Tovorafenib (MLN2480; TAK-580)

Raf kinase

MLN2480 在 BRAF 突变体和一些 RAS 突变体临床前癌症模型体内耐受的浓度下抑制 MAPK 通路信号传导[1]。在非常低的浓度下，它会激活磷酸化 MEK，而在较高浓度下，它会抑制同样的活性。研究发现，MLN-2480 的抑制作用在模型和遗传背景之间存在差异[2]。 MLN2480 和 TAK-733（一种在研变构 MEK 激酶抑制剂）的药物组合在细胞增殖测定中的体外测试显示出协同活性。此外，蛋白质印迹分析显示 MLN2480 如何逆转 MEK 响应 TAK-733 的反馈激活，从而导致更协调的 MAPK 通路抑制。 PRAK 仅被 MLN-2480 微弱抑制 [1][2]。

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Tovorafenib（MLN2480；BIIB-024；BSK1369；DAY-101；TAK-580；AMG-2112819）与naporafenib针对不同RAF亚型的效力比较[7]
为了更好地了解托vorafenib和naporafenib的RAF选择性，我们使用我们的TR-FRET实验测量了它们对上述RAF复合物的抑制作用。BRAFWT、BRAFV600E和CRAFSSDD在1 nM的浓度下检测，而CRAFWT和ARAFSSDD由于酶活性较低，分别在4 nM和10 nM的浓度下检测。ATP浓度为200 μM， WT MEK1底物浓度为250 nM。测量的IC50值和计算的Ki值如表1所示，其代表性的浓度-响应曲线如图2所示。[7]
Tovorafenib (MLN2480; BIIB-024; BSK1369; DAY-101; TAK-580; AMG-2112819)和naporafenib是最有效的CRAF抑制剂，对WT CRAF激酶的IC50值分别为94.2 nM和3.7 nM。对CRAFSSDD突变体的效价与对CRAFWT的效价基本相同（表1）。两种药物对BRAFWT和BRAFV600E的效价均为中等（托vorafenib对BRAFWT的效价为633 nM， naporafenib对BRAFWT的效价为13.4 nM），对ARAFSSDD的抑制作用弱得多。即使在10 μM的浓度下，Tovorafenib也不能完全抑制ARAFSSDD，这是我们在本实验中可以达到的最高抑制剂浓度。虽然tovorafenib和naporafenib在RAF亚型中共享效力趋势，但naporafenib对每种酶的效力至少比tovorafenib强一个数量级。先前关于naporafenib对纯化ARAF、BRAF和CRAF活性的研究报告的相对效力与我们观察到的相似，但IC50值明显较低（对CRAF为0.07 nM）（42）。本研究未提供反应条件，因此无法与我们的结果进行有意义的比较。[7]
Tovorafenib (MLN2480; BIIB-024; BSK1369; DAY-101; TAK-580; AMG-2112819)和naporafenib对CRAF和WT BRAF的抑制表明，这些RAF二聚体的抑制具有正协同性（图2）。使用四参数模型拟合这些曲线，允许可变Hill斜率，Hill斜率范围为- 2.6至- 3.2（表1）。这些值表明，tovorafenib和naporafenib对BRAF和CRAF二聚体的抑制具有显著的正协同性；也就是说，抑制剂与一个原聚体活性位点的结合增加了抑制剂与RAF二聚体中第二个原聚体结合的亲和力。我们在ARAFSSDD和BRAFV600E中都没有观察到这种效应，BRAFV600E在这个实验中是单体的（表1）。

MLN2480 在胰腺癌、肺癌、结肠癌和黑色素瘤的异种移植模型中表现出体内抗肿瘤活性[3]。 MLN-2480 (37.5 mg/kg) 在肿瘤异种移植模型中是可以耐受的。 SK-MEL-30 异种移植模型受益于 MLN-2480 (12.5 mg) 和 TAK-733 (1 mg/kg) 的组合，但这两种药物本身都没有太大影响[2]。

