| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 5mg |
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| 10mg |
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| 25mg |
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| 50mg |
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| 100mg |
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| 250mg |
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| 500mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
APJ ( IC50 = 1.75 μM )
Apelin (APJ) receptor: Functionally antagonizes APJ, with >37-fold selectivity over the angiotensin II type 1 (AT1) receptor; shows no significant binding activity against 29 other GPCRs, except for <50% inhibition (I) at 10 μM against κ-opioid receptor and <70%I at 10 μM against benzodiazepinone receptor [1] - Apelin receptor (APLNR): Inhibits the apeliPLNR axis to suppress cholangiocarcinoma (CCA) growth [2] |
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| 体外研究 (In Vitro) |
体外活性：将细胞（血管紧张素 II 受体样 1 (AGTRL-1) 细胞系（DiscoveRx，目录号 93-0250C2））以 1000 个细胞/孔（1536 板，Corning）接种在 4 μL 中并培养过夜（16 -18 小时），37°C，5% CO2，100% 湿度，然后将 60 nL DMSO 对照或 2 mM DMSO 储备测试化合物转移到每个孔中，然后加入 2 μL 30 nM Apelin-13 至阴性对照和测试化合物孔，以及阳性对照孔中加入 2 μL 测定培养基（补充有 10% hi-FBS、1×青霉素/链霉素的 F12 营养混合物 HAM）。这样得到的测试化合物的最终浓度为 20 μM，最终 DMSO 为 1%。检测在室温下孵育 90 分钟，然后用 3 μL 检测试剂（PathHunter 检测试剂（DiscoveRx，目录号 93-0001））显色 60 分钟，并在 Perkin Elmer ViewLux 上读取发光读数。激酶测定：使用两种互补的 APJ 功能测定来评估 ML221 对 apelin-13 介导的 APJ 激活的拮抗作用；抑制 cAMP 和募集 β-arrestin。在两种测定中，增加 ML221 的浓度会拮抗固定浓度的 Ap13 (EC80 = 10 nM)，计算出的 IC50 在 cAMP 测定中等于 0.70 μM，在 β-arrestin 测定中等于 1.75 μM。细胞测定：根据制造商的说明（Phoenix Pharmaceuticals, INC.），使用 Apelin-36（人）EIA 试剂盒，从 H69 和选定的 CCA 细胞系的上清液（37°C 孵育 48 小时）测量 Apelin 水平。根据方案一式三份制备未稀释的样品（50 mL）。在微孔板分光光度计（VersaMax，Molecular Devices，Sunnyvale，CA）上测量 450 nm 处的吸光度 OD。使用 PRISM® 软件 (GraphPad) 制作标准曲线并计算每个样品中 apelin 的浓度。数据表示为平均浓度±SEM。
APJ 拮抗活性检测：在 cAMP 实验和 β-抑制蛋白募集实验中，ML221 均能以浓度依赖性方式拮抗 Ap13 介导的 APJ 激活，实验数据以 Ap13 抑制率的平均值±标准误（mean ± SEM%）表示，并采用四参数逻辑斯蒂模型拟合剂量-效应曲线 [1] - GPCR 选择性分析：10 μM 浓度的 ML221 对 29 种受试 GPCR 无显著结合活性，仅对 κ-阿片受体（抑制率<50%）和苯二氮䓬酮受体（抑制率<70%）表现出微弱活性 [1] - 胆管癌细胞增殖抑制：通过实时定量聚合酶链反应（rtPCR，n=5）检测发现，ML221 可剂量依赖性降低 Mz-ChA-1 胆管癌细胞中增殖标志物（Ki-67、PCNA）的基因表达。在划痕愈合实验中，10 μM 浓度的 ML221 可在 6、12、24 和 48 h 显著抑制 Mz-ChA-1 细胞的增殖和迁移，但处理 24 h 后对细胞侵袭能力无显著影响 [2] - 胆管癌血管生成因子抑制：rtPCR（n=5）结果显示，ML221 可剂量依赖性降低 Mz-ChA-1 细胞中血管生成因子（VEGF-A、Ang-1、Ang-2）的基因表达。在 HuH-28 和 SG231 胆管癌细胞系中，10 μM 浓度的 ML221 可显著下调 Ki-67 及血管生成因子（VEGF-A、VEGF-C、Ang-1、Ang-2）的基因表达 [2] - 对正常胆管细胞的影响：在正常 H69 胆管细胞中，10 μM 浓度的 ML221 处理 24 h 后，可上调 Ki-67 基因表达，但显著下调血管生成因子（VEGF-A、VEGF-C、Ang-1、Ang-2）的表达（rtPCR 检测）[2] |
| 体内研究 (In Vivo) |
将八周龄的雄性 BALB/c 裸鼠 (nu/nu) 饲养在温度和光照受控的环境中，可自由获取饮用水和啮齿动物食物。将 300 万个 Mz-ChA-1 细胞悬浮在细胞外基质凝胶中，并皮下注射到这些裸鼠的后侧。通过尾静脉注射每周 3 次对小鼠进行 ML221 (150 μg/kg) 治疗，持续 4 周。使用电子卡尺每周测量肿瘤生长3次，体积测定如下：肿瘤体积(mm 3 )=长度(mm)×宽度(mm)×高度(mm)。允许肿瘤生长直至达到 Baylor Scott & White Healthcare IACUC 肿瘤负荷政策规定的最大允许肿瘤负荷。治疗4周后，用戊巴比妥钠（50mg/kg ip）对小鼠实施安乐死。使用购自 ScyTek Laboratories, INC 的 H&E 染色试剂盒进行苏木精和伊红 (H&E) 染色。通过阳性 IHC 染色和细胞角蛋白-19 (CK-19)（一种胆管细胞特异性标记物）的免疫印迹，证实肿瘤主要是 CCA 细胞。 IHC 和免疫印迹用于证明 APLNR、p-ERK 和 t-ERK 的表达。使用购自 abcam 的小鼠单克隆抗 α 微管蛋白抗体，将 α 微管蛋白用作相对对照。通过测量增殖标记物（PCNA、Ki-67）、血管生成标记物（VEGF-A、VEGF-C、Ang-1 和 Ang-2）和肿瘤进展标记物（Vimentin、MMP-9、MMP-3）（Qiagen）使用上述方案进行 rtPCR。
