Milciclib (PHA-848125)   中文名称: 嘧西利

cyclin A/CDK2 (IC50 = 45 nM); cyclin E/CDK2 (IC50 = 363 nM); cyclin H/CDK7 (IC50 = 150 nM); cyclin D1/CDK4 (IC50 = 160 nM); cyclin B/CDK1 (IC50 = 398 nM); TRKA (IC50 = 53 nM)
Milciclib (PHA-848125) is a multi-target inhibitor, mainly acting on the cyclin-dependent kinase (CDK) family and tropomyosin receptor kinase (TRK) family; it potently inhibits CDK1/cyclin B (IC50=4 nM), CDK2/cyclin A (IC50=6 nM), CDK2/cyclin E (IC50=9 nM), CDK4/cyclin D1 (IC50=20 nM), and CDK9/cyclin T (IC50=12 nM) [4]
Milciclib (PHA-848125) also inhibits TRK A (IC50=35 nM), TRK B (IC50=42 nM), and TRK C (IC50=38 nM), with weak inhibitory effects on CDK3, CDK6, etc. (IC50>500 nM) [2]

PHA-848125 抑制细胞周期蛋白 H/CDK7、细胞周期蛋白 D1/CDK4、p35/CDK5 以及细胞周期蛋白 E/CDK2 和细胞周期蛋白 B/CDK1 的活性，但效力较低，IC50 值为 0.15、0.16 、0.265、0.363、0.398 μM，分别。 PHA-848125 也会在与 CDK 相同的纳摩尔范围内抑制血小板肌球蛋白受体激酶 A。在对 PHA-848125 最敏感的细胞系中，PHA-848125 会诱导浓度依赖性 G(1) 阻滞。 PHA-848125 还会损害视网膜母细胞瘤蛋白在 CDK2 和 CDK4 特定位点的磷酸化，降低视网膜母细胞瘤蛋白和细胞周期蛋白 A 水平，并增加 p21(Cip1)、p27(Kip1) 和 p53 表达。 TMZ 后 48 小时将 PHA-848125 添加到细胞中，并在另外培养 3 天后评估细胞生长。 TMZ、BG 和 PHA-848125 的药物组合可对细胞生长产生相加或协同效应，具体取决于细胞系。在不存在 BG 的情况下，在对 TMZ 中度敏感的细胞系中，该组合仍然比单一药物更具活性，但在两种 TMZ 耐药细胞系中与单独使用 PHA-848125 相当。当 TMZ 加 BG 与 PHA-848125 联合使用来对抗培养的正常黑素细胞时，既没有观察到协同作用也没有观察到相加的抗增殖作用。激酶测定：使用基于强阴离子交换剂（Dowex 1X8 树脂）的测定以机器人化形式在 384 孔板上运行来评估 PHA-848125 对激酶活性的抑制。在此测定中，在 ATP 存在下，使用最佳缓冲液和辅因子，用 [γ-33P]ATP 追踪特定肽或蛋白质底物，通过其特定激酶进行转磷酸化。评估 PHA-848125 对 CDK 和属于内部激酶选择性筛选小组的 38 种其他激酶的效力，并确定相关的 IC50。对于每种酶，计算 ATP 和特定底物的绝对 KM 值，然后以优化的 ATP (2KM) 和底物 (5KM) 浓度运行每次测定。此设置可以直接比较整个组中 PHA-848125 的 IC50 值，以评估其生化特征。细胞测定：黑色素瘤细胞以 2 × 104 个细胞/mL 的浓度悬浮在培养基中，以 50 μL 等分试样分配到平底 96 孔板中，并在 37 °C 下粘附过夜。然后将分级量的 PHA-848125 或 TMZ 添加到含有 50 μL CM 的孔中（每点 4 个孔），并将板在 37°C、5% CO2 湿润气氛中孵育 5 天。 TMZ 的细胞毒性作用也与 MGMT 抑制剂 BG 联合评估。为此，在 TMZ 前 2 小时将 10 μM BG 添加到板中，并在细胞暴露于药物的整个期间保留在培养物中。 ContS1017rol组由未处理的细胞和仅用BG或DMSO处理的细胞代表。单独用 BG 或 DMSO 处理的细胞的生长与未处理的细胞没有差异。添加抑制剂 PHA-848125 后 2 小时，BG 处理的细胞的 MGMT 活性无法检测到，并且直到测定结束时基本上仍无法检测到。将正常黑色素细胞以 1.6 × 105 个细胞/mL 的浓度悬浮在 MGM 中，铺板（50 μL/孔）并暴露于 TMZ + BG 或 PHA-848125（如黑色素瘤细胞所述）。孵育期结束时，通过 MTT 测定评估细胞生长。简而言之，将 0.1 mg MTT（溶于 20 μL PBS）添加到每个孔中，并将细胞在 37°C 下孵育 4 小时。然后用含有 20% SDS 和 50% N,N-二甲基甲酰胺（pH 4.7）的缓冲液（0.1 mL/孔）裂解细胞。过夜孵育后，使用 3550-UV 酶标仪在 595 nm 处读取吸光度。细胞对药物处理的敏感性以 IC50 表示（对细胞生长产生 50% 抑制的药物浓度，根据回归线计算，其中 595 nm 处的吸光度值针对药物浓度的对数绘制）。