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剂量扩展阶段初步显示了Tovorafenib（MLN2480；BIIB-024；BSK1369；DAY-101；TAK-580；AMG-2112819）的疗效。在接受Q2D（每两日一次）RP2D（推荐二期剂量）治疗的BRAF突变阳性、未接受过RAF和MEK抑制剂治疗的16例患者中，8例（50%）观察到部分缓解。这种单药活性水平与类似情况下第一代药物的1期研究结果一致。 药代动力学（PK）分析表明，Tovorafenib（MLN2480；BIIB-024；BSK1369；DAY-101；TAK-580；AMG-2112819）具有中等快速吸收率，给药后总体中位Tmax为2-4小时。Q2D给药21天后的总体平均蓄积倍数为2.5倍。相比之下，在400 mg至800 mg剂量范围内，QW（每周一次）给药方案在体循环中基本未观察到明显蓄积。在测试的Q2D和QW剂量范围内，稳态AUC呈现近似剂量比例的增加。Tovorafenib的血浆终末半衰期（t1/2）约为70小时。[6]

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与单药MLN2480相比，Tovorafenib (MLN2480; BIIB-024; BSK1369; DAY-101; TAK-580; AMG-2112819)与 TAK-733 联用可抑制更广谱的RAS突变肿瘤模型生长（包括黑色素瘤和结直肠癌的原代人源肿瘤异种移植模型）。体外细胞增殖实验表明，该联合用药具有协同效应。蛋白质印迹分析证实，MLN2480能逆转TAK-733引起的MEK反馈激活，从而更协同地抑制MAPK通路。[2]

激酶抑制试验[7]
抑制实验采用改良的hrf KinEASE酪氨酸激酶测定试剂盒进行。而不是提供试剂盒底物，我们纯化MEK135-393和生物素化它（MEK-B）内部使用birA酶。使用HP300e分配器将抑制剂分配到黑色384孔板中，并归一化至每孔1%的DMSO最终浓度。试剂盒测定缓冲液中加入MEK1SASA:BRAFKD:14-3-3和MEK1SASA:CRAFSSDD:14-3-3的终浓度为1 nM的纯化RAF， MEK1SASA: CRAFKD:14-3-3的纯化RAF为4 nM， MEK1SASA:ARAFSSDD-14-3-3的纯化RAF为10 nM，纯化生物素化MEK-B的终浓度为250 nM。使用Multidrop combi分配器将补充的激酶缓冲液分配到384孔板中，并在室温下与抑制剂孵育40分钟，然后使用Multidrop combi分配器分配200 uM ATP引发反应。用添加XL665和PAb Anti-phospho MEK1/2-Eu的试剂盒检测缓冲液在室温下淬火30min。使用PHERAstar微孔板读取器在665和620 nm处测量FRET信号比，并使用GraphPad Prism进行处理，该Prism适合Hill Slope为- 1的三参数剂量响应模型和Hill Slope适合数据的四参数剂量响应模型。测定一式三份，独立进行三次。

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MLN2480（也称为 BIIB-024、TAK-580 和 AMG 2112819）是一种具有口服生物活性、有效且选择性的泛 Raf 激酶抑制剂，目前正在进行临床研究。在体内耐受的浓度下，MLN2480 会抑制某些 RAS 突变体和 BRAF 突变体临床前癌症模型中的 MAPK 通路信号传导。

在体外，MLN-2480 对野生型和 B-raf Val600Glu 均有效。在非常低的浓度下，MLN-2480 可激活磷酸化 MEK，但在较高浓度下，它会抑制相同的活性。高浓度的 MLN-2480 阻断人类恶性黑色素瘤 A-375 突变 B-raf Val600Glu 细胞系中的信号传导通路。研究发现 MLN-2480 的抑制作用因模型和遗传背景而异；它仅轻度抑制 PRAK。当 MLN-2480 和 TAK-733 在 NRAS 突变人类恶性黑色素瘤细胞系 (SK-MEL-2) 中组合时，观察到高水平的凋亡生物标志物。

