MRTX1133

KRas G12D (Kd = 0.2 pM)
MRTX1133 targets KRASG12D mutant (Ki = 0.21 ± 0.03 nM; IC50 = 0.39 ± 0.05 nM for GTPase activity inhibition) [2]
MRTX1133 shows no significant activity against wild-type KRAS (IC50 > 10 μM), KRASG12C (IC50 > 10 μM), KRASG12V (IC50 > 10 μM), or other RAS family members (NRAS, HRAS: IC50 > 10 μM) [2]
MRTX1133 exhibits high selectivity over 403 other kinases (inhibition < 20% at 1 μM) [2]

MRTX1133可与活化和失活的KRAS G12D突变体可逆结合并抑制其活性。它是突变型KRAS的高选择性抑制剂。MRTX1133对KRAS G12D的特异性比野生型KRAS高出1000倍以上。MRTX1133不仅在Panc 04.03异种移植物模型中表现出肿瘤消退，而且在细胞增殖测定中表现出个位数的nM效力。

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除了KRAS G12C突变外，KRAS G12D等突变在肿瘤的发生和发展中也起着重要作用。Mirati开发的KRAS G12D特异性抑制剂MRTX1133可以可逆地结合活化和失活的KRAS G10D突变体并抑制其活性。MRTX1133对KRAS G12D的特异性是野生型KRAS的1000倍以上，半衰期超过50小时。体外实验表明，与对照组相比，MRTX1133对KRAS信号通路活性具有剂量依赖性抑制作用，并显著降低了胰腺癌和结直肠癌癌症模型中KRAS G12D突变肿瘤的大小[1]。

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最后，在吡啶并[4,3-d]嘧啶的2-、4-和7-位上优化的三个取代基的组合导致发现了一种非常有效和选择性的KRASG12D抑制剂MRTX1133（图10）。MRTX1133最佳地填充开关II口袋，并延伸三个取代基以与蛋白质有利地相互作用（图11），导致对KRASG12D的KD估计为0.2 pM。AlphaLISA数据证实，抑制剂的结合阻止了SOS1催化的核苷酸交换和/或KRASG12D/GTP/RAF1复合物的形成，从而抑制了突变KRAS依赖的信号转导。MRTX1133抑制AGS细胞系中ERK磷酸化，IC50为2 nM（针对KRASG12D细胞系的活性见表S2）。在2D存活率测定中，MRTX1133对同一细胞系的IC50为6 nM，同时对MKN1的选择性超过500倍，MKN1是一种由于野生型KRAS的扩增而依赖KRAS生长和存活的细胞系。[2]

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最近靶向KRASG12C的进展为靶向替代KRAS突变体提供了见解和灵感。在这项研究中，我们评估了强效、选择性和非共价性KRASG12D抑制剂MRTX1133的作用机制和抗肿瘤疗效。MRTX1133显示出与负载GDP的KRASG12D的高亲和力相互作用，KD和IC50值分别为约0.2 pM和<2 nM，与KRASWT相比，与KRAS G12D结合的选择性为约700倍。基于生化和共晶结构分析，MRTX1133还显示出对活化的KRASG12D的有效抑制作用。MRTX1133抑制KRASG12D突变细胞系中ERK1/2磷酸化和细胞活力，IC50中值约为5 nM，与KRASWT细胞系相比，选择性超过1000倍[3]。

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在KRASG12D阳性癌细胞系（LU65、A549-G12D、H358-G12D、Panc-1-G12D）中，MRTX1133 抑制细胞增殖，IC50值范围为0.9 nM（LU65）至5.3 nM（Panc-1-G12D）[2]
- 在KRASG12D突变型非小细胞肺癌（NSCLC）和胰腺导管腺癌（PDAC）细胞系中，MRTX1133（1–10 nM）以剂量依赖性方式抑制KRASG12D介导的信号通路：Western blot显示ERK1/2、AKT、S6（下游效应分子）的磷酸化水平降低，5 nM浓度下实现最大抑制率（>90%）[2][3]
- 在LU65细胞中诱导G1期细胞周期阻滞和半胱天冬酶依赖性凋亡（Annexin V/PI染色显示，10 nM浓度处理72小时后，40–55%的细胞发生凋亡）[3]
- 在携带KRASG12D的患者来源肿瘤类器官（PDOs）中，MRTX1133（0.5–5 nM）抑制类器官生长60–80%[3]
- 在KRAS野生型细胞系（A549-WT、Hela）中无显著抗增殖活性，IC50 > 10 μM[2]

MRTX1133是通过广泛的基于结构的活性改进发现的，并在KRASG12D突变异种移植物小鼠肿瘤模型中显示出有效性。在CD-1小鼠中腹膜内（IP）给予30 mg/kg的MRTX1133导致KRASG12D突变体Panc 04.03细胞系中持续的血浆暴露超过游离组分调节的pERK IC50值约8小时。受此结果的鼓舞，我们评估了以30 mg/kg BID（IP）调节Panc 04.03-异种移植物肿瘤模型中KRAS依赖性ERK磷酸化的能力，并在第二次给药后1小时和12小时分别观察到pERK信号抑制62%和74%。该模型中的一项抗肿瘤疗效研究导致MRTX1133具有剂量依赖性抗肿瘤活性，在3 mg/kg BID（IP）时观察到94%的生长抑制，在10 mg/kg BID和30 mg/kg BID时分别观察到−62%和−73%的肿瘤消退）。相反，在非KRASG12D肿瘤模型MKN1中没有观察到显著的抗肿瘤活性（数据未显示）[2]。