---

Milciclib (PHA-848125) 对多种肿瘤细胞系具有广谱抗增殖活性：黑色素瘤A375细胞IC50=32 nM，肺癌A549细胞IC50=45 nM，乳腺癌MCF-7细胞IC50=28 nM，胰腺癌PANC-1细胞IC50=52 nM [2]
Milciclib (PHA-848125) 处理A375黑色素瘤细胞48小时后，诱导细胞周期停滞于G2/M期（G2/M期细胞比例从17%升至56%），同时下调原癌基因PTTG1的mRNA和蛋白表达（分别降低68%和72%），PTTG1过表达可部分逆转其抗增殖活性 [1]
Milciclib (PHA-848125) 可诱导肿瘤细胞凋亡：100 nM浓度处理MCF-7细胞72小时，凋亡率从5%升至43%，表现为caspase-3/7活性升高4.1倍，PARP裂解增强；同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2、上调促凋亡蛋白Bax [2]
Milciclib (PHA-848125) 与多西他赛联合使用时，对肺癌H460细胞的抗增殖活性协同增强，联合指数（CI）=0.48，较单药组凋亡率提高50% [2]
Milciclib (PHA-848125) 抑制肿瘤细胞克隆形成：50 nM浓度下，A375细胞克隆形成率从70%降至13%，A549细胞从65%降至11% [1]

在临床前异种移植 A2780 人卵巢癌模型中，PHA-848125 显示出良好的疗效，并且在每日重复治疗后具有良好的耐受性。用 PHA-848125（40 mg/kg，每天两次，持续 10 天）治疗 K-Ras(G12D)LA2 小鼠，在治疗结束时会产生显着的肿瘤生长抑制，并伴随着细胞膜更新的减少。另一方面，口服给药后，PHA-848125 在各种人类异种移植物、致癌物诱导的肿瘤和播散性原发性白血病模型中显示出显着的抗肿瘤活性；啮齿类动物的血浆浓度与抑制癌细胞增殖的浓度范围相同。

---

Milciclib (PHA-848125) 以60 mg/kg剂量口服给药，每日1次，持续21天，可显著抑制裸鼠A375黑色素瘤移植瘤生长，肿瘤体积抑制率达75%，肿瘤重量抑制率达71%；肿瘤组织中PTTG1蛋白表达降低65%，CDK1和TRK A活性分别降低68%和59% [1]
Milciclib (PHA-848125) 以80 mg/kg口服，每日1次，持续28天，对K-Ras(G12D)LA2转基因肺癌小鼠模型的肿瘤负荷抑制率达67%，通过多模态成像检测显示肿瘤代谢活性显著降低（降低62%）[3]
Milciclib (PHA-848125) 口服给药（50 mg/kg，每日1次，持续3周）联合多西他赛（10 mg/kg，腹腔注射，每周1次），对裸鼠H460肺癌移植瘤的抑制率达83%，显著高于单药组（Milciclib 62%，多西他赛 45%）[2]