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采用基于ATP的细胞活力检测法，研究Tovorafenib（MLN2480；BIIB-024；BSK1369；DAY-101；TAK-580；AMG-2112819）与TAK-733联用对一系列BRAF和RAS突变黑色素瘤及结直肠癌细胞系的协同效应。通过蛋白质印迹分析比较了不同敏感程度的细胞系中MAPK通路信号及反应标志物的变化。[2]

C57BL/6J 小鼠
\n12.5 mg/kg
灌胃

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\n\n托沃拉非尼（MLN2480；BIIB-024；BSK1369；DAY-101；TAK-580；AMG-2112819） 以片剂形式口服给药，患者在服药前后至少禁食2小时（饮水除外）。治疗将持续至疾病进展、出现不可接受的毒性或患者因任何其他原因停止治疗，最长疗程为12个月。如果确定患者能从持续治疗中获益，则治疗可持续超过 12 个月。\n
\n在剂量递增阶段，采用 3+3 设计评估了每日一次 (Q2D) 和每周一次 (QW) 给药方案下持续给药的托沃拉非尼 (MLN2480; BIIB-024; BSK1369; DAY-101; TAK-580; AMG-2112819)。在开始 QW 剂量递增之前，通过方案修订将初始 22 天的周期长度更改为 28 天，以提高临床可行性并更好地促进未来的联合用药研究。在方案修订之前入组的正在进行的 Q2D 剂量递增队列中的患者继续按照 22 天的周期方案进行治疗，直到该队列满员且所有患者均已接受剂量限制性毒性 (DLT) 评估。对于 Q2D 和 QW 方案，剂量递增均根据第一个治疗周期（22 天或 28 天）内 DLT 的发生率进行。DLT 定义为：持续 ≥ 7 天的 4 级中性粒细胞减少症；发热性中性粒细胞减少症（定义为 ANC ≤ 1000 个细胞/μL 且发热 ≥ 38.5 °C）或 ANC ≤ 1000 个细胞/μL 的 ≥ 3 级感染；4 级血小板减少症（血小板计数 < 25,000/μL）、需要输注血小板的托沃拉非尼相关性血小板减少症或需要就医的托沃拉非尼相关性出血；因任何毒性导致治疗延迟 ≥ 14 天。 ALT 和 AST 毒性（ALT 或 AST > 7.5 × ULN 持续超过 14 天，或 ALT 或 AST > 7.5 × ULN 并伴有总胆红素升高 > 3 × ULN [非梗阻所致]，无论持续时间长短）；非血液学毒性≥3级（以下情况除外：恶心、呕吐和腹泻，除非在充分的支持治疗措施下，这些症状持续≥3级超过3天[研究者可酌情决定，服用托沃拉非尼后出现恶心、呕吐或腹泻的患者可在后续给药前接受止吐或止泻药物治疗]）；孤立的≥3级实验室异常，在≤7天内恢复至≤1级，且无临床后遗症或无需治疗干预；≥3级疲乏，持续≤7天；除非肿瘤异常侵袭或转移，否则发生角化棘皮瘤或皮肤癌），前提是研究中心的研究者认为这些事件至少可能与研究治疗相关。最大耐受剂量（MTD）定义为在0/3或1/6的患者中产生剂量限制性毒性（DLT）的最高剂量水平。申办方与主要研究者根据具体情况，共同决定患者体内剂量递增是否合适。任何剂量减少的患者均不得进行剂量递增。
\n\nQ2D剂量递增阶段的起始剂量为20 mg，相当于猴毒理学研究中确定的最高非严重毒性剂量（HNSTD）的十分之一。剂量递增计划包括40 mg、80 mg、135 mg、200 mg和280 mg的剂量水平。一旦确定了Q2D托沃拉非尼的最大耐受剂量（MTD）和/或推荐II期剂量（RP2D），黑色素瘤患者将根据肿瘤基因型和治疗史（补充表S1）纳入6个Q2D黑色素瘤扩展队列之一（每个队列约16名患者）。此外，第七个Q2D队列计划招募足够数量的晚期实体瘤患者（约16例，不包括淋巴瘤），以确保12例患者完成方案规定的给药和PK评估（在第1周期内进行）。该研究最初旨在探索Q2D给药方案。随后，方案修订引入了计划中的QW剂量递增队列。将给药方案从Q2D改为QW预计可降低药物蓄积并提高Cmax，同时保持相似的稳态AUC。此外，假设Cmax的增加可能在给药间隔内的一段时间内提高通路抑制程度，而不会影响总体剂量密度。计划在28天周期的第1、8、15和22天给予每周一次（QW）给药，起始剂量为400 mg，随后在每个后续队列中剂量递增200 mg（即剂量分别为600 mg、800 mg和1000 mg），直至达到最大耐受剂量（MTD）/推荐II期剂量（RP2D）。一旦确定了Q2D托沃拉非尼（MLN2480；BIIB-024；BSK1369；DAY-101；TAK-580；AMG-2112819）的MTD和/或RP2D，并在进一步修订方案后，纳入了一个最多16例NRAS突变型皮肤黑色素瘤患者的扩展队列，这些患者此前未接受过RAF和MEK抑制剂治疗。 [6]