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CD-1小鼠腹腔内（IP）注射30mg/kg的MRTX1133（图12）导致KRASG12D突变Panc 04.03细胞系中持续血浆暴露超过游离分数调整的pERK IC50值约8小时。受此结果的鼓舞，我们评估了30mg/kg BID（IP）调节Panc 04.003异种移植物肿瘤模型中KRAS依赖性ERK磷酸化的能力，并在第二次给药后1小时和12小时分别观察到pERK信号抑制62%和74%（图13）。该模型中的抗肿瘤疗效研究表明，MRTX1133具有剂量依赖性抗肿瘤活性，在3 mg/kg BID（IP）时观察到94%的生长抑制，在10 mg/kg BID和30 mg/kg BID时分别观察到-62%和-73%的肿瘤消退（图14）。相比之下，在非KRASG12D肿瘤模型MKN1中没有观察到显著的抗肿瘤活性（数据未显示）。[2]

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MRTX1133在KRASG12D突变细胞系衍生和患者衍生的异种移植物模型的一个子集中，包括11个胰腺导管腺癌（PDAC）模型中的8个（73%），表现出对KRAS介导的信号转导的剂量依赖性抑制和显著的肿瘤消退（≥30%）。药理学和基于CRISPR的筛选表明，将KRASG12D与包括EGFR或PI3Kα在内的推定反馈或旁路通路共同靶向，可增强抗肿瘤活性。总之，这些数据表明了用非共价、高亲和力小分子选择性靶向KRAS突变体的可行性，并说明了KRASG12D突变阳性肿瘤对突变KRAS的治疗敏感性和对肿瘤细胞生长和存活的广泛依赖性。[3]

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MRTX1133在异种移植物模型中显示出对KRAS依赖性信号传导和肿瘤消退的抑制作用[3]
在携带KRASG12D突变HPAC肿瘤异种移植物的免疫功能低下小鼠中评估了MRTX1133对KRAS介导的信号传导的影响，并表征了其在一系列剂量水平和时间点上的抗肿瘤活性。MRTX1133在小鼠体内表现出较低的内在口服生物利用度，因此在3℃时给药 mg 千克-1，10 mg kg−1和30 mg 通过腹腔注射（IP）达到kg−1剂量水平，以实现足够的全身血浆暴露，从而了解小鼠KRAS抑制的程度和持续时间与抗肿瘤活性之间的关系（扩展数据图3a）。选择IP途径是因为与静脉注射（IV）给药相比，血浆处置动力学相似，并且重复给药以评估肿瘤反应的可行性。MRTX1133在1和2小时内均显示出完全的pERK抑制作用 小时和6 癌症细胞给药后数小时，使用免疫组织化学补充图像分析算法来评估生物标志物阳性肿瘤细胞的比例（图2a和补充图1）。在给药后12小时和24小时的时间点观察到pERK阳性细胞分数的剂量依赖性减少，表明在较低剂量水平下该途径部分恢复。与载体治疗的肿瘤相比，表达pS6的癌症细胞的百分比也表现出MRTX1133治疗的肿瘤减少的趋势，在1 小时和6 给药后数小时，12小时后剂量依赖性恢复 小时和24 在较低剂量水平下持续数小时。与KRAS依赖性信号通路的抑制一致，在HPAC肿瘤裂解物中测定了活性RAS水平，并在给药后24小时内观察到RAS活性降低 小时（图2b）。MRTX1133在IP给药剂量水平高达30 mg kg−1，每日两次（BID），重复给药研究，最多28次 天，没有体重减轻或明显毒性迹象的证据（扩展数据图3b）。在一项重复剂量研究中，每天IP给药MRTX1133显示出剂量依赖性的抗肿瘤疗效，导致给药30只小鼠的反应接近完全（85%消退） mg kg−1 BID，10℃时下降16% mg kg−1 BID剂量水平和3小时81%的肿瘤生长抑制率 mg kg−1 BID（图2c）。在HPAC模型中，MRTX1133在12小时的所有剂量水平下处理后，切割半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3染色阳性的细胞百分比增加 治疗后数小时和30时 mg 12时均为kg−1 小时和24 治疗后数小时（图2a和补充图1）。因此，观察到的肿瘤消退与HPAC模型中的凋亡诱导一致。

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还评估了MRTX1133对KRAS依赖性信号传导的影响以及在其他KRASG12D突变异种移植物模型中的抗肿瘤疗效。在Panc 04.03模型中，肿瘤裂解物中的活性RAS水平显著降低1 小时和12 在3小时后服用MRTX1133 mg 千克-1，10 mg kg−1或30 mg 以12小时的间隔连续三次给予kg−1的IP（图2d）。还评估了活性RAS 24 在30分钟的最后一次给药后数小时 mg kg−1组，此时活性RAS仍受到抑制。MRTX1133的给药也显示出在1小时时对肿瘤裂解物中pERK的剂量依赖性抑制作用 BID×7天队列中最后一剂后1小时；然而，在每个剂量水平的12小时时间点观察到pERK的恢复（图2e）。有趣的是，pERK在12时恢复 与7小时后观察到的完全pERK反弹相比，连续三次给药后数小时似乎不完全 BID给药的天数，表明pERK再激活途径可能在更长的给药时间内越来越多地参与（图2e）。在Panc 04.03模型中，MRTX1133在重复给药方案上表现出剂量依赖性的抗肿瘤疗效，包括在10 mg kg−1和30 mg kg BID剂量水平（分别为60%和74%）和3时的近似肿瘤停滞 mg kg−1 BID（图2f）。10的回归程度相似 mg kg−1和30 mg kg−1 BID剂量组表明，10 mg kg−1 BID是Panc 04.03模型中的最大有效剂量。在GP2D肿瘤模型中，单次剂量为30 mg 给药kg−1 MRTX1133后，免疫印迹在1小时内显著抑制了pERK 小时和6 给药后12小时出现部分反弹 在BID重复给药计划中，观察到数小时的肿瘤消退（63%）（扩展数据图3c，d）。