异种移植肿瘤生长抑制：将 Mz-ChA-1 胆管癌细胞接种于裸鼠（nu/nu）侧腹，建立肿瘤异种移植模型。治疗组（n=12）通过尾静脉注射给予 150 μg/kg 剂量的 ML221，对照组（n=9）不进行治疗。结果显示，ML221 可显著降低 Mz-ChA-1 肿瘤体积。肿瘤苏木精-伊红（H&E）染色显示治疗组与对照组存在差异；免疫印迹检测发现 ML221 治疗组肿瘤中 p-ERK 和 t-ERK 表达降低；rtPCR 检测显示增殖标志物（PCNA、Ki-67）、血管生成因子（VEGF-A、VEGF-C、Ang-1、Ang-2）及肿瘤进展标志物（波形蛋白、MMP-9、MMP-3）的基因表达均下调 [2] |
| 酶活实验 |
ML221 对 apelin-13 介导的 APJ 激活的拮抗作用通过两种互补的 APJ 功能测定进行评估：β-arrestin 募集和 cAMP 抑制。在两种测定中，增加 ML221 的浓度会拮抗固定浓度的 Ap13 (EC80 = 10 nM)，计算出的 IC50 在 cAMP 测定中等于 0.70 μM，在 β-arrestin 测定中等于 1.75 μM。
APJ 拮抗作用的 cAMP 实验：培养表达 APJ 的细胞，加入 Ap13（激活 APJ）和不同浓度的 ML221。通过检测细胞内 cAMP 水平，评估 ML221 对 Ap13 介导的 APJ 激活的抑制作用。实验数据以 Ap13 抑制率的平均值±标准误表示，并拟合四参数逻辑斯蒂曲线以确定浓度依赖性拮抗效应 [1] - APJ 拮抗作用的 β-抑制蛋白募集实验：使用表达 APJ 的细胞，检测 Ap13 诱导的 β-抑制蛋白募集。加入不同浓度的 ML221 后，定量分析 β-抑制蛋白募集程度。与 cAMP 实验类似，结果以 Ap13 抑制率的平均值±标准误表示，并拟合四参数逻辑斯蒂曲线 [1] - GPCR 结合选择性实验：检测 10 μM 浓度的 ML221 对 31 种 GPCR（包括 APJ、AT1、κ-阿片、苯二氮䓬酮受体及 29 种其他 GPCR）的结合活性。结合活性以抑制率（%I）量化，除对 κ-阿片受体（<50%I）和苯二氮䓬酮受体（<70%I）有微弱活性外，对其他受体均无显著活性 [1] |
| 细胞实验 |
bEnd 的扩增。与 ML221 (0-30 μM) 孵育 24 小时后，使用 BrdU 掺入测定和 MTT 测定对 3 个细胞进行评估。 bEnd 是一种小鼠内皮细胞系 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基，用 10% 热灭活胎牛血清增强，用于维持三个细胞。对于 MTT 和 BrdU 掺入测定，将细胞以 2.5 × 104/孔的密度接种在 24 孔培养板中。为了进行 BrdU 掺入测定，将 10 μM BrdU 添加到培养基中。 2小时后用4%多聚甲醛固定细胞10分钟。链霉亲和素异硫氰酸荧光素与生物素化的山羊抗小鼠 IgG 抗体相结合，可以实现一抗的可视化。要检测细胞核，请使用 Hoechst 33342。每个 Hoechst 阳性细胞的 BrdU 阳性细胞数用于计算 BrdU 掺入率。
细胞中 APJ 介导的激活抑制实验：培养表达 APJ 的细胞，以 Ap13 作为 APJ 激动剂，加入不同浓度的 ML221。在 cAMP 实验中，孵育后检测细胞内 cAMP 水平，评估 ML221 对 Ap13 诱导的 APJ 激活的抑制作用；在 β-抑制蛋白募集实验中，使用特异性检测激活型 GPCR 与 β-抑制蛋白结合的系统，量化 ML221 对 Ap13 介导的 β-抑制蛋白募集的影响。每个实验均重复进行，获取抑制率的平均值±标准误，并绘制剂量-效应曲线 [1] - 胆管癌细胞增殖及标志物分析实验：培养 Mz-ChA-1、HuH-28、SG231 胆管癌细胞及 H69 正常胆管细胞，加入不同浓度的 ML221（关键实验使用 10 μM 浓度），作用特定时间（基因表达检测为 24 h，划痕愈合实验为 6~48 h）。通过 rtPCR 检测增殖标志物（Ki-67、PCNA）和血管生成因子（VEGF-A、VEGF-C、Ang-1、Ang-2）的表达；采用划痕愈合实验，在细胞单层上制造划痕，多个时间点监测细胞迁移，评估增殖和迁移能力；使用侵袭实验试剂盒检测细胞侵袭能力，ML221 处理时间为 24 h [2] - APLNR 表达的免疫荧光和流式细胞术实验：固定 H69 和 Mz-ChA-1 细胞，用 APLNR 特异性抗体进行免疫荧光染色，观察 APLNR 的定位；流式细胞术实验中，收集细胞并与 APLNR 抗体孵育，分析并量化 APLNR 表达水平，比较胆管癌细胞与正常胆管细胞的差异 [2] - apelin 分泌的 ELISA 实验：收集胆管癌细胞（Mz-ChA-1、HuH-28、SG231）和 H69 细胞的培养上清液，使用 apelin 特异性 ELISA 试剂盒检测 apelin 浓度，比较恶性细胞与正常细胞的分泌水平 [2] |
| 动物实验 |
150 μg/kg; 3× weekly via tail vein injection for 4 weeks
Male BALB/c eight week old nude (nu/nu) mice Xenograft Tumor Model in Nude Mice: Nude (nu/nu) mice were used. Mz-ChA-1 CCA cells were injected into the flanks of the mice to establish tumor xenografts. Once tumors formed, the treatment group (n=12) received ML221 at a dose of 150 μg/kg via tail vein injection, while the control group (n=9) received no treatment. Tumor size was monitored regularly, and tumor volume was calculated. At the end of the experiment, mice were euthanized, and tumors were harvested. Harvested tumors were subjected to H&E staining (for histopathological analysis), immunoblotting (to detect CK-19, p-ERK, t-ERK expression), and rtPCR (to measure gene expression of proliferative, angiogenic, and tumor progression markers) [2] |