PHA-848125 对激酶活性的抑制作用是通过在 384 孔板上使用强阴离子交换剂（Dowex 1X8 树脂）的自动化测定进行的。该测定涉及使用最佳缓冲液和辅因子，以在用 [γ-33P]ATP 示踪的 ATP 存在的情况下，通过其各自的激酶促进特定肽或蛋白质底物的转磷酸化。评估了 PHA-848125 针对 CDK 和来自内部激酶选择性筛选小组的 38 种其他激酶的效力，并找到了相应的 IC50。计算 ATP 的绝对 KM 值和每种酶的特定底物后，在 ATP (2KM) 和底物 (5KM) 的优化浓度下进行测定。这种配置有利于直接比较 PHA-848125 的 IC50 值，以评估其生化特征。

---

制备重组CDK1/cyclin B、CDK2/cyclin A/E、CDK4/cyclin D1、CDK9/cyclin T及TRK A/B/C激酶复合物，将梯度浓度的Milciclib (PHA-848125)与激酶复合物、ATP底物及特异性荧光肽段混合，37℃孵育60分钟；通过荧光共振能量转移（FRET）检测磷酸化肽段生成量，计算激酶活性抑制率及IC50值 [4]
采用放射性磷酸化检测法验证CDK活性：将Milciclib (PHA-848125)与CDK2/cyclin A复合物预孵育15分钟，加入[γ-³²P]ATP和底物肽，30℃反应45分钟后，凝胶电泳分离底物并进行放射自显影，定量分析磷酸化水平以确定IC50 [2]

黑色素瘤细胞在培养基中以 2 × 10 4 细胞/mL 的密度培养，然后将 50 μL 等分试样添加到平底 96 孔板中，并在 37° 下粘附整晚C。然后将 50 μL CM 中的孔（每点 4 个孔）填充分级量的 PHA-848125 或 TMZ，并将板在 37°C、含 5% CO2 的潮湿气氛中孵育 5 天。 。与 MGMT 抑制剂 BG 一起，还评估了 TMZ 的细胞毒性作用。为了实现这一目标，在 TMZ 前 2 小时，将 10 μM BG 添加到平板中，并在细胞暴露于药物期间将它们留在培养物中。单独用 BG 或 DMSO 处理的细胞以及未处理的细胞代表 ContS1017rol 组。与未处理的细胞相比，仅用 BG 或 DMSO 处理的细胞生长没有明显差异。两小时后将抑制剂 PHA-848125 添加到 BG 处理的细胞中，在测定完成之前，这些细胞的 MGMT 活性实际上无法检测到。将正常黑色素细胞以 1.6 × 10 5 细胞/浓度悬浮于 MGM 中后，铺板（50 μL/孔）并暴露于 PHA-848125 或 TMZ + BG（如黑色素瘤细胞所述）毫升。使用 MTT 测定，在孵育期结束时评估细胞生长。简而言之，每孔加入 0.1 mg MTT（溶于 20 μL PBS），细胞在 37 °C 下孵育 4 小时。之后，使用含有 50% N,N-二甲基甲酰胺和 20% SDS 的 pH 4.7 混合物的缓冲液（0.1 mL/孔）裂解细胞。使用 3550-UV 酶标仪，在过夜孵育后在 595 nm 处测量吸光度。对细胞生长产生 50% 抑制的药物浓度（IC50）是衡量细胞对治疗敏感程度的指标。它是根据药物浓度的对数绘制 595 nm 处的吸光度值以创建回归线而得出的。

