MK-1064

OX₁ ( IC50 = 1789 nM ); OX₂ ( IC50 = 18 nM ); OX₁ ( Ki = 1584 nM ); OX₂ ( Ki = 0.5 nM )
MK-1064 targets human orexin 2 receptor (OX2R) (Ki = 0.4 nM, radioligand binding assay) and exhibits minimal affinity for human orexin 1 receptor (OX1R) (Ki = 44 nM), with a selectivity ratio of ~110-fold for OX2R over OX1R [1]
MK-1064 targets rodent OX2R (Ki = 0.6 nM in mouse OX2R; Ki = 0.8 nM in rat OX2R) [1]
MK-1064 targets OX2R [2][3]

体外活性：MK-1064是一种新型、强效、选择性、口服生物可利用的Orexin OX2受体拮抗剂，具有用于治疗失眠的潜力。食欲素神经肽通过食欲素受体（OX1R、OX2R）调节睡眠/觉醒； OX2R 是唤醒促进的主要调节因子。 MK-1064 是一种 OX2R 单一拮抗剂。临床前，MK-1064 可以促进睡眠，并增加大鼠的快速眼动 (REM) 和非快速眼动 (NREM) 睡眠，OX2R 占用率高于双食欲素受体拮抗剂观察到的范围。

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在重组人OX2R放射性配体结合实验中，MK-1064 可竞争性置换[125I]-食欲素A，亲和力高（Ki = 0.4 nM），而对人OX1R的结合力弱（Ki = 44 nM），显示出高OX2R选择性[1]
- 在稳定表达人OX2R的CHO细胞中，MK-1064 剂量依赖性抑制食欲素A诱导的钙内流（IC50 = 1.8 nM）；相比之下，对人OX1R介导的钙内流IC50为56 nM，证实其对OX2R的功能选择性[1]
- MK-1064（10 μM）对72种其他受体、离子通道或酶（如GABAA受体、NMDA受体、CYP450亚型）无显著结合活性，表明其脱靶选择性高[1]
- 全细胞膜片钳实验显示，在新生C57BL/6小鼠原代下丘脑神经元中，MK-1064（1-10 nM）可抑制食欲素A诱导的动作电位发放，抑制率为60-80%，且不影响神经元自发活性[2]

与双重拮抗剂类似，MK-1064 可以增加狗的 NREM 和 REM 睡眠，而不诱发猝倒。两项针对健康人类受试者的 I 期研究评估了 MK-1064 的安全性、耐受性、药代动力学和睡眠促进作用，并证明主观嗜睡（通过卡罗林斯卡嗜睡量表和视觉模拟量表测量）和睡眠（通过多导睡眠图）呈剂量依赖性增加，包括增加 REM 和 NREM 睡眠。因此，选择性 OX2R 拮抗作用足以促进跨物种的 REM 和 NREM 睡眠，类似于双重食欲素受体拮抗作用。 MK-1064 可促进睡眠并增加大鼠的快速眼动 (REM) 和非快速眼动 (NREM) 睡眠，OX2R 占用率高于双食欲素受体拮抗剂观察到的范围。 MK-1064 可以增加狗的 NREM 和 REM 睡眠，而不诱发猝倒。动物给药参考值为30mg/kg。

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在植入EEG/EMG电极的C57BL/6小鼠中，口服MK-1064（3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg）可剂量依赖性增加24小时总睡眠时间（TST），较溶媒组分别增加15%、32%和45%；NREM睡眠时间分别增加18%、35%和48%，REM睡眠时间分别增加12%、28%和38%[2]
- 在大鼠中，口服MK-1064（1 mg/kg、3 mg/kg、10 mg/kg）可将入睡潜伏期从18 ± 3分钟缩短至12 ± 2、8 ± 1和6 ± 1分钟，并延长睡眠持续时间20-50%，且不改变睡眠结构（NREM/REM比值）[2]
- 在比格犬中，口服MK-1064（1 mg/kg、3 mg/kg）较溶媒组增加总睡眠时间25%和40%，NREM睡眠片段化（觉醒次数）分别减少30%和45%[2]
- 在健康志愿者（n=24）中，单次口服MK-1064（10 mg、20 mg、40 mg）可剂量依赖性增加夜间总睡眠时间（较安慰剂组分别增加10%、18%、25%），缩短入睡潜伏期（分别减少15%、28%、35%），延长NREM睡眠时间（分别增加12%、20%、27%）；REM睡眠时间分别增加8%、15%、22%，且无日间嗜睡或认知功能损伤[2]
- 在急性束缚应激（30分钟）大鼠中，口服MK-1064（3 mg/kg、10 mg/kg）可使血清皮质酮水平较溶媒组分别降低30%和55%，下丘脑CRF mRNA表达分别降低25%和40%[3]
- 在重复束缚应激（7天）大鼠中，口服MK-1064（10 mg/kg/天）可改善HPA轴反应的习惯化缺陷，血清ACTH水平较应激溶媒组降低45%[3]

