Mdivi-1 (Mitochondrial division inhibitor 1)   中文名称: 发动蛋白相关蛋白 1 (Drp1) 抑制剂；线粒体分裂/线粒体自噬抑制剂

Drp1/dynamin-related protein 1

Mdivi-1 的 EC50 估计值为 1–10 μM，并以剂量依赖性方式抑制 Dnm1 GTPase 活性。 Mdivi-1 会导致 Dnm1 GTP 水解中 GTP 的 Hill 系数增强，以及 GTP 表观 K0.5 的增加和 GTP 水解表观 Vmax 的降低 [1]。诱导细胞凋亡后，用 Mdivi-1 处理的细胞表现出细胞色素 c 释放减少和磷脂酰丝氨酸暴露减少，这与细胞凋亡抑制和其他使用其他策略破坏 DRP1 活性的研究一致 [2]。在缺血性视网膜中，Mdivi-1 诱导细胞凋亡[3]。

mdivi-1 在体内靶向线粒体裂变 DRP、Dnm1。 Mdivi-1 在与其对体内线粒体裂变的影响相当的浓度范围内定量阻断 GMPPCP 依赖性 Dnm1 自组装 [1]。在正常小鼠视网膜中，Mdivi-1（50 mg/kg，腹腔注射）显着降低 GFAP 蛋白的表达 [3]。
Drp1和GFAP蛋白表达在缺血小鼠视网膜的早期神经退行性事件(12小时内)中显著升高。Mdivi-1治疗可阻断缺血视网膜中凋亡细胞的死亡，并显著提高缺血后2周的RGC存活率。在正常小鼠视网膜中，Drp1在神经节细胞层(GCL)以及内丛状层、内核层(INL)和外丛状层(OPL)中表达。在GCL中，RGCs中Drp1的免疫反应性较强。而在12小时时，Drp1蛋白表达在处理过的缺血视网膜的GCL中升高。Mdivi-1处理没有改变Drp1蛋白表达的增加，但显著降低了GFAP蛋白表达。 结论:这些发现提示急性IOP升高后Drp1活性的改变可能是导致缺血视网膜RGC死亡的生化级联的重要组成部分。[3]

GTP水解: 使用连续再生试验来测量Dnm1的GTP酶活性(Ingerman和Nunnari, 2005)。动力学参数的测定采用25 mM HEPES、25 mM PIPES、pH 7、150 mM NaCl、30 mM咪唑、pH 7.4、7.5 mM KCl、5 mM MgCl2、1 mM磷酸(烯醇)丙酮酸酯(PEP)、20 U/mL丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶、4%二甲基亚砜(DMSO)和600 μM NADH。化学抑制剂和GTP浓度按规定变化。在含有小分子的GTPase实验反应缓冲液中加入大约10 μg的纯化蛋白，开始GTPase实验反应。所有GTPase测定反应在200µL的体积中开始，其中150µL放置在96孔板的孔中。通过读取反应的A340来监测NADH的消耗，使用SpectraMAX 250 96孔板读取器每20秒测量一次，总共40分钟。将分光光度数据转移到Excel中，并将测量的NADH随时间的稳态损耗转换为蛋白质活性。利用Mathcad的Genfit函数，对K0.5、Km、kcat、Ki、Hill系数等动力学参数进行数值计算。[1]

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MOMP测定:按照描述的方法对分离的线粒体进行外膜渗透(Chipuk等，2005)。从3个月以下雌性小鼠的C57Bl/6肝脏中，采用均匀均质和差速离心纯化重膜组分(线粒体)。在MOMP实验中，线粒体在线粒体分离缓冲液(MIB: 200 mM甘甘醇，68 mM蔗糖，10 mM hepe - koh pH 7.4, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.1% BSA)加或减bh3蛋白或肽中孵育90分钟。对于药物抑制研究，在加入蛋白之前，线粒体与指定的化合物预孵育30分钟。然后将反应分离成上清和颗粒，5500 x g离心5分钟，通过SDSPAGE和抗细胞色素c的western blot分析。为了进行MOMP重构研究，从polydidc处理的mxre bak- / - baxf / -动物的肝脏中分离出重膜组分。[1]

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LUV渗透试验:按照描述制备大单层囊泡(LUV)释放试验(Kuwana et al.， Cell 2002)。简单地说，脂质干燥并在水浴声呐中重悬于含有荧光素共轭葡聚糖(10kD)的缓冲液中。用挤压机将悬浮液通过孔径为400 nm的过滤器挤压形成单层囊泡。未掺入的右旋糖酐在蔗糖梯度中通过浮上离心去除。脂质体在缓冲液中重悬，与重组蛋白(全长单体BAX, Suzuki et al.， Cell 2000)和化学物质在室温下孵育2.5小时。用0.1µ孔大小的膜过滤，在滤液中以荧光形式检测释放的葡聚糖。在缓冲对照提供的基线和脂质体在1% CHAPS中溶解获得的100%释放之间计算释放百分比。[1]