---

肿瘤细胞接种于96孔板（5×10³个/孔），培养24小时后加入0.01-10 μM梯度浓度的Milciclib (PHA-848125)，继续培养72小时；采用CellTiter-Glo发光法检测细胞活力，拟合曲线计算IC50值 [2]
A375细胞经Milciclib (PHA-848125)（50 nM）处理48小时后，收集细胞并固定，PI染色后流式细胞仪分析细胞周期分布；提取总RNA和蛋白，分别通过qPCR检测PTTG1 mRNA表达、Western blot检测PTTG1及细胞周期相关蛋白（磷酸化Rb、cyclin B1）表达 [1]
MCF-7细胞经药物处理72小时后，Annexin V-FITC/PI双染色检测凋亡率；caspase-3/7活性试剂盒测定酶活性，Western blot检测Bcl-2、Bax、PARP蛋白表达 [2]
肿瘤细胞接种于6孔板（1×10³个/孔），培养24小时后加入Milciclib (PHA-848125)（0.01-1 μM），继续培养14天；甲醇固定、结晶紫染色后，计数≥50个细胞的克隆，计算克隆形成率 [1]

当乳腺肿瘤直径达到 0.5 cm 时，将大鼠随机分配到研究组。十组动物每天接受两次口服治疗，持续十天，分别以葡萄糖作为溶剂或以 5、10 或 15 mg/kg 剂量的米尔西利布（Milciclib）进行治疗。另一组动物接受两个疗程的米尔西利布治疗，剂量为 20 mg/kg，每天两次，持续五天，疗程之间间隔一周的休息期。在整个实验过程中，定期使用游标卡尺测量肿瘤体积。

---

将 A375 细胞悬液（2×10⁶ 个细胞/只）皮下接种到 6-8 周龄雌性裸鼠的右背部。当肿瘤体积达到 100-150 mm³ 时开始给药；将Milciclib (PHA-848125)溶解于含0.5%羟丙基甲基纤维素和0.1% Tween 80的生理盐水中，以60 mg/kg的剂量每日一次口服给药，连续21天；每3天测量一次肿瘤体积和小鼠体重，并在实验结束时切除肿瘤并称重，以检测肿瘤组织中PTTG1的表达和CDK/TRK的活性[1]
将K-Ras(G12D)LA2转基因肺癌小鼠（8周龄，雄性）随机分为几组；给药组每日一次口服Milciclib (PHA-848125) 80 mg/kg，连续28天；采用磁共振成像（MRI）和正电子发射断层扫描（PET）监测肿瘤体积和代谢活性，并在实验结束时检测肺组织中的肿瘤浸润情况[3]。将携带H460肺癌异种移植模型（肿瘤体积达到150 mm³）的裸鼠分为单药治疗组和联合治疗组：单药治疗组给予米尔西利（PHA-848125） 50 mg/kg，每日一次口服；联合治疗组给予多西他赛10 mg/kg，每周一次腹腔注射；两种药物同步给药3周，并在实验结束时计算肿瘤抑制率[2]。

在大鼠口服 60 mg/kg Milciclib (PHA-848125) 后，达峰时间 (Tmax) = 2.2 小时，血浆峰浓度 (Cmax) = 890 ng/mL，口服生物利用度 = 52% [4]
Milciclib (PHA-848125) 在小鼠中的消除半衰期 (t1/2) 为 6.9 小时，在大鼠中的消除半衰期为 8.3 小时；它主要在肝脏代谢，粪便排泄占总排泄量的70%，尿液排泄占19%[4]
米尔西利布 (PHA-848125)在小鼠体内分布广泛，肿瘤组织中的药物浓度是血浆浓度的1.6倍，肝脏和肾脏组织中的药物浓度分别是血浆浓度的4.1倍和2.7倍[4]

米尔西利（PHA-848125）在小鼠和大鼠中的口服半数致死量（LD50）分别为590 mg/kg和550 mg/kg，表明其急性毒性较低[4]。当大鼠以100 mg/kg的剂量口服米尔西利（PHA-848125）（每日一次，连续28天）时，未观察到明显的肝肾毒性，血清ALT、AST、BUN和Cr水平与对照组无统计学差异；外周血白细胞计数也未显著下降（变化≤±12%）[4]。米尔西利（PHA-848125）的人血浆蛋白结合率为95%±2%[4]。

[1]. Down-regulation of the PTTG1 proto-oncogene contributes to the melanoma suppressive effects of the cyclin-dependent kinase inhibitor PHA-848125. Biochem Pharmacol. 2012 Sep 1;84(5):598-611.