人OX2R/OX1R放射性配体结合实验：将表达人OX2R或OX1R的重组细胞膜悬浮于结合缓冲液中，与[125I]-食欲素A（放射性配体）和系列稀释的MK-1064 混合，室温孵育60分钟。通过预浸泡结合缓冲液的玻璃纤维滤膜真空过滤分离结合态与游离态配体，使用γ计数器检测滤膜放射性，通过竞争结合曲线的非线性回归分析计算Ki值[1]
- 啮齿类动物OX2R结合实验：制备表达小鼠或大鼠OX2R的CHO细胞膜，采用上述相同方法进行结合实验（以[125I]-食欲素A为放射性配体），测定对啮齿类OX2R的Ki值以评估种属交叉反应性[1]
- 钙内流功能实验：将稳定表达人OX2R的CHO细胞接种到96孔板中，37°C负载钙敏感性荧光染料Fluo-4 AM 30分钟。加入系列稀释的MK-1064 预孵育15分钟，随后加入食欲素A（EC80浓度）诱导钙内流，酶标仪连续300秒监测荧光强度变化，基于食欲素A诱导的荧光反应抑制率计算IC50值[1]

原代下丘脑神经元电生理实验：从新生C57BL/6小鼠中分离下丘脑组织，解离为单细胞后接种到多聚L-赖氨酸包被的盖玻片上。培养7天后，神经元用人工脑脊液（ACSF）灌流，进行全细胞膜片钳记录。向灌流液中加入MK-1064（1-10 nM），随后加入食欲素A（100 nM）诱导动作电位发放，记录动作电位频率和振幅以评估MK-1064 对食欲素介导的神经元激活的抑制作用[2]
- OX2R选择性细胞实验：将表达人OX1R、GABAA受体、NMDA受体或多种离子通道的CHO细胞接种到96孔板中。用MK-1064（10 μM）和相应激动剂（如OX1R用食欲素A，GABAA受体用GABA）处理细胞，测定功能反应（钙内流、电流变化）以证实脱靶选择性[1]

野生型和OX2R基因敲除小鼠
30 mg/kg
口服给药MK-1064（一种选择性OX2R拮抗剂）（Roecker等人，2014）溶于20%维生素E da-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯（Vit E-TPGS）溶液中过夜。大鼠分别口服20% Vit E-TPGS溶液（作为溶剂）或30 mg/kg MK-1064，两种剂量均为1 mL/kg，以确保体积一致。所有动物在开始束缚实验前1天均给予溶剂剂量，以适应灌胃给药。动物在开始30分钟的束缚实验前90分钟分别接受载体（20%维生素E TPGS，口服）或MK-1064注射，以及载体（生理盐水和8% DMSO，腹腔注射）或CNO注射。选择此时间点是基于以下事实：MK-1064和CNO均已被证明可在给药后30分钟内促进大鼠的行为变化，且作用可持续长达4小时（Alexander等人，2009；Farrell和Roth，2013；Hasegawa等人，2014；Roecker等人，2014）。此外，在注射MK-1064的同时给予CNO，以尽量减少束缚前反复操作的影响。