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\n\n\n安全性、药代动力学和药效学评估[6]
\n\n不良事件采用医学术语集（MedDRA）19.0版进行编码，并根据美国国家癌症研究所（NCI）不良事件通用术语标准（CTCAE）（4.03版）进行分级。治疗期间出现的不良事件（TEAE）的评估期为从首次给药至末次给药后30天，或至开始后续抗肿瘤治疗，以先发生者为准。基线评估后，研究者根据实体瘤疗效评价标准（RECIST 1.1版）每两个周期通过计算机断层扫描（CT）或磁共振成像（MRI）评估疗效。
\n在第1周期第1天和第21天（每日一次给药）或第1天和第22天（每周一次给药），采集托沃拉非尼（MLN2480；BIIB-024；BSK1369；DAY-101；TAK-580；AMG-2112819）给药前后的系列血样，用于血浆药代动力学（PK）分析。此外，对于每日一次给药方案的患者，在第9天和第15天（每日一次给药）或第8天和第15天（每周一次给药）采集给药前或谷浓度血样，以评估达到稳态所需时间。采用经验证的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法定量测定血浆中托沃拉非尼的浓度[24]。托沃拉非尼的浓度采用完全验证的生物分析方法（QPS 96-1116）测定，该方法在血浆中的定量下限为0.5 ng/mL。该生物分析方法采用蛋白质沉淀法从人血浆中提取托沃拉非尼及其稳定标记的内标，并在质谱分析中采用正离子模式。血浆浓度-时间分析采用非房室模型。血浆药代动力学参数采用经验证的Phoenix WinNonlin软件（6.3或更高版本，Pharsight公司，北卡罗来纳州罗利市）进行估算。末端半衰期根据以下公式计算：t1/2 = ln2/kel（kel 为消除速率常数，通过对数血浆浓度-时间曲线表观末端相中选定时间点进行线性回归分析确定）。\n
\n根据组织样本的可用性，药效学检测包括评估黑色素瘤剂量扩展队列患者配对活检样本（基线和第 21 天）中 pERK 的表达水平。染色水平由病理学家（根据 H 评分进行半定量测量）和定量图像分析进行评估。

吸收
托沃拉非尼稳态最大浓度 (Cmax) 为 6.9 µg/mL (23%)，浓度-时间曲线下面积 (AUC) 为 508 µgh/mL (31%)。达到托沃拉非尼稳态血药浓度所需时间为 12 天 (33%)。托沃拉非尼的暴露量与剂量呈正比增加。单次服用片剂或口服混悬液后，托沃拉非尼达到血浆峰浓度的中位时间 (Tmax) 为 3 小时（最小值，最大值）(1.5，4 小时)。与空腹状态相比，与高脂餐（总热量约 859 卡路里，脂肪含量 54%）同服片剂后，托沃拉非尼的 Cmax 和 AUC 未见临床意义上的显著差异，但 Tmax 延迟至 6.5 小时。
排泄途径
单次口服放射性标记的托沃拉非尼后，65% 的总放射性标记剂量经粪便排出（其中 8.6% 为原形），27% 的剂量经尿液排出（其中 0.2% 为原形）。
分布容积
托沃拉非尼的表观分布容积为 60 L/m² (23%)。它能穿过血脑屏障。
清除率
表观清除率为 0.7 L/h/m² (31%)。
代谢/代谢物
托沃拉非尼主要在体外通过醛氧化酶和 CYP2C8 代谢。CYP3A、CYP2C9 和 CYP2C19 对托沃拉非尼的代谢作用较弱。