| 参考文献 | |
| 其他信息 |
4-硝基苯甲酸[4-氧代-6-[(2-嘧啶基硫代)甲基]-3-吡喃基]酯是一种硝基苯甲酸。
ML221（化学名称：4-氧代-6-((嘧啶-2-基硫代)甲基)-4H-吡喃-3-基 4-硝基苯甲酸酯）是通过对约330,600个化合物的MLSMR化合物库进行高通量筛选(HTS)发现的。其合成方法和构效关系(SAR)（基于曲酸骨架）也已报道[1]。 - apeliPJ系统是心血管稳态的关键调节因子，与心血管疾病的发病机制相关；它还在能量代谢和胃肠道功能中发挥作用。 ML221 作为一种强效的 APJ 功能拮抗剂，为研究该系统提供了一种工具[1]。胆管癌 (CCA) 的五年生存率较低。apeliPLNR 轴在 CCA 组织和细胞中过度表达（经 IHC、rtPCR、免疫荧光、流式细胞术和 ELISA 证实）。ML221 通过靶向该轴抑制 CCA 的生长，提示其具有作为新型 CCA 肿瘤靶向治疗药物的潜力[2]。 |
| 分子式 |
C17H11N3O6S
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|---|---|---|
| 分子量 |
385.04
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| 精确质量 |
385.037
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| 元素分析 |
C, 52.99; H, 2.88; N, 10.90; O, 24.91; S, 8.32
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| CAS号 |
877636-42-5
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| 相关CAS号 |
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| PubChem CID |
7217941
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| 外观&性状 |
Off-white to yellow solid powder
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| LogP |
3.372
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| tPSA |
153.41
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| 氢键供体(HBD)数目 |
0
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| 氢键受体(HBA)数目 |
9
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| 可旋转键数目(RBC) |
6
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| 重原子数目 |
27
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| 分子复杂度/Complexity |
646
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| 定义原子立体中心数目 |
0
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| SMILES |
O=C(C1C=CC([N+](=O)[O-])=CC=1)OC1C(=O)C=C(CSC2N=CC=CN=2)OC=1
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| InChi Key |
UASIRTUMPRQVFY-UHFFFAOYSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C17H11N3O6S/c21-14-8-13(10-27-17-18-6-1-7-19-17)25-9-15(14)26-16(22)11-2-4-12(5-3-11)20(23)24/h1-9H,10H2
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| 化学名 |
[4-oxo-6-(pyrimidin-2-ylsulfanylmethyl)pyran-3-yl] 4-nitrobenzoate
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| 别名 |
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
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| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
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|---|---|---|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
配方 1 中的溶解度: ≥ 2 mg/mL (5.19 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 2.5971 mL | 12.9857 mL | 25.9713 mL | |
| 5 mM | 0.5194 mL | 2.5971 mL | 5.1943 mL | |
| 10 mM | 0.2597 mL | 1.2986 mL | 2.5971 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
Representative dose response curve for ML221.Bioorg Med Chem Lett. 2012 Nov 1; 22(21): 6656–6660. |