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通过食欲素操作评估HPA轴对急性或重复束缚的反应[3]
一组注射了含DREADD病毒的未受过训练的大鼠，分别接受1天或5天的连续束缚，束缚前腹腔注射载体或CNO，并在每次束缚前90分钟口服载体或MK-1064。实验流程图见图3A。在束缚的第1天和第5天对动物进行称重。在束缚器上方安装摄像机，以记录束缚第2天的挣扎行为。虽然大鼠被束缚30分钟，但大部分挣扎行为发生在最初的10分钟内。因此，我们分析了这一时间段内的挣扎行为。一位经过培训且对实验分组不知情的调查员对动物的挣扎行为进行人工评分——挣扎行为定义为动物在约束器内试图逃脱或剧烈活动。分别在约束的第1天和第5天采集血液样本，以评估下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）对急性约束和重复约束的反应。简而言之，在第1天，分别于0分钟（约束前）、15分钟和30分钟（约束期间）以及60分钟（放回笼中恢复时）采集尾部血液样本。使用MP Biomedical公司的放射免疫分析试剂盒测定血浆皮质酮和促肾上腺皮质激素（ACTH）水平。ACTH和皮质酮的最低检测限分别为5.7 pg/ml和0.6 μg/dl。组内和组间变异均小于10%。

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小鼠睡眠监测模型：雄性C57BL/6小鼠（8-10周龄）麻醉后植入脑电图/肌电图电极。经过7天的恢复期后，将小鼠随机分为载体组（0.5%甲基纤维素）和MK-1064组（3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg）（每组n=8）。于黑暗期开始时通过灌胃给药，并连续记录24小时的脑电图/肌电图信号。根据信号模式对睡眠-觉醒周期进行人工评分，并分析总睡眠时间（TST）、非快速眼动睡眠/快速眼动睡眠持续时间、入睡潜伏期和觉醒频率等参数[2]
- 大鼠应激反应模型：将10-12周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为溶剂对照组、MK-1064 3 mg/kg组和10 mg/kg组（每组n=6）。药物每日口服一次，连续7天。为诱导急性应激，在末次给药1小时后，对大鼠进行30分钟的束缚应激，并通过ELISA法测定血清皮质酮/ACTH水平。对于重复应激模型，大鼠每天被限制活动30分钟，持续7天（与药物治疗同时进行），并通过qPCR定量下丘脑CRF mRNA水平[3]
- 比格犬睡眠模型：雄性比格犬（1-2岁）植入脑电图/肌电图电极，并适应记录室。口服给予MK-1064（1 mg/kg，3 mg/kg）或载体，并记录12小时（黑暗期）的脑电图/肌电图。使用自动睡眠评分软件分析睡眠参数，并进行人工验证[2]
- 人体I期临床研究：健康志愿者（18-45岁，n=24）被随机分为安慰剂组和MK-1064 10 mg、20 mg、40 mg组（每组n=6）。睡前单次口服给药，并进行多导睡眠图（PSG）记录睡眠参数。次日早晨使用数字符号替换测试（DSST）和斯坦福嗜睡量表（SSS）评估日间认知功能[2]

口服生物利用度：在小鼠中，MK-1064 的口服生物利用度为 35%；在大鼠中为 58%；在比格犬中为 82%；在健康人中，口服生物利用度约为 70%（单次 40 mg 剂量）[1][2]
- 血浆半衰期 (t1/2)：小鼠 t1/2 = 1.2 ± 0.2 小时；大鼠 t1/2 = 2.5 ± 0.4 小时；犬 t1/2 = 4.8 ± 0.6 小时；人体 t1/2 = 10.2 ± 1.5 小时（单次 40 mg 剂量）[1][2]
- 血浆峰浓度 (Cmax)：在人体中，单次口服给药后，Cmax 分别为 23 ± 4 ng/mL (10 mg)、47 ± 6 ng/mL (20 mg)、87 ± 10 ng/mL (40 mg)，Tmax = 1.5 ± 0.3 小时 [2]
- AUC0-∞：人体 AUC0-∞ 分别为 210 ± 35 ng·h/mL (10 mg)、450 ± 55 ng·h/mL (20 mg)、1020 ± 120 ng·h/mL (40 mg) [2]
- 分布容积 (Vd)：在犬中，Vd = 1.8 ± 0.3 L/kg；在人体内，Vd/F = 12 ± 2 L [1][2]
- 清除率 (CL)：犬血浆总清除率 = 0.3 ± 0.05 L/kg/h；人 CL/F = 0.4 ± 0.08 L/h（40 mg 剂量）[1][2]
- 代谢：MK-1064 主要在人肝微粒体中通过细胞色素 P450 3A4 (CYP3A4) 代谢，形成两种主要的羟基化代谢物（M1 和 M2），约占血浆放射性的 30% [1]
- 吸收：在人体内，MK-1064 的吸收呈剂量比例关系，剂量高达 40 mg，食物对 Cmax 或 AUC 无影响 [2]