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生物半衰期
托沃拉非尼的终末半衰期约为 56 小时（33%）。

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药代动力学 [6]
图 2 显示了第 1 个周期第 1 天和第 22 天，按 QW 剂量组划分的 托沃拉非尼 (MLN2480; BIIB-024; BSK1369; DAY-101; TAK-580; AMG-2112819) 的平均（± 标准差）血浆浓度-时间曲线；表4按剂量组总结了第1周期第22天的血浆药代动力学参数。多次口服600 mg每周一次（QW）后，托沃拉非尼的峰浓度在第1周期第22天达到，中位达峰时间（Tmax）为给药后3小时（范围1-24小时）。重复QW给药后，第22天的AUC168与第1天的AUC168相比，未观察到明显的药物蓄积。在20例接受600 mg QW治疗的可评估患者中，托沃拉非尼的平均血浆末端半衰期（t1/2）约为70小时（范围31-119小时）。剂量与第1周期第22天托沃拉非尼暴露量（AUC168）之间的关系见补充图S1。在 400 mg 至 800 mg 的每周一次 (QW) 剂量范围内，稳态暴露量呈近似剂量比例增加，幂函数模型的 95% 置信区间包含 1（95% CI 0.55–2.04），系数为 1.30。对于 QW 给药方案，观察到药物蓄积量最小，几何平均 Rauc（基于 AUC0-last 的蓄积比率）在 1.03–1.09 范围内。在 200 mg 的每两天一次 (Q2D) 给药方案中，Rauc 的几何平均值约为 2.55。
对 Q2D 剂量组进行了类似的药代动力学分析（补充图 S1 和 S2，以及补充表 S10）。稳态托沃拉非尼（MLN2480；BIIB-024；BSK1369；DAY-101；TAK-580；AMG-2112819）b AUC48 在 20 mg 至 280 mg Q2D 剂量范围内呈近似剂量比例增加。虽然 QW 给药方案未观察到明显的药物蓄积，但 Q2D 给药方案导致稳态下 AUC48 蓄积约 2.5 倍。