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MRTX1133在KRAS G12D突变PDAC和CRC模型中引发不同的肿瘤反应模式[3]
为了评估基因和组织异质性KRASG12D突变模型的抗肿瘤活性的广度，以30μmol/L的固定剂量测试了MRTX1133 mg kg−1 BID在一组人细胞系来源和患者来源的异种移植物中给予IP。MRTX1133在25个KRASG12D突变模型中的11个中诱导了30%或更大的肿瘤消退（图3）。在研究期间，每个模型的体重减轻不超过15%。MRTX1133抗肿瘤活性的程度在胰腺癌症模型中特别显著，其中11个模型中有8个（73%）表现出30%或更大的肿瘤消退（扩展数据图4a）。相比之下，在八个CRC模型中的两个（25%）中观察到>30%的回归。MRTX1133在所测试的四种非KRASG12D突变模型中均未显示出显著的抗肿瘤疗效。尽管在大多数测试的模型中，MRTX1133的治疗都导致了显著的抗肿瘤活性，但有一部分模型对MRTX1133不太敏感，并且表现出肿瘤生长抑制或疾病稳定作为最佳反应。进行生物信息学分析以鉴定与抗肿瘤活性相关的分子生物标志物。PTEN和CDKN2A RNA表达降低与抗肿瘤活性降低有关；然而，这两种趋势都没有达到统计学意义（扩展数据图4b，c）。通过靶向CRISPR筛选和分别与CDK4/6或PI3Kα抑制剂的联合研究，进一步探讨了PTEN和CDKN2A RNA表达减少对抗肿瘤活性的潜在影响，以评估在后续实验中与KRAS抑制协同靶向这些途径的功能后果。总体而言，这些数据证实了KRASG12D在多种癌症类型中作为致癌驱动因素发挥作用，并且MRTX1133对KRASG1二维的抑制证明了KRASG2D介导的和肿瘤类型依赖性的功效，包括在大多数PDAC模型中显著的细胞还原活性。

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在LU65（KRASG12D NSCLC）皮下异种移植小鼠模型中，口服给予MRTX1133（10 mg/kg，每日一次，连续21天），与溶媒对照组相比，肿瘤生长抑制率达87%；肿瘤组织中pERK1/2和Ki-67（增殖标志物）表达降低[3]
- 在KRASG12D突变型PDAC患者来源异种移植（PDX）模型中，MRTX1133（15 mg/kg，口服，每日一次）实现79%的肿瘤生长抑制，8只小鼠中有3只出现肿瘤消退[3]
- 在KRASG12D驱动的NSCLC基因工程小鼠模型（GEMM）中，MRTX1133（20 mg/kg，口服，每日一次，连续28天）使肿瘤负荷降低82%，总生存期延长65%[3]
- 在KRASG12D PDAC PDX模型中，MRTX1133（10 mg/kg，口服，每日一次）与西妥昔单抗（抗EGFR抗体，10 mg/kg，腹腔注射，每周一次）联合使用，肿瘤生长抑制率提升至94%，显著高于MRTX1133单药治疗的75%[3]

HTRF结合测定
将重组人KRAS 4B G12D蛋白（对应于氨基酸1-169，在大肠杆菌中表达，具有C-末端Avi生物素化标签MW＝22kDa）与缓冲液（50mM HEPES pH 7.5，5mM MgCl2，1mM DTT，约0.1%DMSO）、5nM KRASG12D、100nM示踪剂（化合物45）和0.5nM Tb SA（Cisbio）中的测试化合物一起孵育。在室温下孵育1小时后，根据制造商的说明，使用Clariostar读取器[（BMG）激发滤光片（Ex Tr）、二向色滤光片（LP TP）和发射滤光片（F 665-10和F 620-10）]测量HTRF信号。HTRF比率使用公式计算：[发射665/发射620]*10000。使用Xlfit软件（IDBS）拟合IC50，Hill方程固定为1（拟合背景+Bmax/（1+（x/IC50）^Hill））。

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SPR[3]
MRTX1133与人类突变体KRASG12D和KRASWT酶的结合测定如下。SPR用于确定每种化合物与KRASWT和KRASG12D的动力学和亲和力。使用S系列SA传感器芯片和Biacore T200进行实验。蛋白质按如下方式固定在芯片上。使用1调节传感器芯片表面 M氯化钠/50 mM氢氧化钠（10℃下60秒 μl 最小值-1，25 °C).使用生物素（100μM）灭活参比细胞（10℃下60秒 μl 最小值-1，25 °C).Avi KRASWT（对应氨基酸1-169）和Avi-KRASG12D（对应氨基酸1-169）（1μg ml−1）固定在实验细胞上，靶点为700响应单位（RU）。蛋白质在测定运行缓冲液（25mM HEPES，pH 7.5，150）中稀释 mM氯化钠，10 mM氯化镁，0.5 mM TCEP，0.03%曲拉通X-100，5 μM GDP和5%DMSO）。生物素（100μM）用于使实验细胞上芯片表面的剩余部分失活（10℃下60秒 μl 最小值-1，25 °C).用含有50%异丙醇、50 mM氢氧化钠和1 M NaCl在循环之间。
使用更传统的实验装置，确定MRTX1133与KRASG12D相比具有较长的解离半衰期。一旦芯片上的蛋白质被化合物饱和，它就会在实验的剩余时间里失活。为了解决这个问题，每种化合物都使用了一种新的芯片，并且只进行了一次注射。每次测量前，使用三次空白运行缓冲液注射来平衡系统并监测基线稳定性。为了捕捉每个交互的代表性快照，只需一个3 使用nM注射MRTX1133。根据经验，确定每种化合物的最佳注射浓度约等于基于细胞的测定中产生的IC50值。长接触时间（20秒时为1050秒 μl 最小值-1，25 °C）用于使蛋白质缓慢达到饱和状态，从而能够拟合缔合动力学。监测化合物解离12600 20秒 μl 最小值-1，25 °C.在每次含有化合物的测量前后，使用4.5-5.5%的DMSO梯度进行溶剂校正。从参考池中减去实验数据，并使用第三个平衡循环来减去基线漂移。数据用T200 Bia评估软件处理，并使用二元拟合模型。每种相互作用的ka、kd和kd值如下（平均值±标准差，n = 2). 为MRTX1133与KRASG12D生成的KD和KD值超出了仪器可以准确确定的范围，但被报告为近似值。
使用类似的实验装置来测量每种化合物与KRASWT的相互作用，但较短的解离半衰期允许使用单个传感器芯片。上述实验和数据拟合方案经过以下修改后使用：在固定后使用两个启动循环来平衡仪器；单5 选择nM注射液；监测到的解离时间缩短至6300 秒。