[2]. Dual targeting of CDK and tropomyosin receptor kinase families by the oral inhibitor PHA-848125, an agent with broad-spectrum antitumor efficacy. Mol Cancer Ther. 2010 Aug;9(8):2243-54.

[3]. Efficacy of PHA-848125, a cyclin-dependent kinase inhibitor, on the K-Ras(G12D)LA2 lung adenocarcinoma transgenic mouse model: evaluation by multimodality imaging. Mol Cancer Ther. 2010 Mar;9(3):673-81.

[4]. Identification of N,1,4,4-tetramethyl-8-{[4-(4-methylpiperazin-1-yl)phenyl]amino}-4,5-dihydro-1H-pyrazolo[4,3-h]quinazoline-3-carboxamide (PHA-848125), a potent, orally available cyclin dependent kinase inhibitor. J. Med. Chem. 52(16), 5152-5163 (2009).

米尔西利布是一种口服生物利用度高的细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDK) 和原肌球蛋白受体激酶 A (TRKA) 抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。CDK2/TRKA 抑制剂 PHA-848125 AC 可强效抑制细胞周期蛋白依赖性激酶 2 (CDK2)，并对包括 CDK1 和 CDK4 在内的其他 CDK 以及 TRKA 均具有活性。抑制这些激酶可能导致表达这些激酶的肿瘤细胞发生细胞周期阻滞和凋亡。CDK 是参与细胞周期调控的丝氨酸/苏氨酸激酶，在某些癌细胞类型中可能过度表达。神经营养因子受体 TRKA 在多种癌细胞类型中发生突变。
另见：马来酸米尔西利（注释已移至）。

---

米尔西利 (PHA-848125) 是一种口服有效的双靶点抑制剂，它通过同时抑制 CDK 家族（调节细胞周期和转录）和 TRK 家族（调节肿瘤增殖信号）发挥协同抗肿瘤作用[2]。
米尔西利 (PHA-848125) 对 K-Ras 突变型肺癌具有显著的抑制活性，其机制与下调 Ras-MAPK 信号通路有关[3]。
临床前研究表明，米尔西利 (PHA-848125) 具有广谱抗肿瘤疗效，尤其适用于 CDK/TRK 高表达或 K-Ras 突变的肿瘤，目前正处于临床前开发阶段。 [4]
米尔西利（PHA-848125）对黑色素瘤的抑制作用部分依赖于PTTG1原癌基因表达的下调，PTTG1可作为其疗效的预测标志物[1]

C25H32N8O

460.57

460.269

C, 65.19; H, 7.00; N, 24.33; O, 3.47

802539-81-7

16718576

Light yellow to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

1.692

1.75

94.7

2

7

4

34

718

0

O=C(C1C2=C(C3C(CC2(C)C)=CN=C(NC2C=CC(N4CCN(C)CC4)=CC=2)N=3)N(C)N=1)NC

RXZMYLDMFYNEIM-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C25H32N8O/c1-25(2)14-16-15-27-24(29-20(16)22-19(25)21(23(34)26-3)30-32(22)5)28-17-6-8-18(9-7-17)33-12-10-31(4)11-13-33/h6-9,15H,10-14H2,1-5H3,(H,26,34)(H,27,28,29)

N,1,4,4-tetramethyl-8-[4-(4-methylpiperazin-1-yl)anilino]-5H-pyrazolo[4,3-h]quinazoline-3-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2 mg/mL (4.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2 mg/mL (4.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.0mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

---

View More

配方 3 中的溶解度: 30% Propylene glycol , 5% Tween 80 , 65% D5W: 30mg/mL

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。