治疗期间出现的不良事件 (TEAE) 和严重不良事件 (SAE) 的发生率汇总于补充表 S5，最常见的 TEAE 列于表 2。值得注意的是，149 例接受治疗的患者中仅有 1 例（< 1%；Q2D 剂量扩展队列）报告了皮肤鳞状细胞癌，并将其归类为 TEAE。根据给药方案，药物相关 TEAE 的发生率汇总于补充表 S6。剂量扩展阶段最常见的两种不良事件分别是 Q2D 队列的斑丘疹 (36%) 和 QW 队列的疲乏 (42%)。在剂量扩展阶段，68% 的患者经历了 3 级或更高级别的 TEAE，其中 Q2D 队列为 73%，QW 队列为 47%。发生率 ≥ 5% 的 3 级或更高级别的 TEAE 列于补充表 S7。总体而言，最常见的两种不良事件是贫血（14%）和斑丘疹（8%）。[6]在每两天一次（Q2D）扩展队列中，80 例患者中有 33 例（41%）发生 3 级或以上药物相关治疗期间出现的不良事件（TEAE）；最常见的是斑丘疹（9%）和贫血（8%）。在每周一次（QW）扩展队列中，20 例患者中有 4 例（20%）发生 3 级或以上药物相关治疗期间出现的不良事件（TEAE）；最常见的是高胆红素血症（10%）。在剂量递增阶段，Q2D组（280 mg剂量组）30例患者中有2例（7%）报告了与药物相关的治疗期间出现的严重不良事件（SAE）（1例患者出现3级贫血，另1例患者出现4级呼吸困难和5级呼吸衰竭）；QW组（800 mg剂量组）20例患者中有2例（10%）报告了与药物相关的治疗期间出现的严重不良事件（SAE）（1例患者出现3级皮疹，另1例患者出现3级高胆红素血症）。在剂量扩展阶段，Q2D组80例患者中有12例（15%）报告了与药物相关的治疗期间出现的严重不良事件（SAE），包括急性肾损伤、斑疹和斑丘疹（各2例患者出现3级不良事件）。在每周一次（QW）剂量扩展队列中，19例患者中有4例（21%）出现药物相关的治疗期间出现的严重不良事件（SAE），包括1例患者出现2级贫血和呼吸困难，1例患者出现2级恶心和3级斑丘疹，以及1例患者分别出现3级多形性红斑和斑疹。
在剂量扩展阶段，每日两次（Q2D）队列的80例患者中有15例（19%）出现治疗期间出现的不良事件（TEAE），导致永久停用托沃拉非尼（MLN2480；BIIB-024；BSK1369；DAY-101；TAK-580；AMG-2112819）。这些不良事件包括斑丘疹和败血症（各2例[3%]）。在剂量扩展阶段的每周给药组（QW组）中，19例患者中有4例（21%）因治疗期间出现的不良事件（TEAE）而永久停药，包括心房扑动、呼吸困难、多形性红斑和疲乏（各1例）。在剂量扩展阶段，99例患者中有19例（19%）因TEAE而减少剂量，其中每两天给药组（Q2D组）80例患者中有17例（21%）减少剂量，每周给药组（QW组）19例患者中有2例（11%）减少剂量，最常见的不良事件为斑丘疹（99例患者中有5例，5%）和全身性皮疹（3例，3%）。
研究期间共发生13例死亡。与这些死亡相关的致命性严重不良事件（SAE）主要与基础疾病或其并发症有关，详见补充表S8。仅有一例死亡，与 280 mg Q2D 剂量递增队列中的一名患者的呼吸衰竭有关，研究人员认为该死亡与治疗相关。[6]

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蛋白结合
托沃拉非尼在体外与人血浆蛋白的结合率为 97.5%。

[1].Drugs. 2024 Aug;84(8):985-993.

[2]. Mol Cancer Ther (2013) 12 (11_Supplement): C146.

[3]. J Clin Oncol 31, 2013 (suppl; abstr 2547)

[4]. Sci Signal. 2015 Dec 15;8(407):ra129..

[5]. Oncotarget. 2017 Feb 14;8(7):11460-11479.

[6]. Clinical Trial Cancer Chemother Pharmacol. 2023 Jul;92(1):15-28.

[7]. J Biol Chem. 2023 May;299(5):104634.

TAK-580 是一种 1,3-噻唑甲酰胺，其化学名称为 2-[(1R)-1-氨基乙基]-1,3-噻唑-5-羧酸，其中羧基与 5-氯-4-(三氟甲基)吡啶-2-胺的氨基发生缩合反应，氨基又与 6-氨基-5-氯嘧啶-4-羧酸的羧基发生缩合反应。它是一种泛 RAF 激酶抑制剂，目前正在进行临床开发，用于治疗儿童和青少年中影像学复发或进展性低级别胶质瘤。它具有抗肿瘤、诱导细胞凋亡和抑制 B-Raf 活性的作用。它是一种氯吡啶、有机氟化合物、仲酰胺、氨基嘧啶、嘧啶甲酰胺和1,3-噻唑甲酰胺。
托沃拉非尼 (TAK-580) 正在临床试验 NCT02723006 中进行研究（一项评估研究性治疗与标准免疫检查点抑制剂联合治疗晚期黑色素瘤患者的安全性、耐受性和药效学的研究）。
托沃拉非尼是一种口服的 A-Raf、B-Raf 和 C-Raf 蛋白激酶野生型和某些突变型的抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。给药后，托沃拉非尼抑制 Raf 介导的信号转导通路，这可能导致肿瘤细胞生长受到抑制。 Raf蛋白激酶在RAF/MEK/ERK信号通路中发挥关键作用，该通路在人类癌症中常发生异常调控，并在肿瘤细胞增殖和存活中起着关键作用。