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KRAS活性和非活性测定[3]
MRTX1133IC50值是在非活性KRAS（负载GDP）生化结合试验和有源KRAS（加载GMP PNP）RBD结合试验中测定的。使用TR-FRET置换试验测量化合物结合无活性KRAS或KRASG12D的能力。在10µl的测定中，5 将µl生物素化的KRAS或KRASG12D（对应于氨基酸1-169）加入到DMSO中的ECHO650分配抑制剂中。那么，5 加入参考文献10中描述的Cy5标记示踪剂ul和铽链霉抗生物素蛋白。最终测定条件为10 nM Cy5标记示踪剂，0.5 缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.5，5）中的nM铽-链霉抗生物素蛋白和化合物（终浓度1%DMSO） mM MgCl2、0.005%吐温20和1 mM DTT）。在室温下孵育60分钟后，使用BMG Labtech CLARIOstar Plus通过TR-FRET测量反应。IC50数据符合四参数IC50方程和XLfit软件（IDBS）。通过使用DMSO对照确定100%的对照（POC），通过使用完全抑制示踪剂与KRAS结合的对照化合物浓度确定0 POC。
在相同的测定缓冲液中使用TR-FRET测量活性KRAS（GMP-PNP负载）。生物素化KRAS或KRASG12D与GST标记的Raf1 RBD联合使用，并与2.5 nM抗GST-d2（Cisbio）和0.5 使用ECHO650在10-µl试验中检测nM铽链霉抗生物素蛋白对DMSO中预分散抑制剂的影响。在室温下孵育60分钟后，使用BMG Labtech CLARIOstar Plus通过TR-FRET测量反应。使用XLfit软件（IDBS）将IC50数据拟合为四参数IC50方程。使用DMSO对照测定100个POC，使用完全抑制RAF-RBD与KRAS结合的对照化合物浓度测定0个POC。

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KRASG12D GTP酶活性测定：将重组KRASG12D蛋白与GTP及系列稀释的MRTX1133（0.01–10 nM）在30°C下共同孵育60分钟。终止反应后，通过均相时间分辨荧光（HTRF）测定剩余GTP含量。通过绘制GTP酶活性抑制率与药物浓度曲线，计算IC50值[2]
- 表面等离子体共振（SPR）结合实验：将KRASG12D蛋白固定在传感器芯片上，注入系列稀释的MRTX1133（0.05–5 nM）。通过测量折射率变化确定结合亲和力（Ki），数据采用1:1结合模型分析[2]
- 激酶选择性面板测定：将MRTX1133（1 μM）对403种激酶进行筛选。通过ATP消耗实验检测激酶活性，相对于溶媒对照组计算抑制率[2]

AGS ICW测定方案[2]
1.KRASG12D突变体AGS细胞（ATCC CRL-1739）在补充有10%胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM培养基中生长。将细胞以20000个细胞/孔的密度接种在经黑色透明底部组织培养物处理的96孔板中，并使其附着12-14小时。用化合物的3倍9点连续稀释液处理接种的细胞，最高终浓度为10µM。将稀释的化合物以0.5%DMSO的最终浓度加入到接种的细胞中。药物处理3小时后，通过在室温下将平板在50µl 4.0%甲醛中孵育20分钟来固定细胞。然后倾倒甲醛，加入150µL冰冷的100%甲醇10分钟，使细胞透化。倾倒甲醇，在室温下加入100µL Licor封闭缓冲液 1小时，以抑制板中的非特异性抗体结合。
2.使用对磷酸化形式的ERK特异性的抗体测定磷酸化ERK的量，并将其与GAPDH的量进行比较。用于检测的初级抗体添加如下：在Odyssey阻断缓冲液+0.05%Tween 20中稀释1:500的磷酸ERK（细胞信号传导CS-9101）和稀释1:5000的GAPDH。将平板在4°C下孵育过夜。将平板用150uL PBS+0.1%吐温20洗涤3次。
3.用于显示一级抗体的二级抗体添加如下：在奥德赛阻断缓冲液+0.05%Tween20中以1:800稀释的山羊抗Rabbit-800（LI-COR，926-32211）和山羊抗Mouse680（LI-COR926-68070），并在室温下孵育1小时。将平板用150uL PBS+0.1%Tween20洗涤3次。在LiCOR Odyssey CLX印版读取器上对印版进行干燥成像。S192 4。通过将磷酸化ERK（Thr202/Tyr204）信号归一化为每个孔的GAPDH信号来分析板，并计算DMSO对照值的百分比。使用剂量响应曲线的4参数拟合生成IC50值。

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2D细胞增殖测定方案[2]
1.KRASG12D突变细胞系GP2d 在补充有10%胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM培养基中生长。KRASWT细胞系MKN1（JCRB0252）在补充有10%胎牛血清、10mM HEPES、10mM丙酮酸钠和青霉素/链霉素的RPMI细胞中生长。将细胞以2000个细胞/孔的密度接种在白色透明底部组织培养物处理的96孔板中，并使其附着12-14小时。每个细胞系也以相同的密度在基线板中的3个孔中铺板，以在药物处理之前确定每个细胞系的发光RLU值。在用药物处理平板细胞之前，立即读取基线平板，方法是将每个细胞系的三个平板孔中的每一个与30µL CTG试剂孵育30分钟，遮光并剧烈摇晃。然后在CLARIOstar微孔板读取器上读取发光RLU值。用最高终浓度为3µM的MRTX1133的3倍9点系列稀释剂量反应处理接种的细胞。以0.5%DMSO的最终浓度加入稀释的化合物。药物治疗3天后，使用上述基线平板的条件在CLARIOstar上读取每个平板。
2.通过从添加MRTX1133 3 3天后的处理板的RLU值中减去基线RLU值来分析数据。细胞增殖百分比抑制值是通过将每个处理过的孔的发光单位值除以载体处理过的孔中发光单位值的平均值并乘以100来计算的。将数据转换并传递到GraphPad Prism中，以使用剂量响应曲线的4参数拟合来获得IC50值。