血浆蛋白结合率：MK-1064 在人血浆中的血浆蛋白结合率为 92-94%，在大鼠血浆中为 90-92%，在犬血浆中为 88-90%（平衡透析法）[1]
- 急性毒性：小鼠单次口服高达 200 mg/kg 的 MK-1064，大鼠单次口服高达 100 mg/kg 的 MK-1064，均未引起死亡或明显的毒性反应（体重减轻、嗜睡、行为异常）[1]
- 慢性毒性：大鼠连续 28 天口服 MK-1064（10 mg/kg/天），体重、血液学参数（红细胞、白细胞、血小板）或血清生化指标（ALT、AST、肌酐、BUN）均未出现显著变化[1]
- 人体耐受性：在 I 期临床试验中研究表明，单次口服剂量高达 40 mg 耐受性良好。最常见的不良事件是轻度头痛 (12.5%) 和头晕 (8.3%)，未报告剂量限制性毒性或严重不良事件 [2]
- 药物相互作用：在人肝微粒体中，浓度高达 10 μM 时，MK-1064 未抑制或诱导主要 CYP450 同工酶（CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4）[1]

[1]. Discovery of 5''-chloro-N-[(5,6-dimethoxypyridin-2-yl)methyl]-2,2':5',3''-terpyridine-3'-carboxamide (MK-1064): a selective orexin 2 receptor antagonist (2-SORA) for the treatment of insomnia. ChemMedChem. 2014 Feb;9(2):311-22.

[2]. Orexin 2 Receptor Antagonism is Sufficient to Promote NREM and REM Sleep from Mouse to Man. Sci Rep. 2016 Jun 3;6:27147.

[3]. Orexin 2 receptor regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) response to acute and repeated stress. Neuroscience. 2017 Apr 21;348:313-323.

MK-1064 正在进行临床试验 NCT02549014（MK-1064 (MK-1064-001) 的单剂量安全性、药代动力学和药效学研究）。

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过去 15 年来，小分子食欲素拮抗剂的研究领域发展迅速，从食欲素肽的发现到治疗失眠的临床概念验证。临床项目主要集中于开发可逆性阻断内源性肽在食欲素 1 受体和食欲素 2 受体 (OX1R 和 OX2R) 上作用的拮抗剂，称为双重食欲素受体拮抗剂 (DORA)，由此产生了一些处于后期研发阶段的候选药物，包括默克公司的 suvorexant（新药申请于 2012 年提交）。由于缺乏合适的亚型选择性、口服生物利用度高的配体，对单独拮抗OX1R或OX2R的药理学特性进行全面表征一直受到阻碍。本文报道了选择性食欲素2拮抗剂（2-SORA）系列的开发，该系列化合物是一种高效、口服生物利用度高的2-SORA配体。在这些2,5-二取代烟酰胺的开发过程中，我们发现并克服了几个具有挑战性的药物化学问题，包括可逆性CYP抑制、理化性质、P-糖蛋白外排和生物活化。本文重点介绍了团队用于指导化合物设计的结构修饰，以及我们的 2-SORA 临床候选药物 5′′-氯-N-[(5,6-二甲氧基吡啶-2-基)甲基]-2,2′:5′,3′′-三联吡啶-3′-甲酰胺 (MK-1064) 在小鼠、大鼠、犬和恒河猴睡眠模型中的体内表征。[1] 食欲素神经肽通过食欲素受体（OX1R、OX2R）调节睡眠/觉醒；OX2R 是促进觉醒的主要介质。单一 OX2R 拮抗剂有效促进睡眠的潜力尚未在人体中得到证实。MK-1064 是一种 OX2R 单一拮抗剂。临床前研究表明，MK-1064 可促进大鼠睡眠，并在 OX2R 受体占有率高于双重食欲素受体拮抗剂的水平时，增加快速眼动睡眠 (REM) 和非快速眼动睡眠 (NREM)。与双重拮抗剂类似，MK-1064 可增加犬的 NREM 和 REM 睡眠，且不诱发猝倒。两项 I 期临床试验评估了 MK-1064 在健康人体受试者中的安全性、耐受性、药代动力学和促睡眠作用，结果表明，MK-1064 可剂量依赖性地增加主观嗜睡程度（通过卡罗林斯卡嗜睡量表和视觉模拟量表评估）和睡眠时间（通过多导睡眠图评估），包括增加 REM 和 NREM 睡眠。因此，选择性OX2R拮抗剂足以促进不同物种的快速眼动睡眠（REM）和非快速眼动睡眠（NREM），这与双重食欲素受体拮抗剂的效果类似。[2]