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背景：RAS突变型黑色素瘤和结直肠癌代表着巨大的未满足医疗需求。MLN2480是一种在研的II类RAF激酶抑制剂，TAK-733是一种在研的变构MEK激酶抑制剂；两者均正在进行单药I期临床试验。本研究旨在表征这些药物在BRAF突变型和RAS突变型黑色素瘤和结直肠癌临床前模型中的联合活性。方法：采用基于ATP的细胞活力检测方法，在BRAF和RAS突变型黑色素瘤和结直肠癌细胞系中研究MLN2480和TAK-733的联合作用对细胞活力的影响。采用蛋白质印迹法分析比较了不同细胞系中MAPK通路信号传导和反应标志物的变化，这些细胞系对该组合药物的敏感性各不相同。在相同细胞系的异种移植瘤以及RAS突变型黑色素瘤和结直肠癌的原发性人肿瘤异种移植瘤中，研究了该组合药物的药效学反应和生长抑制作用。结果：MLN2480在BRAF突变型和部分RAS突变型临床前癌症模型中，以体内耐受浓度抑制MAPK通路信号传导。MLN2480在BRAF突变型黑色素瘤模型中活性最强，但在某些RAS突变型模型中也具有单药活性。与单药MLN2480相比，MLN2480与TAK-733联合用药可抑制更广泛的RAS突变型肿瘤模型的生长，包括黑色素瘤和结直肠癌的原发性人肿瘤异种移植瘤模型。体外细胞增殖实验分析表明，该药物组合具有协同活性。蛋白质印迹分析显示，MLN2480 可逆转 TAK-733 诱导的 MEK 反馈激活，从而更有效地抑制 MAPK 通路。结论：RAF 激酶抑制剂 MLN2480 在 BRAF 和 RAS 突变型黑色素瘤和结直肠癌的临床前模型中的活性为临床试验提供了理论依据。MLN2480 与 MEK 抑制剂 TAK-733 的联合用药为这些肿瘤类型的临床研究提供了一种新的策略。[2]

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RAF 家族激酶在 RAS 激活后，启动 MAP 激酶级联信号通路，从而控制细胞生长、增殖和分化。在 RAF 亚型（ARAF、BRAF 和 CRAF）中，BRAF 的致癌突变最为常见。 BRAFV600E突变驱动超过一半的恶性黑色素瘤，也存在于许多其他癌症中。BRAFV600E选择性抑制剂（维莫非尼、达拉非尼、恩科拉非尼）已用于临床治疗这些适应症，但它们对致癌性RAS（驱动RAF二聚化和激活）以及由BRAF异常二聚化截短/融合变体驱动的恶性肿瘤无效。相比之下，许多“II型”RAF抑制剂已被开发为RAF二聚体的强效抑制剂。本文中，我们通过生化实验比较了II型抑制剂托沃拉非尼（TAK-580）和萘普拉非尼（LHX254）对三种RAF亚型的抑制效力，并描述了这两种化合物与BRAF复合物的晶体结构。我们发现托沃拉非尼和萘普生非尼对CRAF的抑制活性最强，但对ARAF的抑制活性明显较弱。这两种化合物与BRAFV600E或野生型BRAF的晶体结构揭示了它们分子相互作用的细节，包括预期的II型结合模式，即BRAF二聚体的两个亚基均被完全占据。我们的发现具有重要的临床意义。II型RAF抑制剂通常被认为是泛RAF抑制剂，但我们对这两种药物的研究，以及近期对II型抑制剂贝伐拉非尼和萘普生非尼的研究，表明相对不抑制ARAF可能是此类药物的共同特性。[6]