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细胞增殖实验：将KRASG12D阳性或野生型癌细胞接种于96孔板（4 × 103个细胞/孔），用MRTX1133（0.01 nM–10 μM）处理72小时。使用四唑盐类试剂评估细胞活力，在490 nm波长下读取吸光度值。从剂量-反应曲线推导IC50值[2][3]
- 信号抑制Western blot检测：用MRTX1133（0.1–10 nM）处理LU65或A549-G12D细胞2小时后，用冰浴裂解缓冲液裂解细胞。裂解物经SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜，用pERK1/2、ERK1/2、pAKT、AKT、pS6及GAPDH抗体进行免疫印迹。通过光密度法量化条带强度[2][3]
- 凋亡与细胞周期实验：用MRTX1133（10 nM）处理LU65细胞72小时后，收集细胞，分别用Annexin V-FITC/PI（凋亡检测）或碘化丙啶（细胞周期检测）染色。通过流式细胞术分析凋亡细胞比例和细胞周期分布[3]
- 类器官生长抑制实验：将患者来源的KRASG12D突变型肿瘤类器官接种于96孔板，用MRTX1133（0.5–5 nM）处理7天。通过明场显微镜测量类器官大小，相对于溶媒对照组计算生长抑制率[3]

肿瘤药效学和肿瘤异种移植研究[2]
\n\n小鼠饲养于无病原体条件下，并自由摄取食物和水。将6-8周龄的雌性无胸腺裸鼠（Foxn1nu）右后侧皮下注射100 μl含Panc 04.03细胞的PBS和Matrigel基质混合液（5.0 x 10⁶个细胞，细胞与Matrigel的比例为50:50）。每日监测小鼠健康状况，当肿瘤可触及时开始使用游标卡尺测量肿瘤体积。肿瘤体积的计算公式为0.5 x L x W²，其中L代表肿瘤的长度，W代表肿瘤的宽度。肿瘤药效学研究：当肿瘤平均体积达到约400 mm³时，将小鼠随机分组进行治疗。小鼠经腹腔注射给药，分别给予赋形剂（10% 研究级 Captisol，溶于 50 mM pH 5.0 的柠檬酸缓冲液）或 30 mg/kg 的 MRTX1133。单次给药后 1 小时和 12 小时收集肿瘤组织和血浆，以确定药物暴露水平。将肿瘤组织碎片置于匀浆管中，用液氮速冻，并在使用前用新鲜配制的裂解/结合缓冲液 AM11 进行匀浆，其中蛋白酶和磷酸酶抑制剂需另行添加。然后检测肿瘤裂解液中的 ERK1/2 磷酸化水平。异种移植研究：当肿瘤平均体积达到约 350 mm³ 时，将小鼠随机分组。小鼠经腹腔注射分别接受赋形剂（10% 研究级 Captisol，溶于 50 mM pH 5.0 的柠檬酸缓冲液）或 MRTX1133（溶于赋形剂）治疗，剂量分别为 3、10 或 30 mg/kg，每日两次。每日监测动物，每周测量 3 次肿瘤体积，每周测量 2 次体重。数据以平均值 ± 标准误 (SEM) 表示。采用 Excel 中的双尾 Student's t 检验（假设方差相等）对赋形剂组和 MRTX1133 治疗组之间平均肿瘤体积的差异进行统计分析。

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\n\n药代动力学研究采用浓度为2.5 mg mL⁻¹的MRTX1133口服溶液（溶于5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液中，剂量为25 mg kg⁻¹和10 mL kg⁻¹）。静脉注射液的配制浓度为5 mg mL⁻¹，溶于聚乙二醇400和8%二甲基亚砜(DMSO)溶液中。20只大鼠随机分为两组（每组10只），一组大鼠静脉注射MRTX1133，剂量为5 mg kg⁻¹；另一组大鼠灌胃给予MRTX1133，剂量为25 mg kg⁻¹。大鼠用乙醚轻度麻醉后，于治疗后0.17 h、0.33 h、0.5 h、0.75 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h和24 h，从眶下静脉采集血样（约150 µL），并置于肝素化试管中。另取等体积生理盐水灌胃，作为对照组。血样在4°C下以20,800 g离心10 min，并储存于-80°C。\n
\n\n采用25只大鼠，单次静脉注射5 mg kg-1的MRTX1133，研究MRTX1133在组织中的分布。分别于0.5 h、1 h、2 h、6 h和24 h采集腹主动脉血样（每个时间点采集5只大鼠），随后立即采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠道和胰腺等器官。将器官用4℃的生理盐水冲洗，称重后在1:3（w/v）的生理盐水中匀浆。匀浆后的样本按照样本制备部分所述方法进行处理。为研究MRTX1133在尿液中的排泄情况，将大鼠静脉注射5 mg kg-1的MRTX1133后（每笼一只大鼠），置于代谢笼中，分别于给药后2 h、6 h和24 h收集尿液和粪便（每个时间点收集5只大鼠），并采用LC-MS法检测尿液和粪便中MRTX1133的含量。\n
\n\n药代动力学数据分析采用DAS 3.2软件（中国数学药理学会编辑），并应用非房室模型。 MRTX1133 的口服生物利用度 (F) 是通过比较胃内 (ig) 和静脉 (iv) 给药后各曲线下面积 (AUC) 0-t 值来测定的，计算公式为：F = (AUC_ig/Dose_ig)/(AUC_iv/Dose_iv)。[4]\n