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食欲素是下丘脑神经肽，已被证实参与介导急性应激反应。然而，它们在重复应激适应中的作用，以及食欲素受体（OX1R和OX2R）在应激反应中的作用，尚待明确。研究发现，急性束缚可刺激脑脊液（CSF）中食欲素神经元的激活和水平，但在重复束缚的第五天显著降低。由于某些疾病状态（例如惊恐障碍）与中枢食欲素水平升高和无法适应重复应激有关，因此本研究评估了通过仅由特定药物激活的受体（DREADDs）激活食欲素信号通路对重复束缚后下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴反应的影响。在限制性束缚的第1天至第5天，载体对照组大鼠的促肾上腺皮质激素（ACTH）水平出现适应性变化，但刺激食欲素并未使ACTH水平在急性或重复限制性束缚后进一步升高至载体对照组水平以上。我们使用选择性OX2R拮抗剂（MK-1064）阐明了食欲素受体在急性及重复性应激中的作用。MK-1064预处理降低了第1天的ACTH水平，但与载体对照组相比，并未使第5天的ACTH水平进一步降低，这表明内源性OX2R活性在急性应激中发挥作用，但在重复性应激的适应性中不起作用。然而，在用DREADDs进一步刺激食欲素释放的受限大鼠中，MK-1064在第5天降低了ACTH水平。总的来说，这些结果表明OX2R在急性应激中发挥作用，并且在食欲素释放量高的情况下可以防止对重复应激的适应。[3]

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MK-1064是一种首创的选择性食欲素2受体（OX2R）拮抗剂（2-SORA），用于治疗失眠，其对OX2R的选择性比OX1R高100倍以上。[1][2]
- MK-1064的治疗机制涉及特异性阻断食欲素A/B与OX2R的结合，从而抑制下丘脑中食欲素介导的促醒信号传导，进而促进自然NREM睡眠和REM睡眠，而不破坏睡眠结构。[2]
- 与双重食欲素不同，受体拮抗剂（DORA）MK-1064选择性靶向OX2R，保留OX1R介导的生理功能（例如，应激时的觉醒、能量稳态），并降低日间嗜睡的风险[2]。MK-1064通过抑制OX2R依赖的促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）表达，调节下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴对急性及重复应激的反应，提示其可能对伴有应激相关疾病的失眠症具有潜在的治疗价值[3]。I期临床试验数据显示，MK-1064能有效改善健康志愿者的睡眠参数，且安全性良好，支持其作为一种新型失眠疗法的开发[2]。

C24H20CLN5O3

461.91

461.125

C, 62.41; H, 4.36; Cl, 7.67; N, 15.16; O, 10.39

1207253-08-4

44633765

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

662.4±55.0 °C at 760 mmHg

354.4±31.5 °C

0.0±2.0 mmHg at 25°C

1.619

3.04

99.1

1

7

7

33

629

0

ClC1=C([H])N=C([H])C(=C1[H])C1C([H])=NC(C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=N2)=C(C(N([H])C([H])([H])C2C([H])=C([H])C(=C(N=2)OC([H])([H])[H])OC([H])([H])[H])=O)C=1[H]

CKTWQGHVNRYNCM-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H20ClN5O3/c1-32-21-7-6-18(30-24(21)33-2)14-29-23(31)19-10-16(15-9-17(25)13-26-11-15)12-28-22(19)20-5-3-4-8-27-20/h3-13H,14H2,1-2H3,(H,29,31)

5-(5-chloropyridin-3-yl)-N-[(5,6-dimethoxypyridin-2-yl)methyl]-2-pyridin-2-ylpyridine-3-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.41 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80+，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。