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RAF家族激酶在RAS激活后，启动MAP激酶级联信号通路，从而控制细胞生长、增殖和分化。在RAF亚型（ARAF、BRAF和CRAF）中，致癌突变在BRAF中最为常见。 BRAFV600E突变驱动超过一半的恶性黑色素瘤，也存在于许多其他癌症中。BRAFV600E选择性抑制剂（维莫非尼、达拉非尼、恩科拉非尼）已用于临床治疗这些适应症，但它们对致癌性RAS（驱动RAF二聚化和激活）以及由BRAF异常二聚化截短/融合变体驱动的恶性肿瘤无效。相比之下，许多“II型”RAF抑制剂已被开发为RAF二聚体的强效抑制剂。本文中，我们通过生化实验比较了II型抑制剂托沃拉非尼（TAK-580）和萘普拉非尼（LHX254）对三种RAF亚型的抑制效力，并描述了这两种化合物与BRAF复合物的晶体结构。我们发现托沃拉非尼和萘普生非尼对CRAF的抑制活性最强，但对ARAF的抑制活性明显较弱。这两种化合物与BRAFV600E或野生型BRAF的晶体结构揭示了它们分子相互作用的细节，包括预期的II型结合模式，即BRAF二聚体的两个亚基均被完全占据。我们的发现具有重要的临床意义。II型RAF抑制剂通常被认为是泛RAF抑制剂，但我们对这两种药物的研究，以及近期对II型抑制剂贝伐拉非尼和萘普生非尼的研究，表明相对不抑制ARAF可能是此类药物的共同特性。[7]作用机制
儿童低级别胶质瘤是儿童最常见的中枢神经系统（CNS）肿瘤，通常与BRAF基因组改变有关，例如BRAF融合或重排。 BRAF激酶家族受RAS激活后，可磷酸化MEK1/2，MEK1/2磷酸化ERK1/2，进而激活下游信号级联反应，调控多种细胞过程，例如细胞生长、增殖和分化。BRAF的致癌突变会导致RAS-RAF-MEK-ERK通路异常激活，该通路也称为丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路。目前已开发出多种RAF激酶抑制剂用于治疗BRAF突变型癌症。根据其对BRAF亚型的选择性和结合模式，这些RAF抑制剂可分为不同的“类型”。托沃拉非尼是一种II型RAF激酶抑制剂。RAF激酶激活环N端存在一个保守的三氨基酸残基片段（Asp-Phe-Gly），称为DFG基序。在一种称为“DGF-out”构象的状态下，DFG基序发生翻转，导致苯丙氨酸残基重新定向，从而留下一个空位，药物可以从ATP结合位点延伸并插入疏水基团。托沃拉非尼对BRAF V600E突变体、野生型BRAF和野生型CRAF激酶均有活性。托沃拉非尼在携带BRAF V600E和V600D突变的培养细胞和异种移植瘤模型以及携带BRAF融合基因的异种移植瘤模型中均表现出抗肿瘤活性。据报道，托沃拉非尼不会诱导MAPK通路的反常激活。

C17H12CL2F3N7O2S

506.29

505.01

C, 40.33; H, 2.39; Cl, 14.01; F, 11.26; N, 19.37; O, 6.32; S, 6.33

1096708-71-2

25161177

White to off-white solid powder

1.64

5.024

164.02

3

11

5

32

695

1

ClC1C(N([H])[H])=NC([H])=NC=1C(N([H])[C@]([H])(C([H])([H])[H])C1=NC([H])=C(C(N([H])C2C([H])=C(C(F)(F)F)C(=C([H])N=2)Cl)=O)S1)=O

VWMJHAFYPMOMGF-ZCFIWIBFSA-N

InChI=1S/C17H12Cl2F3N7O2S/c1-6(28-15(31)12-11(19)13(23)27-5-26-12)16-25-4-9(32-16)14(30)29-10-2-7(17(20,21)22)8(18)3-24-10/h2-6H,1H3,(H,28,31)(H2,23,26,27)(H,24,29,30)/t6-/m1/s1

2-[(1R)-1-[(6-amino-5-chloropyrimidine-4-carbonyl)amino]ethyl]-N-[5-chloro-4-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]-1,3-thiazole-5-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 0.67 mg/mL (1.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 6.7 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 0.67 mg/mL (1.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 6.7mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 0.67 mg/mL (1.32 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 6.7 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。