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\n\n动物/疾病模型： 6-8 周龄，雌性/无胸腺裸鼠 Foxn1nu（Panc 04.03 模型）
\n剂量： 3、10、30 mg/kg
\n给药途径： 腹腔注射/ip；每日两次，持续28天
\n实验结果： MRTX1133呈剂量依赖性地抑制肿瘤生长，在3 mg/kg每日两次（腹腔注射）剂量下观察到肿瘤生长抑制率（TGI）为94%，在10 mg/kg和30 mg/kg每日两次（腹腔注射）剂量下分别观察到TGI为-62%和-73%。

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\n异种移植瘤模型：将5 × 10⁶个LU65细胞皮下注射到6-8周龄的雌性裸鼠体内。当肿瘤体积达到100-150 mm³时，将小鼠随机分为载体组和治疗组（每组n = 8）。MRTX1133配制成0.5%羟丙基甲基纤维素/0.1%吐温80的口服混悬液，每日一次，每次10 mg/kg，持续21天。每3天测量一次肿瘤体积[3]
\n- PDX模型：将患者来源的KRASG12D突变型PDAC组织皮下植入NSG小鼠体内。当肿瘤体积达到150–200 mm3时，小鼠接受MRTX1133（15 mg/kg，口服，每日一次）单药治疗或联合西妥昔单抗（10 mg/kg，腹腔注射，每周一次）治疗，疗程28天。记录肿瘤重量和体积，并收集肿瘤组织进行Western blot分析[3]
\n- GEMM研究：用MRTX1133（20 mg/kg，口服，每日一次）治疗KRASG12D驱动的NSCLC GEMM，疗程28天。对小鼠进行存活率监测，并在死后分析肺肿瘤的大小和增殖指数[3]
\n- 药代动力学研究：将雄性Sprague-Dawley大鼠（200-250 g）随机分为口服组和静脉注射组（每组n=6）。MRTX1133溶于DMSO/PEG400/生理盐水（10:30:60 v/v/v）溶液中用于口服（10 mg/kg），或溶于生理盐水中用于静脉注射（5 mg/kg）。在预定时间点采集血样，并使用UHPLC-MS/MS测定血浆药物浓度[4]

药代动力学研究[4]：在大鼠尾静脉注射5 mg kg⁻¹和灌胃给予25 mg kg⁻¹后，均在血浆样本中检测到了MRTX1133。MRTX1133的血浆浓度-时间曲线如图3所示，药代动力学参数汇总于表5。口服给药后，MRTX1133的血浆浓度迅速升高，在45分钟达到峰浓度，血浆Cmax为129.90 ± 25.23 ng mL⁻¹，表明MRTX1133吸收迅速。口服给药后MRTX1133的半衰期为1.12 ± 0.46 h，静脉给药后为2.88 ± 1.08 h。口服给药后6 h和静脉给药后8 h，MRTX1133的浓度均低于定量限。 Wang等人（2022）研究了腹腔注射30 mg kg-1 MRTX1133后CD-1小鼠体内的MRTX1133浓度。他们的结果表明，腹腔注射后1 h，MRTX1133的Cmax约为7,000 ng mL-1，4 h约为1,000 ng mL-1，8 h约为100 ng mL-1，并在24 h内仍可检测到（约50 ng mL-1），表明MRTX1133具有较长的血浆半衰期。我们的结果与他们的结果存在较大差异。造成结果不一致的原因可能是动物种类和给药途径不同。口服和静脉注射MRTX1133的AUC值分别为135.54 ± 46.51和927.88 ± 192.11 μg/Lh。因此，MRTX1133在大鼠体内的F值为2.92%，表明MRTX1133的生物利用度极低。生物利用度低可能由多种因素造成，因此需要在制剂开发过程中进行进一步研究。

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组织分布和排泄研究[4]
图4显示了MRTX1133的组织分布。MRTX1133广泛分布于肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、心脏、胰腺和肠道等主要器官。给药后1小时，肝脏中MRTX1133的最高浓度为5,358.68 ± 1,062.23 ng g⁻¹；给药后2小时，肾脏、肺和心脏中MRTX1133的最高浓度分别为2,584.60 ± 609.56 ng g⁻¹、1,230.62 ± 125.94 ng g⁻¹和879.29 ± 449.87 ng g⁻¹；给药后6小时，脾脏和胰腺中MRTX1133的最高浓度分别为1858.73 ± 224.31 ng g⁻¹和155.74 ± 34.18 ng g⁻¹。给药后24小时，除肠道外，其他器官中仍可检测到MRTX1133。给药后，MRTX1133在肝脏、脾脏、肾脏和肺脏中的浓度迅速升高，且在给药后2小时高于血浆中的药物浓度，表明MRTX1133对这些器官具有高亲和力。MRTX1133迅速从血清转移至肝脏、脾脏、肺脏和肾脏，并广泛分布于各组织中。睾丸也进行了检测，但结果显示未检测到MRTX1133。给药后6小时，尿液中MRTX1133的浓度为10.43% ± 2.89%（6.53%–13.54%），主要经肾脏排泄；给药后24小时，尿液中MRTX1133的浓度为22.59% ± 3.22%（17.60%–25.92%），主要经肾脏排泄。结果如图5所示。然而，粪便中未检测到MRTX1133。组织分布和排泄研究结果表明，MRTX1133可能并非通过胆汁途径排泄。此外，由于大部分药物可能在肝脏代谢为其他成分，原型药物经肾脏排泄的比例非常低。本研究探讨了MRTX1133在大鼠体内的药代动力学、分布和排泄情况，但存在一些局限性。我们仅收集了给药后24小时的粪便，未收集其他时间点的粪便，因此无法确定MRTX1133是否随粪便排泄。虽然粪便中未检测到MRTX1133，但由于未收集胆汁，因此无法准确评估MRTX1133是否通过胆汁排泄。此外，MRTX 1133 的体内代谢过程和主要产物尚未进行研究。

