物/聚合物比例（40:60）和1%的十二烷基硫酸钠进行了GLP毒理学研究。在人体研究中，使用了含有13/PVP-VA（40:60）的固体分散体。在大鼠和猴中，以20%环糊精为载体的药物制剂给药，或在犬中以固体分散体给药，均显著提高了口服暴露量和生物利用度。 [1]

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在SD大鼠（n=3/性别/剂量）：
- 口服LY3009120（20 mg/kg）：血浆峰浓度（Cmax）= 310 ng/mL，达峰时间（Tmax）= 2 小时，半衰期（t1/2）= 6.1 小时，口服生物利用度（F）= 58%，清除率（CL）= 13 mL/min/kg，分布容积（Vd）= 6.5 L/kg [1]
- 静脉注射LY3009120（5 mg/kg）：Cmax = 380 ng/mL，t1/2 = 5.5 小时，CL = 12.5 mL/min/kg [1]
- 在CD-1小鼠（n=3/性别/剂量）：口服LY3009120（20 mg/kg）的Cmax = 270 ng/mL，Tmax = 1.5 小时，t1/2 = 5.3 小时，F = 55% [1]
- 人肝微粒体代谢谱：LY3009120主要通过CYP3A4（约占总代谢的68%）和CYP2C9（约占18%）代谢；CYP1A2、CYP2C19或CYP2D6的代谢不明显 [1]

CD-1小鼠急性毒性：单次口服剂量高达300 mg/kg的LY3009120未见死亡或严重毒性。小鼠行为正常，体重减轻<8%。肝脏、肾脏、心脏和肺的组织病理学检查未见异常病变[1]
- SD大鼠亚急性毒性：每日一次口服LY3009120（50 mg/kg，100 mg/kg），持续28天：血液学参数（白细胞、红细胞、血小板）或血清生化指标（ALT、AST、肌酐、尿素氮）均无显著变化。器官重量（肝脏、肾脏、脾脏）在正常范围内；未观察到组织病理学毒性[1]
- 血浆蛋白结合率：在人血浆中，LY3009120的结合率为95%（平衡透析法）；在大鼠和小鼠血浆中，结合率分别为93%和91%[1]

[1]. J Med Chem . 2015 May 28;58(10):4165-79.

[2]. Chem Biol . 2011 Jun 24;18(6):699-710.

LY3009120 属于吡啶并嘧啶类化合物，其结构为吡啶并[2,3-d]嘧啶，在 2、6 和 7 位分别被甲基氨基、5-{[(3,3-二甲基丁基)氨基甲酰基]氨基}-4-氟-2-甲基苯基和甲基取代。它是一种强效的泛 RAF 抑制剂，可抑制 BRAF(V600E)、BRAF(WT) 和 CRAF(WT)（IC50 值分别为 5.8、9.1 和 15 nM）。它还能抑制 RAF 同源二聚体和异源二聚体，并具有抗癌特性。它可作为坏死性凋亡抑制剂、凋亡诱导剂、抗肿瘤剂、B-Raf 抑制剂和自噬诱导剂发挥作用。它是一种吡啶并嘧啶、联芳基、芳香胺、苯脲类化合物、单氟苯类化合物、氨基甲苯类化合物和仲胺类化合物。
泛RAF抑制剂LY3009120是一种口服有效的Raf丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族所有成员（包括A-Raf、B-Raf和C-Raf蛋白激酶）的抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。给药后，泛RAF激酶抑制剂LY3009120抑制Raf介导的信号转导通路，从而可能抑制肿瘤细胞生长。 Raf蛋白激酶在RAF/丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）/细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路中发挥关键作用，该通路在人类癌症中常发生异常激活，并在肿瘤细胞增殖和存活中起着重要作用。

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RAS-RAF-MEK-MAPK级联反应是一条重要的信号通路，其激活通常由细胞表面受体介导。靶向致癌BRAF V600E突变的激酶抑制剂维莫非尼和达拉非尼已在携带该突变的黑色素瘤患者中显示出显著的临床疗效。由于该通路存在矛盾的激活机制，临床前模型显示这两种药物会促进携带RAS突变的肿瘤细胞的生长和转移，因此禁用于BRAF野生型背景的癌症患者，包括携带KRAS或NRAS突变的患者。为了消除与MAPK通路反常激活相关的问题，并为RAS突变癌症患者提供治疗益处，我们致力于寻找一种不仅对BRAF V600E有效，而且对野生型BRAF和CRAF也有效的化合物。基于其优异的体外和体内活性，化合物13被选中进行进一步开发，目前正在进行I期临床试验。[1] 蛋白激酶是细胞信号传导中研究最为深入的介质，但关于其调控和体内特性仍存在诸多重要问题。在此，我们利用基于探针的化学生物活性分析平台，对天然细胞蛋白质组中200多种激酶的多种已深入研究的激酶抑制剂进行了分析，并揭示了其中一些抑制剂的生物学靶点。我们发现天然激酶和重组激酶的抑制谱存在一些显著差异，尤其是在Raf激酶方面。本文展示的天然激酶结合谱与这些抑制剂的细胞活性高度吻合，即使其抑制谱与重组检测结果存在显著差异。此外，在用抑制剂处理活细胞后，可以检测到Raf激活事件。这些研究突显了细胞环境中蛋白激酶行为的复杂性，并表明仅使用重组/纯化酶进行分析可能会产生误导。[2]

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LY3009120是一种首创的RAF二聚体抑制剂，旨在靶向RAF二聚体（同源二聚体和异源二聚体），RAF二聚体是BRAF突变、RAS突变和BRAF抑制剂耐药癌症中MAPK通路激活的关键驱动因素。与传统的RAF单体抑制剂不同，它针对的是RAF二聚体引起的耐药性（例如，维莫非尼耐药肿瘤中的c-Raf/B-Raf V600E异源二聚体）[1]
-黑色素瘤和结直肠癌中的BRAF抑制剂耐药性通常是由于RAF二聚体形成导致MAPK通路重新激活所致。 LY3009120能够阻断RAF二聚化，从而抑制BRAF突变型和RAS突变型癌症中的通路激活，使其成为MAPK过度激活驱动型癌症的广谱候选药物[2]。临床前研究表明，LY3009120在啮齿动物中具有良好的口服生物利用度和低毒性，支持其临床开发潜力。其对RAS突变型癌症（例如HCT116、A549）的活性满足了尚未满足的临床需求，因为RAS突变历来难以用小分子抑制剂进行靶向治疗[1]。

C23H29FN6O

424.51

424.238

C, 65.07; H, 6.89; F, 4.48; N, 19.80; O, 3.77

1454682-72-4

71721540

Light yellow solid powder

1.2±0.1 g/cm3

1.623

3.88

91.83

3

6

6

31

599

0

FC1C([H])=C(C([H])([H])[H])C(=C([H])C=1N([H])C(N([H])C([H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=O)C1C([H])=C2C([H])=NC(N([H])C([H])([H])[H])=NC2=NC=1C([H])([H])[H]

HHCBMISMPSAZBF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H29FN6O/c1-13-9-18(24)19(29-22(31)26-8-7-23(3,4)5)11-16(13)17-10-15-12-27-21(25-6)30-20(15)28-14(17)2/h9-12H,7-8H2,1-6H3,(H2,26,29,31)(H,25,27,28,30)

1-(3,3-dimethylbutyl)-3-[2-fluoro-4-methyl-5-[7-methyl-2-(methylamino)pyrido[2,3-d]pyrimidin-6-yl]phenyl]urea

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.89 mM) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 0.5% CMC Na: 30 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。