Yeast actin morphology/酵母肌动蛋白形态:细胞分别用DMSO、100 μM mdivi-1或100 μM mdivi-1和200 μM Latrunculin-A处理。如所述(Adams and Pringle, 1991)，使用Alexa flu488 phalloidin可视化F-actin，并使用DeltaVision反褶积显微镜成像。[1]
Yeast plate growth assay/酵母平板生长试验:在YPGlycerol平板上覆盖10 ml含有1%低熔琼脂和75 μM mdivi-1的YPGlycerol, 12小时后用48孔钉钉装置对细胞进行定位。细胞固定后，在24°C或37°C孵育，使用Eagle Eye II成像系统成像。[1]
Staurosporine A刺激细胞凋亡后，mdivi-1部分阻断细胞色素c释放。将HeLa细胞置于覆盖片上37℃、5% CO2的DMEM中培养过夜，然后用DMSO、1μM Staurosporine (STS) + DMSO或1μM STS + 50 μm mdivi-1孵育4小时。在徕卡共聚焦显微镜下，用抗细胞色素c和次级山羊抗小鼠Alexa flu488间接免疫荧光观察细胞色素c。[1]

C57BL/6 mice received injections of mdivi-1 (50 mg/kg) or vehicle, and then transient retinal ischemia was induced by acute IOP elevation. RGC survival was measured after FluoroGold labeling. Drp1 and glial fibrillary acidic protein (GFAP) protein expression and distribution were assessed at 12 hours after ischemia-reperfusion by Western blot and immunohistochemistry. Apoptotic cell death was assessed by TUNEL staining.[3]

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Dissolved in DMSO; 50 mg/kg; i.p. injection

C57BL/6 mice

[1]. Chemical inhibition of the mitochondrial division dynamin reveals its role in Bax/Bak-dependent mitochondrial outer membrane permeabilization. Dev Cell. 2008 Feb;14(2):193-204.

[2]. A chemical inhibitor of DRP1 uncouples mitochondrial fission and apoptosis. Mol Cell. 2008 Feb 29;29(4):409-10.

[3]. A selective inhibitor of drp1, mdivi-1, increases retinal ganglion cell survival in acute ischemic mouse retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011 Apr 27;52(5):2837-43.

Mitochondrial fusion and division play important roles in the regulation of apoptosis. Mitochondrial fusion proteins attenuate apoptosis by inhibiting release of cytochrome c from mitochondria, in part by controlling cristae structures. Mitochondrial division promotes apoptosis by an unknown mechanism. We addressed how division proteins regulate apoptosis using inhibitors of mitochondrial division identified in a chemical screen. The most efficacious inhibitor, mdivi-1 (for mitochondrial division inhibitor) attenuates mitochondrial division in yeast and mammalian cells by selectively inhibiting the mitochondrial division dynamin. In cells, mdivi-1 retards apoptosis by inhibiting mitochondrial outer membrane permeabilization. In vitro, mdivi-1 potently blocks Bid-activated Bax/Bak-dependent cytochrome c release from mitochondria. These data indicate the mitochondrial division dynamin directly regulates mitochondrial outer membrane permeabilization independent of Drp1-mediated division. Our findings raise the interesting possibility that mdivi-1 represents a class of therapeutics for stroke, myocardial infarction, and neurodegenerative diseases.[1]

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DRP1, a member of the dynamin family of large GTPases, mediates mitochondrial fission. In a recent issue of Developmental Cell, Cassidy-Stone et al. (2008) identified mdivi-1, a new DRP1 inhibitor that prevents mitochondria division and Bax-mediated mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis.[2]

C15H10CL2N2O2S

353.22

351.984

C, 51.00; H, 2.85; Cl, 20.07; N, 7.93; O, 9.06; S, 9.08

338967-87-6

3825829

White to light brown solid powder

1.6±0.1 g/cm3

522.5±60.0 °C at 760 mmHg

289 °C

269.8±32.9 °C

0.0±1.4 mmHg at 25°C

1.729

3.85

82.92

1

3

2

22

465

0

O=C1N(C2=C(Cl)C=C(Cl)C(OC)=C2)C(S)=NC3=C1C=CC=C3

NZJKEVWTYMOYOR-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C15H10Cl2N2O2S/c1-21-13-7-12(9(16)6-10(13)17)19-14(20)8-4-2-3-5-11(8)18-15(19)22/h2-7H,1H3,(H,18,22)

3-(2,4-dichloro-5-methoxyphenyl)-2-thioxo-2,3-dihydroquinazolin-4(1H)-one

Mdivi-1; Mitochondrial Division Inhibitor 1; Mdivi 1; 3-(2,4-dichloro-5-methoxyphenyl)-2-sulfanyl-4(3H)-quinazolinone; Mitochondrial division inhibitor 1; Mdivi 1; Mdivi1.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 4 mg/mL (11.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 40.0 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 5% DMSO +40% PEG 300 +ddH2O: 7mg/mL

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配方 3 中的溶解度: 2.5 mg/mL (7.08 mM) in 0.5% CMC-Na/saline water (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: 10 mg/mL (28.31 mM) in 17% Polyethylene glycol 12-hydroxystearate in Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。