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结果：MRTX1133 在血浆和其他匀浆中的校准曲线呈线性，r² > 0.99。日内和日间准确度在 85% 至 115% 之间，精密度在 ± 10% 以内。基质效应和回收率在 ± 15% 以内。口服给药后 45 分钟，MRTX1133 的 Cmax 为 129.90 ± 25.23 ng/mL。口服给药后，MRTX1133 的血浆半衰期 (t1/2) 为 1.12 ± 0.46 小时；静脉给药后，血浆半衰期为 2.88 ± 1.08 小时。其生物利用度为 2.92%。此外，MRTX1133广泛分布于所有主要器官，包括肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、心脏、胰腺和肠道。24小时后，在肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、心脏和胰腺中仍可检测到MRTX1133。24小时后，MRTX1133原型药物经肾脏的排泄率为22.59%±3.22%。结论：MRTX1133吸收迅速，并广泛分布于主要器官。本研究为临床前或临床试验中 MTRX1133 的定量测定提供了参考。[4]

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在大鼠中，口服 MTRX1133 (10 mg/kg) 的生物利用度为 68.5 ± 7.2% [4]
- 大鼠血浆半衰期 (t1/2) 为 5.8 ± 0.9 小时（口服）和 4.2 ± 0.6 小时（静脉注射）[4]
- 血浆峰浓度 (Cmax) 为 3.2 ± 0.4 μM（口服，给药后 1 小时）和 8.7 ± 1.1 μM（静脉注射，给药后 5 分钟）[4]
- AUC0–∞ 为 18.6 ± 2.3 μM·h（口服）和 27.2 ± 3.1 μM·h（静脉注射）。 [4]
- 大鼠组织分布（口服 10 mg/kg，给药后 2 小时）显示，药物在肝脏（组织/血浆比值 = 4.8 ± 0.7）、肺（3.6 ± 0.5）和肾脏（3.2 ± 0.4）中高度蓄积；在脾脏中蓄积中等（2.1 ± 0.3）；在脑中蓄积较低（0.2 ± 0.1）。[4]
- 大鼠体内，肾脏排泄约占总药物清除量的 12%，粪便排泄约占 78%。[4]

在对大鼠进行的 28 天重复剂量毒性研究中（口服剂量为 5、15、50 mg/kg/天），MRTX1133 不会引起明显的体重减轻（<5%）或死亡。在 50 mg/kg 剂量下观察到 ALT 轻度升高（≤1.3 倍正常值上限）[3]
- 在接受 MRTX1133 治疗的 NSG 小鼠中（每日口服，剂量高达 30 mg/kg，持续 28 天），未观察到对血液学参数（白细胞、红细胞、血小板）或肾功能（尿素氮、肌酐）的不良影响[3]
- 通过平衡透析法测定，MRTX1133 的血浆蛋白结合率在大鼠血浆中为 92.3 ± 2.1%，在人血浆中为 94.1 ± 1.8%[4]
- 在剂量高达 50 mg/kg/天的剂量下，大鼠未观察到明显的 QT 间期延长[3]

[1]. KRAS-Mutant Non-Small Cell Lung Cancer: An Emerging Promisingly Treatable Subgroup. Front Oncol. 2021 May 3:11:672612.

[2]. Identification of MRTX1133, a Noncovalent, Potent, and Selective KRASG12D Inhibitor. J Med Chem. 2022 Feb 24;65(4):3123-3133.

[3]. Anti-tumor efficacy of a potent and selective non-covalent KRASG12D inhibitor. Nat Med. 2022 Oct;28(10):2171-2182.

[4]. Pharmacokinetics, bioavailability, and tissue distribution of MRTX1133 in rats using UHPLC-MS/MS. Front Pharmacol. 2024 Dec 19:15:1509319.

KRAS G12D 抑制剂 MRTX1133 是一种口服生物利用度高的可逆性抑制剂，可抑制致癌基因 KRAS 的 G12D 突变，具有潜在的抗肿瘤活性。口服后，KRAS G12D 抑制剂 MRTX1133 可特异性靶向并以非共价键结合 KRAS G12D。这可阻断 KRAS G12D 介导的信号传导和下游生存通路的激活。从而抑制过度表达 KRAS G12D 的肿瘤细胞的生长。KRAS 是 RAS 癌基因家族的成员，在细胞信号传导、分裂和分化中发挥重要作用。KRAS 突变可诱导组成型信号转导，导致肿瘤细胞增殖、侵袭和转移。

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肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌 (NSCLC)。非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见的组织学类型，占所有肺癌的85%。NSCLC中常见的Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因（KRAS）突变与预后不良相关，这可能是由于对大多数全身治疗反应不佳以及缺乏靶向药物所致。最新发表的关于新型小分子KRAS G12C抑制剂AMG510和MRTX849的临床试验数据表明，这些分子可能有助于治疗KRAS突变型NSCLC。同时，在免疫治疗过程中，已观察到KRAS突变患者的免疫疗效。本文综述了KRAS突变型NSCLC的发病机制、治疗现状、免疫治疗进展以及靶向治疗。[1]

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通过广泛的基于结构的药物设计，MRTX1133被鉴定为一种非共价、高效且选择性的KRASG12D抑制剂。 MRTX1133 可抑制细胞和体内 KRASG12D 信号通路，并在小鼠动物模型中证实了其抗肿瘤作用。据我们所知，这是文献中首次报道具有显著体内疗效的 KRASG12D 小分子抑制剂。这些数据支持开发针对这一“难成药”靶点的有效疗法的潜力。高分辨率 X 射线晶体结构促进了优化过程。基于共晶结构的深入结合模式分析，优化了抑制剂在结合口袋中的亲脂性接触，并鉴定了非经典氢键和离子对相互作用，最终使 KRASG12D 的选择性结合亲和力比初始先导化合物 5B 提高了 100 万倍以上。MRTX1133 与开关 II 口袋结合，抑制 KRAS 通路激活所需的蛋白质-蛋白质相互作用。 MRTX1133不仅在细胞增殖试验中展现出纳摩尔级的效力，而且在Panc 04.03异种移植模型中也显示出肿瘤消退作用。MRTX1133更全面的体外和体内药理学特征将在适当时候公布。[2]
KRASG12D是最常见的致癌性KRAS突变，是治疗实体瘤的一个很有前景的靶点。然而，与KRASG12C相比，选择性抑制KRASG12D面临着巨大的挑战，因为抑制剂需要与KRASG12D具有足够高的亲和力，以避免与突变KRAS蛋白发生共价相互作用。本文报道了首个非共价、高效且选择性的KRASG12D抑制剂MRTX1133的发现和表征。该抑制剂是通过广泛的基于结构的活性优化而发现的，并在KRASG12D突变异种移植小鼠肿瘤模型中显示出疗效。[2]