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GPCR profiling panel forML221.Bioorg Med Chem Lett. 2012 Nov 1; 22(21): 6656–6660. |
A: Positive APLNR staining by IHC in four human CCA tissues (bottom row) compared to adjacent non-malignant liver tissues (top row).Cancer Lett.2017Feb 1;386:179-188. |
A: Treatment of benign human cholangiocytes (H69) with 10 μM of ML221 over 24 h increased Ki-67 gene expression, but significantly decreased expression of angiogenic factors (VEGF-A, VEGF-C, Ang-1, and Ang-2) via rtPCR. B. Treatment of HuH-28 cholangiocarcinoma cells with 10 μM of ML221 over 24 h significantly decreased Ki-67 gene expression, as well as angiogenic factors (VEGF-A, VEGF-C, Ang-1, and Ang-2) via rtPCR. C. Treatment of SG231 cholangiocarcinoma cells with 10 μM of ML221 over 24 h significantly decreased Ki-67 gene expression, as well as angiogenic factors (VEGF-A, VEGF-C, Ang-1, and Ang-2) via rtPCR. Cancer Lett.2017Feb 1;386:179-188. |
|---|
A: Apelin treatment promotes Mz-ChA-1 gene expression of Ki-67 and PCNA (left), whereas, ML221 treatment decreases Mz-ChA-1 gene expression of Ki-67 and PCNA in a dose dependent manner (n = 5) via rtPCR. B: Gene expression of angiogenic factors (VEGF-A, Ang-1, and Ang-2) is increased when Mz-ChA-1 cells are treated with increasing concentrations of apelin (left), whereas, gene expression is decreased with increasing concentrations of ML221, an APLNR antagonist (right) (n = 5) via rtPCR. C: 10 μM of ML221 treatment significantly decreases cell proliferation and migration at 6, 12, 24, and 48 h during wound-healing assay (* = P < 0.05). D: Mz-ChA-1 cell invasiveness did not significantly change following treatment with 10 μM of ML221 for 24 h compared to untreated control cells.Cancer Lett.2017Feb 1;386:179-188. |
A: Parenteral administration of ML221 in nu/nu mice decreases Mz-ChA-1 tumor size (bottom row) compared to untreated control tumors (top row). B: Mz-ChA-1 tumor volume significantly increases in untreated control tumors (n = 9) compared to ML221 treated tumors (n = 12). C: H&E staining of control (left) and ML221 treated (right) Mz-ChA-1 tumors isolated from nu/nu mice.
A: Immunoblots of protein isolated from control and ML221 treated Mz-ChA-1 tumors shows expression of CK-19. p-ERK and t-ERK expression is decreased in ML221 treated Mz-ChA-1 tumors compared to untreated Mz-ChA-1 tumors. B: Control and ML221 treated Mz-ChA-1 tumors demonstrate positive staining for CK-19, a cholangiocyte specific marker, shown by IHC. C: IHC shows positive staining for APLNR in control and ML221 treated Mz-ChA-1 tumors. D. Mz-ChA-1 tumors treated with ML221 demonstrated decreased gene expression of proliferative markers (PCNA, Ki-67), angiogenic factors (VEGF-A, VEGF-C, Ang-1, and Ang-2), and markers of tumor progression (Vimentin, MMP-9, MMP-3) via rtPCR. |
APJ antagonist-1
APJ receptor agonist 10 free base
Apelin agonist 2
APJ receptor agonist 10
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