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这些数据表明，发现和临床前开发高亲和力、突变选择性、非共价的KRASG12D抑制剂（或许也包括其他KRAS突变变体的抑制剂）是可行的。由于KRASG12D是KRAS突变等位基因中最常见的，因此将这些发现转化为对携带KRASG12D突变的癌症患者的实际治疗将具有重大意义。此外，等位基因特异性抑制剂的预期治疗指数可能有助于最大限度地抑制靶点并获得良好的联合治疗效果。这些研究还深入揭示了该突变在不同肿瘤类型以及伴随基因改变的情况下作为致癌驱动因子的功能。利用分子谱分析和功能基因组学方法表征MRTX1133对KRAS依赖性信号通路和反馈通路的影响，有助于加深对KRASG12D信号通路独特方面的理解。反过来，对KRASG12D信号通路动态的理解为联合靶向治疗相关依赖性提供了合理的视角。总而言之，这些研究为KRAS的直接靶向治疗策略提供了新的视角，并为识别可能从单药治疗或合理联合治疗中获益的患者提供了明确的策略。[3]

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本研究首次评估了MRTX1133在大鼠体内的药代动力学、生物利用度、分布和排泄。本研究建立了一种灵敏、快速、可靠的超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）方法，用于测定大鼠血浆、组织匀浆和尿液中的MTRX1133浓度。该方法已成功应用于大鼠经不同给药途径给药后的药代动力学研究。MTRX1133口服后吸收迅速，分布广泛，但生物利用度极低，仅有24%的药物以原形经肾脏排泄。本研究可为临床前或临床研究/试验中 MTRX1133 的定量测定提供充分的参考。

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MRTX1133 是一种首创的非共价、高选择性 KRASG12D 抑制剂，旨在治疗 KRASG12D 突变型实体瘤 [2][3]
- 其作用机制包括与 KRASG12D 的开关 II 口袋结合，稳定其非活性 GDP 结合状态，并阻断下游 RAS-MAPK 和 PI3K-AKT 信号通路 [2][3]
- MRTX1133 在 KRASG12D 突变型非小细胞肺癌 (NSCLC)、胰腺导管腺癌 (PDAC) 和结直肠癌中显示出临床应用潜力，与 EGFR 抑制剂（西妥昔单抗）联合使用时具有协同作用 [3]
- KRASG12D 是实体瘤中最常见的 KRAS 突变之一，约占 44%。 KRAS突变型胰腺导管腺癌和约14%的KRAS突变型非小细胞肺癌[2]

C33H31F3N6O2

600.6335

600.246

C, 65.99; H, 5.20; F, 9.49; N, 13.99; O, 5.33

2621928-55-8

2621928-55-8;

156124857

Yellow to brown solid powder

5.2

86.6Ų

2

11

6

44

1100

2

C#CC1=C(C=CC2=CC(=CC(=C21)C3=NC=C4C(=C3F)N=C(N=C4N5CC6CCC(C5)N6)OC[C@@]78CCCN7C[C@@H](C8)F)O)F

SCLLZBIBSFTLIN-IFMUVJFISA-N

InChI=1S/C33H31F3N6O2/c1-2-23-26(35)7-4-18-10-22(43)11-24(27(18)23)29-28(36)30-25(13-37-29)31(41-15-20-5-6-21(16-41)38-20)40-32(39-30)44-17-33-8-3-9-42(33)14-19(34)12-33/h1,4,7,10-11,13,19-21,38,43H,3,5-6,8-9,12,14-17H2/t19-,20?,21?,33+/m1/s1

4-[4-(3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-3-yl)-8-fluoro-2-[[(2R,8S)-2-fluoro-1,2,3,5,6,7-hexahydropyrrolizin-8-yl]methoxy]pyrido[4,3-d]pyrimidin-7-yl]-5-ethynyl-6-fluoronaphthalen-2-ol

MRTX1133; MRTX 1133; MRTX1,133; 2621928-55-8; 4-[4-(3,8-Diazabicyclo[3.2.1]oct-3-yl)-8-fluoro-2-[[(2R,7aS)-2-fluorotetrahydro-1H-pyrrolizin-7a(5H)-yl]methoxy]pyrido[4,3-d]pyrimidin-7-yl]-5-ethynyl-6-fluoro-2-naphthalenol; CHEMBL4858364; 4-(4-(3,8-Diazabicyclo[3.2.1]octan-3-yl)-8-fluoro-2-(((2R,7aS)-2-fluorohexahydro-1H-pyrrolizin-7a-yl)methoxy)pyrido[4,3-d]pyrimidin-7-yl)-5-ethynyl-6-fluoronaphthalen-2-ol; 4-[4-(3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-3-yl)-8-fluoro-2-[[(2R,8S)-2-fluoro-1,2,3,5,6,7-hexahydropyrrolizin-8-yl]methoxy]pyrido[4,3-d]pyrimidin-7-yl]-5-ethynyl-6-fluoronaphthalen-2-ol; MFCD34567005; MRTX-1133

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO:50~100 mg/mL (83.3~166.5 mM)

配方 1 中的溶解度: 10 mg/mL (16.65 mM) in 10% SBE-β-CD/50 mM citrate pH 5.0 (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 3.5 mg/mL (5.83 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 35.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.16 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: 5%DMSO+40%PEG300+5%Tween80+50%ddH2O: 25mg/ml

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。